董倩 ，徐小潔，紀貝貝，范忠義，梁迎春，王濤，葉棋濃，胡毅

1.解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)一科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

自噬是真核生物細胞內(nèi)特有的一種“自食”的現(xiàn)象。目前普遍認為自噬是一種應激調(diào)控和防御機制，其實質(zhì)是細胞通過胞內(nèi)降解來維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程[1]，即雙層膜包裹部分胞質(zhì)、細胞內(nèi)需要降解的大分子物質(zhì)（如錯誤折疊的蛋白質(zhì)）、細胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體）等形成自噬體，它再與附近的溶酶體融合形成自噬溶酶體，通過水解酶來降解所包裹的內(nèi)容物，產(chǎn)生氨基酸、ATP、核酸、脂肪酸、糖等來維持細胞生存[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)自噬對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療等具有多方面的影響[4]，但其分子機制仍然在不斷探索中。

自噬發(fā)生的重要生物學標志是微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ或LC3B。微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，簡稱LC3）是酵母Atg8 的同源蛋白[5]，可作為自噬發(fā)生的重要檢測標志之一[6]。已證實哺乳動物LC3 有LC3A、LC3B 和LC3C 共3 種亞型，各具有不同的功能[7]，其中LC3B與自噬發(fā)生相關(guān)，常被作為標記物。一般情況下，通過蛋白質(zhì)印跡及免疫熒光等實驗觀察LC3B蛋白水平的變化，可間接判斷自噬是否發(fā)生。在此，我們擬構(gòu)建LC3B 的真核表達載體，同時驗證LC3B的生物活性，為進一步探討細胞自噬奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T、大腸桿菌DH5α、pcDNA3.0載體（本實驗室保存）；HA Beads、HRP 標記的抗HA標簽鼠單克隆抗體（Sigma公司）；VigoFect（威格拉斯生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PCR 試劑（TaKaRa 公司）；PCR 回收試劑盒、質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒（Promega 公司）；DMEM、小牛血清（Gibco公司）；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成。

1.2 人LC3B基因編碼序列的擴增

以人乳腺文庫為模板，根據(jù)文獻報道的LC3編碼序列設(shè)計上游引物（5'-CGGGATCCATGCCGTCGGAGA AGACCTTCA-3'）和下游引物（5'-CGGAATTCTTACAC TGACAATTTCATCC-3'），并在上、下游引物中分別引入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點，按以下條件PCR擴增人LC3B的編碼序列：預變性（95℃，5 min）；變性（95℃，30 s）、退火（56℃，30 s）、延伸（72℃，30 s），30個循環(huán)；延伸（72℃，7 min）。擴增產(chǎn)物于4℃保存，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 HA-LC3B重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

回收擴增產(chǎn)物，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，暴露出帶有粘性的末端，用T4DNA 連接酶于16℃將PCR 回收片段與載體pcDNA3.0-HA 進行連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于選擇性LB 固體培養(yǎng)基（含氨芐西林）上生長，隨機挑克隆，37℃培養(yǎng)，取微量菌液保存，剩余菌液提取質(zhì)粒，并用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物于20 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳，約400 bp 處有條帶者表明目的片段插入成功，構(gòu)建成功的克隆由北京奧科生物公司測序。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按本實驗室方法進行轉(zhuǎn)染。293T 細胞于含1‰雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將其接種于6 cm 皿中，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時以細胞密度達到80%～90%為宜，轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將重組質(zhì)粒（5 μg）與NaCl（200 μL）混合，VigoFect 與NaCl 混合5 min，再將以上2種溶液混勻，室溫靜置15 min，把混合物加到已接種293T 細胞的6 cm 皿中，同時轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0-HA 作為對照組，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h 后更換為正常DMEM 培養(yǎng)液，24 h 后收集細胞，用1×PBS 洗1 次，室溫3000 r/min 離心5 min，吸棄上清，將上樣緩沖液（2×SDS）加入沉淀中，沸水浴15 min，室溫12 000 r/min 離心2 min，上清液經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉（5%）封閉1 h，加入HRP 標記的抗HA 標簽鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化學發(fā)光法顯色3 min，暗室壓片顯影。

1.5 細胞免疫共沉淀實驗

293T 細胞培養(yǎng)于含1‰雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，接種于6 cm 皿，分別將空載體HA+Flag-Atg4B、重組質(zhì)粒HA-LC3B 與Flag-Atg4B共轉(zhuǎn)染其中，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，4～6 h后更換為正常DMEM 培養(yǎng)液，24 h 后收集細胞，用1×PBS洗1次，加入用0.5 mL 1×PBS刮下的細胞，收集入EP 管，4℃、3000 r/min 離心5 min，棄上清，加入0.5 mL 中鹽IP 緩沖液混勻細胞，置冰上30 min，于冰上行超聲波裂解，4℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清與HA Beads 于4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h 以上，4℃、3000 r/min 離心5 min，棄上清，再次用中鹽IP緩沖液漂洗，加入與HA Beads 等量的上樣緩沖液（2×SDS），煮沸15 min，12 000 r/min 離心2 min，上清液經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉（5%）封閉1 h，加入HRP 標記的抗HA 標簽鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化學發(fā)光法顯色3 min，暗室壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 人LC3B編碼序列的克隆

以人乳腺文庫為模板PCR 擴增LC3B 的編碼序列，獲得目的片段約400 bp，與預期相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒HA-LC3B的構(gòu)建與鑒定

