金濤，王曄，戴雪明

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海200080)

甲狀腺髓樣癌(MTC)是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，惡性度較高，早期即能轉(zhuǎn)移至肝臟、肺、骨骼以及縱隔［1～4］。50%～80%MTC 患者在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶［5］。手術(shù)治療是其主要治療手段，但多數(shù)患者手術(shù)后會(huì)復(fù)發(fā)［2］。因此，尋找靶向抑制MTC細(xì)胞增殖的方法成為目前治療MTC的方向。噻可拉林是一種硫代縮酚酸肽雙嵌入劑，對(duì)乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞毒性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G1期停滯［6～8］。2013年 6月～2015年 1月，我們觀察了噻可拉林對(duì)人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞株(MTC-TT細(xì)胞)體外增殖的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 MTC-TT細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS，美國Gibco公司;胰蛋白酶、MTT、DMSO，美國 Sigma公司;細(xì)胞周期檢測試劑盒，美國invitrogen公司。攜帶紅色熒光的pRFP質(zhì)粒由北京金唯智生物科技有限公司構(gòu)建，噻可拉林購自馬爾藥品公司。主要儀器:酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等。

1.2 MTC-TT細(xì)胞培養(yǎng) MTC-TT細(xì)胞培養(yǎng)于含有16%FBS、150 U/mL青霉素、150 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白消化傳代。

1.3 MTC-TT細(xì)胞增殖檢測 采用MTT比色法。取對(duì)數(shù)生長期MTC-TT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種至96 孔板，每孔100 μL。分別給予0、1、2、4、6、8、10、20、30 nmol/L 噻可拉林，每種濃度設(shè) 4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)前4 h，分別加入40 μL MTT，使MTT終濃度為1 mg/mL。結(jié)束培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀492 nm處測定每孔吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD×100%。

1.4 MTC-TT細(xì)胞周期測定 采用流式細(xì)胞儀檢測。取對(duì)數(shù)生長期MTC-TT細(xì)胞，消化后1 200 r/min離心10 min收集細(xì)胞，PBS洗滌去除血清，以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 mL，隨機(jī)分為觀察組、對(duì)照組。觀察組加入10 nmol/L噻可拉林，對(duì)照組加入等量無血清培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h 收集兩組細(xì)胞，1 000 r/min 離心 10 min，PBS 洗滌，300 μL PBS 重懸，然后加入 700 μL預(yù)冷的無水乙醇(終濃度為70%)，4℃冰箱過夜;1 000 r/min 離心 10 min，PBS 洗滌，450 μL PBS 重懸，加入 50 μL RnaseA(2.5 mg/mL)，4 ℃ 孵育 30 min;向每管細(xì)胞中加入50 μL PI(1 mg/mL)，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.5 MTC-TT細(xì)胞形態(tài)觀察 按照 lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明說書進(jìn)行操作。取對(duì)數(shù)生長期MTC-TT細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，G418(終濃度為500 μg/mL)篩選至第14天，即得到穩(wěn)定攜帶紅色熒光蛋白基因的MTC-TT細(xì)胞。取轉(zhuǎn)染pRFP質(zhì)粒的MTC-TT對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，分別給予0、5、10 nmol/L噻可拉林處理48 h，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各濃度不同作用時(shí)間MTC-TT細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 噻可拉林對(duì)MTC-TT細(xì)胞體外增殖的影響

2.2 兩組不同時(shí)間MTC-TT細(xì)胞周期分布比較見表2。

表2 兩組不同時(shí)間MTC-TT細(xì)胞周期分布比較(±s)

表2 兩組不同時(shí)間MTC-TT細(xì)胞周期分布比較(±s)

注:與對(duì)照組同細(xì)胞周期比較，*P＜0.05;與同組其他時(shí)間比較，△P ＜0.05。

組別12 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組G0/G1 期 60.11 ±3.48 60.52 ±3.02 59.79 ±3.59 69.42 ±2.35 S 期 21.61 ±1.46 21.08 ±1.43 22.14 ±1.51 17.68 ±1.19 G2/M 期 18.28 ±1.21 18.40 ±1.27 18.07 ±1.36 12.90 ±1.04觀察組G0/G1 期 69.75±2.83* 71.85±2.94* 81.13±3.27＊△ 72.71±2.81*S 期 12.21 ±1.15* 8.19 ±0.86* 2.07 ±0.21＊△ 10.93 ±0.91 G2/M 期 18.04 ±1.33 19.96 ±1.49 16.80 ±1.28 16.36 ±1.31

2.3 MTC-TT細(xì)胞形態(tài)變化 與加入0 nmol/L噻可拉林比較，加入5、10 nmol/L噻可拉林的MTC-TT細(xì)胞培養(yǎng)48 h，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大量細(xì)胞變形、凋亡，以加入10 nmol/L噻可拉林效果最明顯。

3 討論

MTC是由RET原癌基因突變而引起的一種內(nèi)分泌惡性腫瘤。RET原癌基因定位于人類10號(hào)染色體的長臂，編碼蛋白為酪氨酸蛋白激酶受體超家族成員。該蛋白與細(xì)胞內(nèi)受體和配體結(jié)合后，首先二聚體化，然后啟動(dòng)自身磷酸化和細(xì)胞內(nèi)底物磷酸化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。當(dāng)甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞RET基因突變后，RET構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)，從而增強(qiáng)RET自身磷酸化和細(xì)胞內(nèi)底物磷酸化程度，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞增殖過度而出現(xiàn)癌變［9～12］。因此，尋找抑制MTC-TT細(xì)胞增殖的藥物，是治療MTC的有效途徑之一。

噻可拉林是一種相對(duì)疏水性化合物，在人體內(nèi)血漿半衰期只有4 h，故其在體內(nèi)的作用效果不明顯。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察噻可拉林對(duì)MTC-TT細(xì)胞體外增殖的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度噻可拉林均能抑制MTC-TT細(xì)胞增殖，且濃度為10 nmol/L、作用48 h時(shí)，體外抑制效果最佳;熒光顯微鏡下觀察可見，10 nmol/L噻可拉林能明顯抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L噻可拉林能誘導(dǎo)MTC-TT細(xì)胞G0/G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。因此，噻可拉林有望成為治療MTC的靶向藥物。今后進(jìn)一步研究解決噻可拉林的疏水性，延長其在體內(nèi)的半衰期。

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