劉 芬，劉艷菊，田春漫

（1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院中藥化學教研室，湖北 武漢 430065；2.湖北民族學院中醫(yī)藥學院中藥學教研室，湖北 恩施 445000）

蒼術屬菊科植物常用的有茅蒼術或北蒼術，干燥根莖入藥。性溫，味甘苦，歸肝脾腎三經(jīng)，主要功能為燥濕健脾，臨床常用于治療食欲不振、腹脹和腹泄等消化系統(tǒng)病癥。中醫(yī)傳統(tǒng)理論顯示：脾主運化，為后天之本，氣血化生之本源?，F(xiàn)代研究［1］顯示：消化、吸收、代謝、免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的功能均與脾（胃）有關聯(lián)。占群體5%～10%的亞健康人群常見消化吸收功能低下、免疫機能障礙，表現(xiàn)為反復腹瀉，機體抗病能力低下，而這部分人群多屬脾虛。臨床研究［2］表明：蒼術對脾虛有多種復雜的調(diào)理作用，其機制涉及多個方面?，F(xiàn)代中藥化學、分子生藥學研究［3］顯示：蒼術主要由一系列的倍半萜類成分、聚乙烯炔類成分和糖苷類成分等組成，現(xiàn)已分離和鑒定大約27種成分。目前對蒼術的相關藥理研究較少，尤其對于其干預脾虛證方面的研究尚屬空白，少量的研究主要集中在其揮發(fā)油成分方面。現(xiàn)代藥理研究［4］表明：蒼術揮發(fā)油成分具有抗胃潰瘍、保肝、抗缺氧和抗心律失常等作用，而關于非揮發(fā)性成分方面（如倍半萜苷類）研究很少，國內(nèi)尚未見報道，但是這些成分在某些藥理作用方面可能和揮發(fā)油相當甚至超過揮發(fā)油。本研究通過建立大鼠脾虛模型，首次從胃腸動力及小腸黏膜免疫功能方面對蒼術提取物調(diào)理大鼠脾虛證的相關機制進行研究，闡明蒼術干預脾虛證的機制，為蒼術調(diào)控脾虛提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器 雄性健康SD大鼠60只，體質(zhì)量（200g±20）g，購自同濟醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SKSF（鄂）20130105。制備蒼術提取物：取蒼術飲片500g（武漢市九州通醫(yī)藥有限公司），先清洗干燥和粉碎，然后用80%乙醇浸泡，12h后再用80% 乙醇熱回流提取，共計3次，每2h1次，將3次的提取液合并，通過減壓過濾將乙醇回收，制成濃縮的清膏（500g·L－1），使用時按比例配制成混懸液。多潘立酮片（西安楊森制藥有限公司，批號130408）；針劑專用活性炭（承德赫達活性炭制造有限公司，批號20130412））；碘 ［I125］胃動素（motilin，MTL）、P物質(zhì)（substance P，SP）和生長抑素（somatostatin，SS）放射免疫試劑盒（南京諾爾曼生物技術有限公司，批號分別為100363－201306、100257－201303、100493－201301）；生物素化羊抗大鼠IgG、IgA試劑盒（上海寶曼生物科技有限公司，批號分別為20130104、2130205）；抗 Toll樣受體4（Toll－like receptor 4，TLR4）免疫組織化學試劑盒（批號20121108）和DAB顯色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。GC－1500型γ放射免疫計數(shù)器（安徽中科中佳科學儀器有限公司 ）；DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀（南京市華東電子團體醫(yī)療裝備有限責任公司 ）；UT6062全自動旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機（上海萊比信環(huán)境技術有限公司）；XSP－300型雙目顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；Image－Pro Plus 5.1分析系統(tǒng)、Motic圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯中國有限公司）

