[摘要] 目的 探討熊果酸誘導人急性髓性白血病細胞系（HL-60）細胞凋亡及抑制增殖作用機制是否與PTEN-Akt信號傳導途徑相關。 方法 體外培養(yǎng)HL-60細胞。瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA梯形條帶。Western Blot探討UA對HL-60細胞PTEN、p-Akt蛋白表達的影響。 結果 UA可上調HL-60細胞PTEN蛋白表達和抑制P-Akt蛋白表達并呈時間依賴方式，PPARγ特異性阻斷劑GW9662預孵育可拮抗此作用。 結論 熊果酸抑制HL-60細胞增殖及誘導凋亡與其上調PTEN蛋白表達，抑制抑制Akt磷酸化相關。

[關鍵詞] 人急性髓性白血病；熊果酸；增殖；Akt

[中圖分類號] R733.710；R735.205 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-31-04

Relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid on apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells

YUE Jun

Shaoyang Center for Diseas Control and Prevention， Shaoyang 422000， China

[Abstract] Objective To investigat the relationship between PTEN-Akt pathway and ursolic acid in induction the apoptosis and in inhibiting the proliferation of HL-60 cells. Methods HL-60 cells line were cultured in vitro. To observe the DNA ladder bands by DNA agarosegel electrophoresis. To explore the influence of UA about the PTEN and p - Akt protein of HL-60 cells with western Blot. Results The expression of the PTEN protein to be increased and the expression of the P-Akt protein to be inhibited of the HL-60 cells by UA with time dependent manner. this effect to be blocked by GW9662 of PPARγ pre-incubated. Conclusion The proliferation to be inhibited and the apoptosis to be inducted by Ursolic acid with related by raising the PTEN and inhibiting the p-AKt protein.of the HL-60 cells.

[Key words] Human acute myeloid leukaemia； Ursolic acid； Proliferation； Akt

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸，是許多中草藥的主要有效成分[1-2]。熊果酸作為從天然植物中開發(fā)的抗炎和降血脂藥物，目前在動物實驗中得到很好的驗證。最近，熊果酸的抗腫瘤活性越來越受到關注。有研究證實，熊果酸可誘導多種腫瘤細胞如乳腺癌[3]、卵巢癌肝癌[4]、BEL-7404[5]、肺癌、胃癌BGC823細胞[6]等發(fā)生凋亡。熊果酸還可以抑制人早幼粒白血病細胞增殖[7]，但其作用機制目前還不完全清楚。PTEN具有雙特異性磷酸酶活性，是一種抑癌基因，目前發(fā)現大多實體瘤存在PTEN基因突變，血液系統(tǒng)腫瘤中有不同程度的缺失和低表達，但是突變罕見。PTEN作為PI3K/Akt途徑的反向調控因子，通過抑制P I3K/Akt通路的激活抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡。本研究旨在探討UA誘導HL-60細胞凋亡及抑制增殖作用與PTEN-Akt途徑的相關性。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%小牛血清）在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，實驗取采用對數生長期細胞。

1.2 藥品與試劑

Sigmmma公司提供UA及GW9662；p-Akt、PTEN鼠抗人單抗和兔抗人多抗Sigmmma公司生產；PVDF膜購于Pall公司；DMSO購于Ameresco公司。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA梯形條帶

按說明書步驟用凋亡細胞DNA ladder檢測試劑盒分別提取未處理組、濃度為0.1，1.0，10.0μM的UA及DMSO 10μM處理細胞的DNA，提取10μL DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并攝影DBT-08凝膠圖像。

1.4 Western Blot分析HL-60細胞PTEN、p-Akt蛋白表達的影響

在培養(yǎng)板中接種1mL濃度為2×104/mL的

表3 GW9662對UA上調HL-60細胞PTEN蛋白表達的阻斷作用（，n=3）

參數 濃度（μM）

空白對照 1.0 10.0 1.0+GW9662（10） 10.0+GW9662（10）

PTEN蛋白表達 100 189.000±1.970 219.500±3.666 140.333±2.219 98.900±1.114

t -78.259 -56.458 -31.484 1.711

P 0.000 0.000 0.000 0.162

注：各濃度與空白比較，P<0.05

HL-60細胞，并加入UA10.0μM孵育0，4，8，24h；收集細胞離心，進行蛋白定量測定；用胎牛血清標化對照組，加緩沖液煮沸5min后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜承載轉移蛋白，用PTEN、p-Akt抗體孵育，加入過氧化物酶標記二抗使膠片感光。再用GW9662檢測UA能否通過活化PPARγ影響PTEN、p-Akt蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

各組數據利用SPSS17.0軟件分析，計量資料用（）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DNA凝膠電泳觀察UA誘導HL-60細胞凋亡作用

