梅國(guó)徽 ，麥海星，梁迎春，張柯，郭靖，李玲，董倩，洪甜，徐小潔，葉棋濃，陳立軍

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.附屬醫(yī)院泌尿外科，北京 100071；b.生物工程研究所，北京 100850；c.科技部，北京 100850

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生丙酮酸。PK 有4 種同工酶，即PKL、PKR、PKM1、PKM2，其中PKM2 主要表達(dá)于胚胎及增殖活躍的細(xì)胞中，隨著胚胎的形成，在紅細(xì)胞和肝臟中分別由PKR 和PKL 取代，骨骼肌、心臟和腦組織中則表達(dá)PKM1[1-5]。1972 年，Imamura 發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中PKL異常轉(zhuǎn)變?yōu)镻KM2[3]。隨后的研究表明，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肺癌[9]、腎透明細(xì)胞癌[10]等腫瘤中都伴有PKM2 的高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

我們擬構(gòu)建PKM2 的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其對(duì)腎癌細(xì)胞系Caki-1 生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步研究PKM2與腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T 細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；人透明細(xì)胞癌細(xì)胞Caki-1 由解放軍總醫(yī)院贈(zèng)送；人乳腺文庫(kù)、pXJ-40-myc 載體為本室保存；限制性內(nèi)切酶、PCR試劑、DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自Promega 公司；VigoFect 購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；基因測(cè)序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 myc-PKM2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

以人乳腺文庫(kù)為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PKM2序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGCCCCGGA GGGCGGAGAA-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGT CAATCTCCCATCCGTTGATGTG-3'），PCR 擴(kuò)增人的PKM2編碼序列。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min，31個(gè)循環(huán)后；72℃延長(zhǎng)7 min；最后用膠回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體的大片段；將PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ酶切，形成帶有粘性末端的雙鏈，用T4DNA 連接酶連接入pXJ-40-myc 載體；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR，選取陽性克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定陽性的克隆送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)

用含雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于2塊6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)60%～70%的細(xì)胞密度為宜，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 換液；將4 μL VigoFect 與200 μL NaCl 混合，在其靜置5 min 的過程中，將10 μg 重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液混勻，室溫孵育15 min 后滴入6 cm 皿中，以同種方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc 載體作為對(duì)照；37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4 h 后換液，24 h 后收集細(xì)胞，用1×PBS 溶液清洗1 次，4℃、3000 r/min 離心3 min 后棄上清，加入2 倍細(xì)胞量的RIPA 于冰上裂解30 min，加入等量2×SDS 上樣緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min 離心3 min 后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于常溫封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶2000 稀釋的myc-HRP 鼠單克隆抗體，室溫下輕搖1 h，用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；ECL 顯色反應(yīng)3 min，暗室壓片顯影。

1.4 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

pmyc-PKM2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caki-1 細(xì)胞24 h 后，與轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc 空載體的Caki-1 細(xì)胞同時(shí)以每孔3000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于5 塊96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，分別在第0、1、2、3、4 d 加入100 μL 10%CCK-8后37℃孵育1 h，測(cè)定D450nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、D450nm平均值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 myc-PKM2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以本室保存的人乳腺文庫(kù)為模板，PCR 擴(kuò)增人PKM2 的編碼序列，獲得長(zhǎng)約1500 bp 的DNA 片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的PCR 產(chǎn)物和pXJ-40-myc 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑克隆后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，若獲得與目的條帶1500 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人PKM2 基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2 條長(zhǎng)度分別約為5000 和1500 bp 的條帶，且相應(yīng)的載體經(jīng)酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。DNA 序列測(cè)序結(jié)果表明，插入的DNA 序列與人PKM2 基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western 印跡檢測(cè)myc-PKM2 在293T 細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 PCR擴(kuò)增人PKM2的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒pmyc-PKM2的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

將構(gòu)建的pmyc-PKM2 重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系，24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDSPAGE，Western 印跡檢測(cè)myc-PKM2 的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP 抗體能在相對(duì)分子質(zhì)量約60×103處檢測(cè)到明顯的特異性條帶，而空載體無條帶（圖4）。

2.3 CCK8 法驗(yàn)證myc-PKM2 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)

將pmyc-PKM2真核表達(dá)載體及pXJ-40-myc 載體轉(zhuǎn)染腎癌Caki-1 細(xì)胞，通過CCK8 法進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，myc-PKM2 能促進(jìn)腎癌Caki-1細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖5）。

圖3 重組質(zhì)粒pmyc-PKM2的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)

圖5 PKM2促進(jìn)Caki-1細(xì)胞生長(zhǎng)

3 討論

1924 年Warburg 觀察到，即使在氧氣充足的條件下，腫瘤細(xì)胞依然通過糖酵解途徑獲取能量，而非有氧呼吸，這一現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)或有氧糖酵解，是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的特征之一。近年來的研究表明，PKM2 可能通過激活Warburg 效應(yīng)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[11-14]。

PKM2 是PK 的同工酶之一，由PKM 基因編碼。PKM 基因前體mRNA 經(jīng)由核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1/A2 和多嘧啶序列結(jié)合蛋白（PTB）剪切拼接后可以形成PKM1 和PKM2，其中PKM1 包含外顯子9，PKM2則包含外顯子10[15-16]。PKM2主要在胚胎時(shí)期表達(dá)，在成人組織中多被其他同工酶替代，腫瘤組織中多伴有PKM1 向PKM2 的轉(zhuǎn)變[17-19]。與PKM1不同，PKM2的催化活性受外顯子10編碼的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域調(diào)控，當(dāng)與1，6-二磷酸果糖（FBP）結(jié)合時(shí)，可引起PKM2 二聚體的變構(gòu)、結(jié)合，形成四聚體結(jié)構(gòu)，這種PKM2 四聚體對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）具有較強(qiáng)的親和力和催化能力，可以促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行；在不與FBP 結(jié)合時(shí)，PKM2 以二聚體形式存在，這種二聚體對(duì)PEP的催化能力較弱，從而引起糖酵解中間產(chǎn)物的累積，促進(jìn)生物合成，支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖[20-21]。四聚體/二聚體的比例受一些代謝中間產(chǎn)物如FBP 的調(diào)節(jié)，PKM2 通過這一方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝與生物合成之間的平衡。近年發(fā)現(xiàn)PKM2 還具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞周期進(jìn)程的功能[22-23]。

PKM2 在多種腫瘤組織中過量表達(dá)，且在乳腺癌、結(jié)腸癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、胃腸道腫瘤患者的血清中可觀測(cè)到PKM2 的升高。腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，Brinck通過免疫組化發(fā)現(xiàn)PKM2分布在正常腎臟的遠(yuǎn)曲小管和癌組織中，RT-PCR 顯示癌組織中PK活性升高2～7倍[10]。Wechsel觀察到，成功切除腎細(xì)胞癌后，血清PKM2 可在11 周內(nèi)恢復(fù)到正常水平，而當(dāng)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)，血清PKM2 會(huì)再次升高，提示PKM2與腎癌關(guān)系密切[24]。

綜上所述，我們構(gòu)建的myc-PKM2 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，且能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞系Caki-1 的生長(zhǎng)。這為后續(xù)研究PKM2 在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)，有望為腎癌的診斷和靶向治療提供新的思路。

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