1.2 大鼠脾虛模型的制備 大鼠脾虛模型的建立參照曾益宏等［5］創(chuàng)立的破氣苦降加饑飽失常法。每日給大鼠灌服小承氣湯煎劑（大黃、厚樸和枳實按4∶5∶3的比例組方）1次，按生藥60g·kg－1給藥，將小承氣湯煎劑質(zhì)量濃度配成6g·mL－1，大鼠給藥灌胃量為10mL·kg－1，隔日進食1次，每次喂飼常規(guī)量的半量，自由飲水，造模同時記錄大鼠體質(zhì)量、進食量并觀察臨床表現(xiàn)及大便情況。

1.3 動物分組和給藥 大鼠隨機分成正常組，模型組，低、中、高劑量蒼術提取物（5.0、10.0、20.0g·kg－1）組，多潘立酮（5.0mg·kg－1）組，每組10只，除正常組外，其余各組大鼠均按破氣苦降加饑飽失常法進行造模，造模時間為15d，造模結(jié)束后次日開始灌胃給藥，各組大鼠每天灌胃量為2mL，正常組和模型組大鼠則給予2mL生理鹽水，每日1次，連續(xù)用藥10d。

1.4 ELISA法檢測大鼠腸道灌流液中IgA和血清中IgG的水平 最后一次灌胃給藥后，所有大鼠禁食不禁水24h，然后灌胃大鼠腸灌洗液4次，每次2mL，每次間隔15min，按文獻 ［5］方法收集腸灌洗液，第4次灌胃后，立即將0.1mg毛果蕓香堿注射到大鼠皮下，并將大鼠放在鐵質(zhì)篩網(wǎng)上，用含有2mL EDTA的平皿收集大鼠的腸道排泄物，最后沖凈大鼠殘留在篩網(wǎng)上的排泄物并將其回收。然后將排泄物置于離心機中3000g離心10min，收集上清加入12%疊氮鈉與苯甲基磺酸氟（100mmol·L－1）各50μL，低溫靜置15min，再加入7%牛血清白蛋白250μL，－20℃保存，采用ELISA雙抗體夾心法測定腸液中的分泌型IgA表達水平，在酶標包被板上設標準品孔10孔，稀釋后各孔加樣量均為50μL，標準品的稀釋與加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌和顯色、終止，以測定450nm波長處各孔的吸光度（A）值，測定在加終止液15min以內(nèi)進行。根據(jù)標準品的濃度及對應的A值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值通過回歸方程計算出對應的樣品濃度。大鼠血清中IgG水平的ELISA檢測方法同IgA的檢測方法。

1.5 炭末灌胃法檢測大鼠小腸推進比和胃內(nèi)殘留率 用含5%炭末和2%CMC－Na的炭末混懸液2.5mL灌胃大鼠，30min后每只大鼠用1%戊巴比妥鈉1.2mL麻醉，腹主動脈采血法采血6mL，用頸椎脫臼法處死大鼠，剖開腹腔，將幽門至回盲部的腸管一段取出并測量其長度，此即小腸的總長度，然后測出炭末推進長度，即幽門部到炭末前沿的長度，計算出小腸推進率，其公式為：小腸推進率 ＝ 幽門部到炭末前沿的長度／小腸的總長度×100%；然后將大鼠的胃賁門和幽門部兩端分別結(jié)扎并稱取胃的質(zhì)量，將胃體沿胃大彎剪開，將胃內(nèi)殘留物洗凈，濾紙拭干稱質(zhì)量，即胃凈質(zhì)量，用胃全質(zhì)量減去胃凈質(zhì)量即得胃內(nèi)殘留物的質(zhì)量，胃內(nèi)殘留率＝（胃全質(zhì)量－胃凈質(zhì)量）／炭末混懸液灌胃總質(zhì)量×100%。

1.6 放射免疫法檢測大鼠血漿中 MTL、SP和SS水平 采用放射免疫法檢測血漿中 MTL、SP和SS水平，上述檢測步驟均嚴格按試劑盒說明書操作。放射免疫檢測采用γ－免疫計數(shù)器，根據(jù)γ－免疫計數(shù)器預先編制程序，直接給出有關參數(shù)、標準曲線及樣品檢測的濃度。