凝膠電泳探討UA能否導致HL-60細胞的DNA發(fā)生非隨機性剪切。結果證實出現典型“梯形”DNA條帶；表明UA確實能夠誘導人HL-60細胞凋亡。見圖1。

2.2 Western blotting觀察UA對對HL-60細胞PTEN- Akt信號途徑影響

對HL-60細胞采用UA 1.0μM分別孵育0，4，8和24h后，結果表明UA能夠上調HL-60細胞PTEN蛋白表達且呈時間依賴方式，較0h分別上調（176.33±7.83），（206.50±2.49）和（217.33±10.61），差異具有統(tǒng)計學意義（表1）；UA能夠下調HL-60細胞p-Akt蛋白表達，同樣呈時間依賴方式，較0h分別下調（82.800±4.69），（37.16±2.55）和（10.20±1.47），差異具有統(tǒng)計學意義（表2）。用特異性阻斷劑GW9662 10.0μM預孵育30min后，采用UA（1.0μM，10.0μM）分別作用HL-60細胞24h，結果證實UA上調HL-60細胞PTEN蛋白表達作用能被GW9662有效拮抗，差異具有統(tǒng)計學意義（表3）。

3 討論

腫瘤形成是多種因素、多個步驟和多種基因突變的過程，目前已經明確多類化學物質能夠誘發(fā)和促進腫瘤形成，有許多研究證實熊果酸對腫瘤的形成有預防和抑制作用，且抗瘤譜廣、不良反應低[8]；

M A B C D E

圖1 DNA凝膠電泳觀察UA對HL-60細胞凋亡的影響

表1 UA對HL-60細胞PTEN蛋白表達的影響（，n=3）

參數 時段

0h 4h 8h 24h

PTEN蛋白表達 100 176.33±7.831 206.500±2.498 217.333±10.617

t -16.883 -73.844 -19.141

P 0.003 0.000 0.003

注：各時段與0h比較，P<0.05

表2 UA對HL-60細胞p-Akt表達的影響（，n=3）

參數 時段

0h 4h 8h 24h

p-Akt表達 100 82.800±4.690 37.167±2.558 10.200±1.473

t 6.353 42.545 105.586

P 0.003 0.000 0.000

注：各時段與0h比較，P<0.05

許多人正致力于將其作為一種高效低毒的抗腫瘤藥物用于臨床的研究。實驗證實，熊果酸能誘導腫瘤細胞凋亡，顯著抑制某些惡性腫瘤細胞生長。熊果酸能夠作用于HL-60 細胞周期，周期阻滯作用隨著濃度升高明顯加強；熊果酸能夠誘導BEL-7404細胞凋亡，認為與上調caspase-9蛋白和抑制procaspase-3蛋白表達相關；熊果酸還可引起抗凋亡蛋白Mcl21的表達下調，在誘導HL-60細胞凋亡中起著重要的作用，分析認為熊果酸能降低Mcl21蛋白表達，從而促發(fā)Caspase23、Caspase29的降解/活化及PARP的降解，促發(fā)細胞凋亡過程。本人前期實驗[9]證明熊果酸呈濃度依賴性下調Bcl-2蛋白、上調bax蛋白表達，抑制HL-60細胞增殖、誘發(fā)凋亡過程。

PTEN 主要通過抑制PI3K和PKB（又稱Akt）磷酸化，進而影響細胞生長及凋亡過程。目前已經明確許多腫瘤發(fā)生與PI3K/Akt信號轉導相關。胞質中PI3K 一般處在靜息狀態(tài)，相應受體與生長因子結合后，PI3K的p110催化亞基被激活。被激活的p110 催化亞基再磷酸化磷酸肌醇（PI）肌糖環(huán)的D3位點，使底物Ptd Ins（4，5）P2（PIP2）轉化為Ptd Ins（3，4，5）P3（PIP3）。作為第二信使的PIP3激活下游的Akt 蛋白等[10]。AKT 激活是其發(fā)揮促細胞生存、增殖功能的重要前提，活化的Akt能降低凋亡促進因子活性和增加抗凋亡蛋白的活性，Bad蛋白被Akt磷酸化并釋放被其抑制的抗凋亡蛋白Bcl-xL，磷酸化的Bad蛋白通過阻斷細胞色素C的釋放參與抗凋亡過程。如果抑制PI3K/Akt信號轉導途徑，導致明顯下調細胞中Akt磷酸化水平，進而使細胞生長周期的激酶抑制因子P27/kIpI上調，干擾細胞生長信號，增加細胞對凋亡的敏感性。Woenckhaus等[11]的研究提示，在惡性腫瘤中阻斷PI3K活性及其下游靶點Akt，上調催化亞基p110α的PI3KCA 基因， 從而增加卵巢癌細胞系PI3K 活性，促發(fā)卵巢癌細胞凋亡過程。英國學者對I型PI3K抑制劑PI103進行了研究，發(fā)現它能有效抑制PI3K的某些亞型，從而有效抑制卵巢癌細胞的侵襲能力[12]。日本學者也發(fā)現PI3K抑制劑LY29400能促進紫杉醇對卵巢癌細胞的凋亡作用[13]。

