魏 潔，李開濟(jì)，駱廣玲，魏靜波，李保衛(wèi)，何紅偉，甄永占

（1.衛(wèi)生部北京醫(yī)院 衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山 063000；3.開灤醫(yī)療集團(tuán)林西醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室，北京 100050）

姜黃素是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的酸性多酚類物質(zhì)，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗腫瘤等藥理作用［1－3］，在疾病防治中得到廣泛應(yīng)用。既往多采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型研究其作用。本研究探討姜黃素對(duì)膽管結(jié)扎所致肝纖維化損傷大鼠的保護(hù)作用，初步闡明姜黃素保肝的作用機(jī)制，為姜黃素在膽汁淤積性肝臟損害治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器 Sprague－Dawlay大鼠21只，雄性，體質(zhì)量290～310g，合格證號(hào)：SYXK（冀）2010－0038，購(gòu)自斯備福動(dòng)物中心，在恒溫（22℃）、相對(duì)濕度65%～70%、光照周期12h∶12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。姜黃素（陜西旭煌植物科技有限公司），HE染色試劑盒和Massion染色試劑盒（北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），α－Sma抗體和β－Actin抗體（美國(guó)Sigma公司），Tgf－β1（美國(guó)Epitomics公司），辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（北京中杉金橋公司）?？梢姽獬上裣到y(tǒng)（日本Olympus公司），F(xiàn)AITH－4060全自動(dòng)生化分析儀（中國(guó)南京勞拉電子有限公司），Spectra Max 190酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司），伯樂(lè)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）；Chemilmager 5500凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech公司）。

1.2 大鼠膽管結(jié)扎肝纖維化模型的建立 14只大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h，水合氯醛麻醉，無(wú)菌操作下行上腹正中切口，抬高肝緣，拉開十二指腸，分離總膽管2～3cm，穿刺抽出膽汁證實(shí)。在近十二指腸處和近肝門處用2號(hào)絲線各結(jié)扎2次，從中間剪斷膽總管。動(dòng)物麻醉清醒后，正常進(jìn)食，自由飲水，肌注青霉素，每日1次，共3d，以防感染。手術(shù)后大鼠體質(zhì)量明顯減輕，活動(dòng)、攝食減少，鼠毛無(wú)光澤，皮膚黃染等，說(shuō)明造模成功。

1.3 動(dòng)物分組和處理 將造模成功的14只大鼠分為肝纖維化模型組和姜黃素給藥組，每組7只。未進(jìn)行膽管結(jié)扎的7只大鼠作為假手術(shù)組，造模后2d開始給藥，假手術(shù)組和肝纖維化模型組大鼠分別給予生理鹽水，姜黃素給藥組大鼠給予姜黃素400mg·kg－1，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，每天1次，給藥14d。

1.4 各組大鼠肝功能檢測(cè) 末次給藥后24h（禁食不禁水12h），大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST活性和總膽紅素（total bilirubin，Tbil）水平。處死大鼠取肝臟，肝臟在4℃ 預(yù)冷的生理鹽水中反復(fù)清洗，置于冰上，取肝大葉縱切（每個(gè)肝取的位置大致相同）1～2mm厚肝組織置于10%中性甲醛溶液中固定。剩余肝組織分別切成小塊，置于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱中備用。

1.5 HE和Massion染色檢測(cè)大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué) 10%中性甲醛固定大鼠肝臟組織，經(jīng)乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片（5μm）后分別行HE和Massion染色。顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorbeta1，Tgf－β1）和α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－smooth muscle actin，α－Sma）蛋白表達(dá)水平 凍存的肝臟組織加入新鮮配制的組織裂解液（137mmol·L－1NaCl，20mmol· L－1Tris，pH ＝7.4，1%NP40，20%glycerol，10mmol· L－1PMSF，1mmol·L－1Na3VO4，10mmol· L－1NaF，2.5mg·L－1aprotinin，2.5mg·L－1leupetin，phosphotase inhibitor cocktail），4℃勻漿，冰上裂解15min，離心（4 ℃、12000r·min－1）20min，取上清，BCA法測(cè)Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)水平。等量蛋白（40μg）于10% 十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶37℃封閉1h，分別加入抗α－Sma、抗Tgf－β1及抗β－Actin抗體，4℃孵育過(guò)夜。洗滌10min×4次，用含辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶5000）孵育1h，洗膜15min×4次，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件測(cè)量條帶灰度值，目的條帶與β－actin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平及大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平 與假手術(shù)組比較，肝纖維化模型組和姜黃素給藥組大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平明顯升高（P＜0.05）；與肝纖維化模型組比較，姜黃素給藥組大鼠血清中AST、ALT的活性和Tbil的水平降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué) HE染色：與假手術(shù)組比較，肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞中可見大量膽管增生，姜黃素給藥組大鼠膽管增生明顯減少。所有大鼠肝臟組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)均不明顯；大鼠肝板結(jié)構(gòu)均未見明顯破壞。見圖1（插頁(yè)一）。