1.7 免疫組織化學法檢測大鼠各腸段（十二指腸、空腸和回腸）組織中TLR4表達水平 切取長寬均為5mm的各腸段（十二指腸、空腸和回腸）的腸黏膜1塊，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，采用免疫組織化學法進行檢測。所有切片均在高倍顯微鏡下（同一條件）觀察，陽性細胞的判定標準是細胞質(zhì)或胞核被染為棕黃色或棕褐色。每個樣本隨機檢測染色較好的5個高倍視野，采用Image－Pro Plus 5.1分析系統(tǒng)半定量分析，觀察并計算絨毛頂端內(nèi)和腸道橫斷面固有層單位面積上TLR4陽性細胞染色的積分吸光度（IA）值，5個高倍視野中IA值的均數(shù)即為該樣本陽性細胞的IA值。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS l7.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。大鼠血漿中MTL、SP和SS水平以表示，組間比較采用t檢驗；大鼠腸道灌流液中Ig A和血清中IgG水平、小腸推進比、胃內(nèi)殘留率和大鼠各腸段（十二指腸、空腸和回腸）組織中TLR4蛋白表達水平以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腸道灌流液中IgA及血清中IgG水平 與正常組比較，模型組大鼠腸道灌流液中IgA及血清中IgG水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量蒼術提取物組和多潘立酮組大鼠腸道灌流液中Ig A及血清中IgG水平均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與多潘立酮組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠腸道灌流液中Ig A及血清中IgG水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量蒼術提取物組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠腸道灌流液中Ig A及血清中IgG水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠腸道灌流液中Ig A和血清中IgG水平Tab.1 Levels of IgA in intestinal perfusion fluid and IgG in serum of rats in various groups［n＝10，，ρB／（g·L－1）］

表1 各組大鼠腸道灌流液中Ig A和血清中IgG水平Tab.1 Levels of IgA in intestinal perfusion fluid and IgG in serum of rats in various groups［n＝10，，ρB／（g·L－1）］

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0lvs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group IgA IgG 1.05±0.08 5.69±0.86 Model 0.29±0.02＊ 2.02±0.15＊Domperidone 0.40±0.03△ 3.01±0.28△Rhizoma atractylodis extract Low dose 0.44±0.03△3.11±0.26△Medium dose 0.65±0.05△△#▲ 4.15±0.29△△#▲High dose 0.99±0.08△△##▲▲ 5.67±0.78△△##▲▲Normal

2.2 各組大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進比 與正常組比較，模型組大鼠胃內(nèi)殘留率明顯升高（P＜0.01），小腸推進比明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量蒼術提取物組和多潘立酮組大鼠胃內(nèi)殘留率明顯下降、小腸推進比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與多潘立酮組比較，高劑量蒼術提取物組大鼠胃內(nèi)殘留率進一步下降，但兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而小腸推進比則升高（P＜0.05）；與低劑量蒼術提取物組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠胃內(nèi)殘留率明顯下降、小腸推進比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平 與正常組比較，模型組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量蒼術提取物組和多潘立酮組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與多潘立酮組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量蒼術提取物組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表2 各組大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進比Tab.2 Rates of stomach retention and ratios of small intestinal propulsion of rats in various groups（n＝10，，η／%）

表2 各組大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進比Tab.2 Rates of stomach retention and ratios of small intestinal propulsion of rats in various groups（n＝10，，η／%）

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0l vs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group Rate of stomach retention Ratio of small intestinal propulsion Normal 26.2±3.6 74.4±6.8 Model 69.9±8.3＊ 29.8±4.4＊Domperidone 29.1±3.5△△ 62.4±5.7△△Rhizoma atractylodis extract Low dose 52.4±5.4△ 40.2±7.2△Medium dose 39.5±4.4△△▲ 53.8±6.1△△▲High dose 28.1±3.1△△▲▲ 72.7±5.1△△#▲▲