Akt通過磷酸化抑制caspase-9的活性抑制凋亡。Akt 抑制劑已經成為實驗研究的熱點，它能拮抗Akt的抗凋亡作用，使癌細胞耐藥性被破壞，從而誘導癌細胞凋亡[14]。Yang等[15]的實驗證實：化療藥物順鉑能誘導卵巢癌細胞凋亡，而Akt 激活可抑制該藥物作用，抑制Akt 活性則該作用恢復，提示Akt可能與卵巢癌順鉑耐藥有密切關系。

PI3K/Akt信號轉導通路是PTEN的主要信號轉導通路，PTEN是Akt通路的抑制因子，目前已經明確，PTEN 基因的缺失及Akt的磷酸化是血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生的重要機制之一[16]。PPARγ是核受體轉錄因子，作為過氧化物酶體增殖體激活受體，能夠使PTEN蛋白的表達上調；而GW9662能夠抑制這種作用。

本實驗用DNA凝膠電泳觀察發(fā)現UA能夠誘導HL-60細胞凋亡。Westernblot分析發(fā)現，熊果酸使HL-60細胞PTEN蛋白在各個時間段表達值不同，時間依賴性呈現逐漸上調趨勢，P-Akt蛋白在各個時間段表達值也不同，時間依賴性呈現逐漸下調趨勢。熊果酸的上調PTEN蛋白作用可被GW9662（10μM）預孵育拮抗，且以上實驗結果差異均具有統(tǒng)計學意義。實驗表明：熊果酸可通過作用HL-60細胞的PTEN-Akt途徑，誘導HL-60細胞凋亡和抑制增殖。

綜上所述，熊果酸誘導HL-60細胞凋亡和抑制增殖作用明顯。它可能通過作用于HL-60細胞PPARγ、上調PTEN、抑制Akt磷酸化，抑制HL-60細胞增殖和誘導凋亡。

[參考文獻]

[1] 于瑞濤，趙曉輝，梅麗娟，等. 圓萼刺參中的蘆丁，熊果酸和齊墩果酸的定性定量分析[J].分析實驗室，2008，27（4）：18-21.

[2] 李坤平，潘天玲，賁永光，等.超聲波強化溶劑提取姜味草中熊果酸和齊墩果酸[J].林產化學與工業(yè)，2009，29（3）：111-114.

[3] 楊曉文，崔明，莫平.熊果酸對MCF-7乳腺癌細胞生長的影響[J].中華實驗外科雜志，2009，26（4）：439-441.

[4] 于麗波，王晶，孫文淵，等.熊果酸對卵巢癌細胞粘附運動和侵襲的影響[J].中國老年醫(yī)學雜志，2010，30（15）：2169-2170.

[5] 王輝，方全華，李海軍.熊果酸誘導人肝癌BEL-7404細胞凋亡的作用及其機制[J].腫瘤基礎與臨床，2010，23（2）：93-95.

[6] 趙曉艷，胡玉娜，康向東，等.熊果酸誘導人胃癌BGC823細胞凋亡及其作用機制初探[J].中國癌癥雜志，2010，20（2）：101-104.

[7] 楊邵華，侯茜，張瓊，等.熊果酸對人早幼粒白血病細胞的增殖抑制、周期阻滯及凋亡誘導作用[J].甘肅科學學報，2011，23（1）：69-71.

[8] 趙小燕，康向東.熊果酸的抑癌作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2010，37（增刊）：315-317.

[9] 岳軍.熊果酸對HL-60細胞株凋亡及bcl-2和bax表達的影響[J].中國醫(yī)藥科學，2013，3（17）：30-32.

[10] Brugge J，Hung MC，Mills GB.A new mutational AKT ivation in the PI3K pathway[J].Cancer Cell，2007，12（2）：104-107.

（下轉第頁）

（上接第頁）

[11] Woenckhaus J，Steger K，Sturm K，et al.Prognostic value of PIK3CA and phosphorylated AKT expression in ovarian cancer[J].Virchows Arch，2007，450（4）：387-395.

[12] Raynaud FI，Eccles S，Clarke PA，et al.Pharmacologic characterization of a potent inhibitor of class I phosphatidylinositide 3 -kinases[J].Cancer Res，2007，67（12）：5840-5850.

[13] Kawaguchi W，Itamochi H，Kigawa J，et al.Simultaneous inhibition of the mitogen-activated protein kinase kinase and phosphatidylinositol 3'-kinase pathways enhances sensitivity to paclitaxel in ovarian carcinoma[J].Cancer Sci，2007，98（12）：2002-2008.

[14] 黃秀蘭，崔國輝.PI3K-Akt 信號通路與腫瘤細胞凋亡關系的研究進展[J].癌癥，2008，27（3）：331-336.

[15] Yang X，Fraser M，Abedini MR，et al.Regulation of apoptosis inducing factor-mediated，cisplatin-induced apoptosis by Akt[J].Br J Cancer，2008，98（4）：803-808.

[16] 成志勇，梁文同，底勝峰.PTEN信號轉導通路與腫瘤的多藥耐藥[J].中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（4）：413-417.

（收稿日期：2015-04-28）