用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒HA-LC3B，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖電泳后顯示2 條片段，其中一條約400 bp，而酶切空載體只出現(xiàn)1 條片段，與預期結(jié)果相符（圖2）。重組質(zhì)粒的測序顯示插入片段的DNA序列與人LC3B基因的編碼序列完全一致，從而證明重組質(zhì)粒HA-LC3B構(gòu)建成功（序列略）。

2.3 Western印跡檢測融合蛋白的表達

圖1 目的基因LC3B的PCR擴增

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒HA-LC3B 和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細胞，4～6 h 后更換為正常DMEM 培養(yǎng)液，24 h后提取細胞蛋白，行SDS-PAGE 檢測HA-LC3B蛋白的表達。結(jié)果顯示，對293T 細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HA-LC3B 后，用HA-HRP 抗體，在相對分子質(zhì)量約16×103處可見明顯的特異性條帶，表明重組蛋白HA-LC3B能在293T細胞中正確表達（圖3）。

2.4 細胞免疫共沉淀實驗結(jié)果

據(jù)報道LC3B 可與Atg4B 蛋白相互作用[8]，據(jù)此可檢測HA-LC3B 融合蛋白的生物學活性。細胞免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，在符合Atg4B 蛋白（相對分子質(zhì)量約47 000）的位置顯示特異性條帶（圖4），而HA 空載體蛋白在同一位置無條帶，說明HA-LC3B蛋白與Atg4B 蛋白能特異地相互作用，且其結(jié)構(gòu)及生物學功能并不受HA標簽的影響。

3 討論

上世紀50 年代，de Duve 通過電鏡觀察到自噬體結(jié)構(gòu)[9]。自噬現(xiàn)象對于細胞生長是柄雙刃劍，過多或過少都會影響細胞生長。細胞自噬是一個動態(tài)發(fā)展的過程，由一系列自噬相關(guān)蛋白（Atg 蛋白）介導完成[10]，其中Atg8 泛素樣蛋白修飾過程對自噬體的形成必不可少[11]。LC3 是在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的酵母Atg8 的同源體，分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型位于胞質(zhì)中，為可溶性蛋白，Ⅱ型則位于自噬體膜上。在自噬過程中，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合后形成LC3Ⅱ即LC3B，被聚集招募結(jié)合于自噬體膜上。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，LC3B 在自噬溶酶體內(nèi)將被降解。LC3B 的含量與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)，因此，細胞中LC3B的含量變化可以直接反映自噬的發(fā)生過程[12]。已知人類LC3的3種亞型中LC3B與自噬密切相關(guān)[7]，利用生化技術(shù)如Western 印跡檢測LC3B 水平常作為監(jiān)測自噬水平的有效方法[10,13-14]。同時，在自噬過程中Atg4B的作用也不容忽視[15]。

圖2 重組質(zhì)粒HA-LC3B的BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測融合蛋白HA-LC3B的表達

圖4 細胞免疫共沉淀實驗檢測HA-LC3B和Atg4B的相互作用

綜上，我們構(gòu)建了HA-LC3B 真核表達載體，并證實Atg4B 可與LC3B 相互作用。LC3B 在真核細胞中的成功表達，為今后研究細胞自噬奠定了基礎(chǔ)。

[1]Tooze S A,Yoshimori T.The origin of the autophagosomal membrane[J].Nat Cell Biol,2010,12(9):831-835.

[2]Komatsu M,Ichimura Y.Selective autophagy regulates various cellular functions[J].Genes Cells,2010,15(9):923-933.

[3]Rabinowitz J D,White E.Autophagy and metabolism[J].Science,2010,330(6009):1344-1348.

[4]Choi A M,Ryter S W,Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med,2013,368(19):1845-1846.

[5]Marino G,Niso-Santano M,Baehrecke E H,et al.Self-consumption:the interplay of autophagy and apoptosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(2):81-94.

[6]李玲,徐小潔,葉棋濃.細胞自噬與腫瘤[J].中國生物化學與分子生物學報,2013,11(2):995-1001.

[7]He H,Dang Y,Dai F,et al.Post-translational modifications of three members of the human MAP1LC3 family and detection of a novel type of modification for MAP1LC3B[J].Biol Chem,2003,278(31):29278-29287.

[8]Satoo K,Noda N N,Kumeta H,et al.The structure of Atg4B-LC3 complex reveals the mechanism of LC3 processing and delip-idation during autophagy[J].EMBO J,2009,28(9):1341-1350.

[9]Eskelinen E L,Reggiori F,Baba M,et al.Seeing is believing:the impact of electron microscopy on autophagy research.Autophagy,2011,7(9):935-956.

[10]Barth S,Glick D,Macleod K F.Autophagy:assays and artifacts[J].J Pathol,2010,221(2):117-124.

[11]Sou Y S,Waguri S,Iwata J,et al.The Atg8 conjugation system is indispensable for proper development of autophagic isolation membranes in mice[J].Mol Biol Cell,2008,19(11):4762-4775.

[12]Tanida I,Ueno T,Kominami E.LC3 and autophagy[J].Methods Mol Biol,2008,445:77-88.

[13]Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,et al.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing[J].EMBO J,2000,19(21):5720-5728.

[14]Hansen T E,Johansen T.Following autophagy step by step[J].BMC Biol,2011,9:1-4.

[15]黃蓉,杜楠,葉棋濃,等.人自噬相關(guān)基因LC3B 原核表達載體的構(gòu)建及活性檢測[J].軍事醫(yī)學,2014,11(38):867-870.