2.4 各組大鼠各腸段（十二指腸、空腸和回腸）組織中TLR4表達水平 TLR4陽性物質(zhì)呈棕黃色，主要分布于黏膜下層和小腸絨毛頂端。各組大鼠十二指腸、空腸和回腸的黏膜下層及絨毛頂端TLR4的表達水平：正常組分別為13.5±1.3、9.8±0.7、19.1±1.9，模型組分別為4.3±0.4、3.1±0.2、7.7±0.6、低劑量蒼術提取物組分別為6.9±0.6、5.1±0.4、11.6±1.0，中劑量蒼術提取物組分別為9.3±0.8、7.0±0.6、14.9±1.3，高劑量蒼術提取物組分別為13.2±1.1、9.6±0.6、18.9±1.7，多潘立酮組分別為6.1±0.6、5.3±0.5、10.2±1.0。與正常組比較，模型組大鼠十二脂腸空腸和回腸組織中TLR4表達水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量蒼術提取物組和多潘立酮組大鼠十二指腸、空腸和回腸的黏膜下層和絨毛頂端的TLR4表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與多潘立酮組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠十二指腸、空腸和回腸的黏膜下層和絨毛頂端的TLR4的表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與低劑量蒼術提取物組比較，中和高劑量蒼術提取物組大鼠十二指腸、空腸和回腸的黏膜下層和絨毛頂端的TLR4的表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠十二指腸組織中TLR4的表達見圖1（插頁二）。

表3 各組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平Tab.3 Levels of MTL，SP，and SS in plasma of rats in various groups［n＝10，，ρB／（ng·L－1）］

表3 各組大鼠血漿中MTL、SP和SS水平Tab.3 Levels of MTL，SP，and SS in plasma of rats in various groups［n＝10，，ρB／（ng·L－1）］

＊P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs domperidone group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.0lvs low dose of Rhizoma atractylodis extract group.

Group MTL SP SS Normal 90.19±9.12 9.39±1.55 70.34±9.12 Model 40.28±5.21＊ 4.21±1.26＊ 39.45±9.01＊Domperidone 71.15±8.25△△ 7.01±1.11△△ 58.15±6.18△△Rhizoma atractylodis extract Low dose 55.14±3.68△5.69±1.37△50.15±4.63△Medium dose 70.25±3.71△△▲ 7.28±1.45△△▲ 60.12±5.01△△▲High dose 88.54±7.34△△#▲▲ 9.01±1.05△△#▲▲ 69.13±8.45△△#▲▲

3 討 論

脾虛證以運動、消化吸收功能障礙作為主要表現(xiàn)，是一種多器官多系統(tǒng)功能障礙的綜合性癥候群。有研究［6］顯示：絕大部分的消化系統(tǒng)疾病以及免疫功能低下性疾病都存在脾虛證的證候，運用補脾運脾法多能奏效。脾胃功能與胃腸運動關系密切［7］。目前，脾虛證模型的造模方法較多，如情志失和法、苦寒瀉下法、過度疲倦法和飲食失節(jié)法［8］等。而在大黃苦寒瀉下基礎上改進的破氣苦降加饑飽失常法是目前運用較普遍的一種造模方法，有研究［9］報道該種造模方法所造成的脾虛證模型癥狀與臨床所見的脾虛證表現(xiàn)非常相似。本研究亦利用此法，用含有大黃藥味的小承氣湯耗傷大鼠脾胃元氣以致脾虛。