表1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平Tab.1 Activities of AST，ALT，and levels of Tbil in serum of rats in various groups （n＝7，）

表1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和Tbil水平Tab.1 Activities of AST，ALT，and levels of Tbil in serum of rats in various groups （n＝7，）

＊P＜0.05compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

）Group AST［λB／（U·L－1）］ALT［λB／（U·L－1）］Tbil［cB／（μmol·L－1eration 102.0±19.2 31.4±6.5 0.1±0.1 Model 985.8±187.4＊218.5±68.7＊159.8±17.6＊Curcumin 656.0±171.9△151.1±72.7＊△140.0±6.4＊］Sham op△

2.3 大鼠肝臟組織膠原沉積 Massion染色：與假手術(shù)組比較，肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞中可見大量膽管增生外，還可見明顯膠原沉積，膠原纖維自中央靜脈及匯管區(qū)向周圍延伸，形成較粗的纖維間隔；姜黃素給藥組大鼠膽管增生明顯減少，還可見膠原沉積明顯改善。見圖2（插頁(yè)一）。

2.4 Western blotting法檢測(cè)大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，肝纖維化模型組大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。與肝纖維化模型組比較，姜黃素給藥組大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3和表2。

圖3 Western blotting法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Tgf－β1and α－Sma proteins in liver tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積，肝纖維化是大多數(shù)慢性肝病共有的病理特征，是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過(guò)程［4］，目前對(duì)肝纖維化的治療尚無(wú)安全有效的藥物，而近年來(lái)中藥及天然產(chǎn)物在肝纖維化治療中的療效日益受到重視［5－7］。其中姜黃素對(duì)肝纖維化的作用及機(jī)制的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［8－12］。本研究采用膽管結(jié)扎方法誘導(dǎo)膽汁淤積性肝纖維化動(dòng)物模型，觀察姜黃素對(duì)膽管結(jié)扎所致肝纖維化損傷的保護(hù)作用，并探討姜黃素保肝的作用機(jī)制。

表2 各組大鼠肝臟組織中Tgf－β和α－Sma蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Tgf－β1andα－Sma proteins in liver tissue of rats in various groups （n＝7，）

表2 各組大鼠肝臟組織中Tgf－β和α－Sma蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of Tgf－β1andα－Sma proteins in liver tissue of rats in various groups （n＝7，）

＊P＜0.05compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

Group α－Sma Tgf－β1 Sham operation 1.0±0.4 1.0±0.3 Model 2.0±0.4＊ 2.8±0.4＊Curcumin 1.0±0.2△ 2.0±0.2△

ALT和AST是反應(yīng)肝細(xì)胞受損的指標(biāo)，ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，肝細(xì)胞受損時(shí)，大量ALT被釋放入血液而活性增高。80%的AST存在于線粒體內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞線粒體大量破壞，血液中AST水平顯著增加。ALT和AST水平升高反映肝細(xì)胞受損，其增高程度越大，病變?cè)絿?yán)重。本研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，膽管結(jié)扎所致的肝纖維化模型大鼠存在明顯肝功能異常（ALT、AST活性增高和Tbil水平升高），應(yīng)用姜黃素治療后大鼠ALT、AST活性和Tbil水平降低。

HE和Massion染色結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞中可見大量膽管增生，膠原沉積明顯；姜黃素給藥組大鼠膽管增生明顯減少，還可見膠原沉積明顯改善。

本研究結(jié)果表明：Tgf－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程起著重要作用［4，13－17］，通過(guò)活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC），促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與沉積而致肝纖維化，是肝纖維化重要的始動(dòng)因子之一，而肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是HSC的活化，活化的HSC具有增殖、收縮、遷移、促進(jìn)炎癥和纖維生產(chǎn)活性，并表達(dá)α－Sma［4］，α－Sma是 HSC 活化的標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示：肝纖維化模型大鼠肝臟組織中Tgf－β1和α－Sma表達(dá)水平明顯增高，表明姜黃素能夠明顯抑制 Tgf－β1和α－Sma表達(dá)。

綜上所述，姜黃素能夠抑制Tgf－β1誘導(dǎo)的HSC合成與分泌ECM，促進(jìn)ECM降解，減少ECM在肝臟中的沉積，進(jìn)而發(fā)揮治療肝纖維化的作用。姜黃素有望成為膽汁淤積性肝纖維化的預(yù)防和治療藥物。

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