有研究［10］表明：脾虛證與胃腸炎癥、胃腸道的神經(jīng)肌肉調(diào)控系統(tǒng)、胃腸激素分泌和胃腸免疫調(diào)節(jié)功能障礙等多種病理生理改變均有關系，其主要臨床表現(xiàn)為胃排空延遲和小腸傳輸功能障礙以及胃腸免疫系統(tǒng)功能嚴重受損。本研究即選取胃排空率和小腸推進比觀察蒼術對脾虛大鼠胃腸功能的影響，實驗中觀察到脾虛模型大鼠胃排空及小腸推進率降低明顯。MTL是一種很重要的胃腸激素，具有促進胃腸運動的作用。SP具有興奮胃腸運動的功能，對幾乎所有的消化道平滑肌都具有刺激其收縮的作用［11］。SS可通過抑制胃腸道激素和乙酰膽堿而起到間接調(diào)整胃腸道運動的作用［12］，三者均能很好地體現(xiàn)胃腸功能的變化。脾虛可使上述胃腸激素表達明顯異常，而使用蒼術提取物干預以后，脾虛證大鼠無論是胃腸動力障礙還是相關胃腸激素的表達均明顯改善，提示蒼術至少可從胃腸道－神經(jīng)肌肉調(diào)控系統(tǒng)及胃腸激素兩個方面來調(diào)節(jié)胃腸功能，改善脾虛證的臨床癥狀，從而有利于胃腸疾病的康復。

有研究［13］表明：脾虛狀態(tài)下，胃腸黏膜極易發(fā)生損害，這可能與脾虛證導致機體全身和局部胃腸黏膜免疫功能低下有關，而脾虛證的好轉(zhuǎn)既體現(xiàn)在胃腸功能的好轉(zhuǎn)，同時也包括胃腸組織結(jié)構(gòu)、激素表達和免疫功能等方面整體好轉(zhuǎn)，而且上述各個方面也相互聯(lián)系和相互影響，彼此不是孤立的。因此，本研究探討蒼術提取物對實驗性脾虛大鼠胃腸功能的影響外，同時還探討了蒼術提取物對脾虛大鼠模型免疫功能的影響情況。中醫(yī)理論認為：脾為后天之本，氣血生化之源，氣之充盈與否與脾的功能息息相關，而氣主防御的功能與現(xiàn)代醫(yī)學中的免疫系統(tǒng)的功能極為相似，與胃腸道黏膜的免疫功能存在著某種內(nèi)在聯(lián)系。研究［14］表明：免疫調(diào)節(jié)機制的紊亂即與脾虛泄瀉的發(fā)生關系密切，小腸免疫在整個消化系統(tǒng)的免疫作用中占有很重要的地位。lgG和IgA是胃腸黏膜執(zhí)行免疫功能的重要分子。臨床研究［15］表明：外科脾虛患者免疫功能常處于低下狀態(tài)，表現(xiàn)在血清中IgA、IgG水平顯著低于正常水平；本研究選取了血清IgG及腸道灌流液中Ig A水平的變化闡明蒼術提取物對胃腸黏膜免疫功能的影響的深層次機制。本研究觀察到各劑量蒼術提取物組大鼠血清中IgG和腸道灌流液中IgA水平高于脾虛證大鼠，說明大鼠處于脾虛證時其體液免疫受到嚴重抑制，而蒼術提取物對胃腸局部黏膜和機體整體的體液免疫能力均有提高。TLRs是表達于腸道黏膜上皮細胞的一種多肽分子，研究［16］表明：其與腸道黏膜天然免疫功能關系非常密切，其中有代表性的是TLR4，其在天然免疫應答中扮演了非常重要的角色，在天然免疫和獲得性免疫之間起到了橋梁作用。因此，在更深層次上，本研究對脾虛大鼠腸道TLR4的表達變化進行的檢測結(jié)果顯示：脾虛可使大鼠小腸黏膜中TLR4的表達水平明顯降低，從而導致脾虛大鼠腸道局部天然免疫功能被抑制，致使其抗御病原侵襲的能力降低，并有可能進一步導致小腸組織結(jié)構(gòu)損傷。同時本研究結(jié)果亦表明：蒼術提取物可提高脾虛大鼠腸道黏膜細胞TLR4的表達，從而提高腸道的局部天然免疫能力，進而有利于脾虛所導致的胃腸道組織結(jié)構(gòu)的損傷及功能紊亂的改善。

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