梅國(guó)徽 ,麥海星,梁迎春,張柯,郭靖,李玲,董倩,洪甜,徐小潔,葉棋濃,陳立軍
軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.附屬醫(yī)院泌尿外科,北京 100071;b.生物工程研究所,北京 100850;c.科技部,北京 100850
丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生丙酮酸。PK 有4 種同工酶,即PKL、PKR、PKM1、PKM2,其中PKM2 主要表達(dá)于胚胎及增殖活躍的細(xì)胞中,隨著胚胎的形成,在紅細(xì)胞和肝臟中分別由PKR 和PKL 取代,骨骼肌、心臟和腦組織中則表達(dá)PKM1[1-5]。1972 年,Imamura 發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中PKL異常轉(zhuǎn)變?yōu)镻KM2[3]。隨后的研究表明,在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肺癌[9]、腎透明細(xì)胞癌[10]等腫瘤中都伴有PKM2 的高表達(dá),且與腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
我們擬構(gòu)建PKM2 的真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其對(duì)腎癌細(xì)胞系Caki-1 生長(zhǎng)的影響,為進(jìn)一步研究PKM2與腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
人胚腎293T 細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng);人透明細(xì)胞癌細(xì)胞Caki-1 由解放軍總醫(yī)院贈(zèng)送;人乳腺文庫(kù)、pXJ-40-myc 載體為本室保存;限制性內(nèi)切酶、PCR試劑、DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司;質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自Promega 公司;VigoFect 購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)有限公司;DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司;引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成;基因測(cè)序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。
以人乳腺文庫(kù)為模板,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PKM2序列合成上游引物(5'-CGGGATCCATGCCCCGGA GGGCGGAGAA-3')和下游引物(5'-CCGCTCGAGT CAATCTCCCATCCGTTGATGTG-3'),PCR 擴(kuò)增人的PKM2編碼序列。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min,31個(gè)循環(huán)后;72℃延長(zhǎng)7 min;最后用膠回收PCR產(chǎn)物。
用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體,10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收載體的大片段;將PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ酶切,形成帶有粘性末端的雙鏈,用T4DNA 連接酶連接入pXJ-40-myc 載體;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后,挑選克隆進(jìn)行菌液PCR,選取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切鑒定陽(yáng)性的克隆送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。
用含雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于2塊6 cm皿中,接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)60%~70%的細(xì)胞密度為宜,常規(guī)培養(yǎng)24 h 后行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前1 h 換液;將4 μL VigoFect 與200 μL NaCl 混合,在其靜置5 min 的過(guò)程中,將10 μg 重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合,然后將上述2 種溶液混勻,室溫孵育15 min 后滴入6 cm 皿中,以同種方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc 載體作為對(duì)照;37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染4 h 后換液,24 h 后收集細(xì)胞,用1×PBS 溶液清洗1 次,4℃、3000 r/min 離心3 min 后棄上清,加入2 倍細(xì)胞量的RIPA 于冰上裂解30 min,加入等量2×SDS 上樣緩沖液,煮沸15 min,12 000 r/min 離心3 min 后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上;用5%脫脂奶粉于常溫封閉1 h,加入用5%脫脂奶粉以1∶2000 稀釋的myc-HRP 鼠單克隆抗體,室溫下輕搖1 h,用1×TBST 洗膜3 次,每次5 min;ECL 顯色反應(yīng)3 min,暗室壓片顯影。
pmyc-PKM2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caki-1 細(xì)胞24 h 后,與轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc 空載體的Caki-1 細(xì)胞同時(shí)以每孔3000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于5 塊96 孔板,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,分別在第0、1、2、3、4 d 加入100 μL 10%CCK-8后37℃孵育1 h,測(cè)定D450nm值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、D450nm平均值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。
以本室保存的人乳腺文庫(kù)為模板,PCR 擴(kuò)增人PKM2 的編碼序列,獲得長(zhǎng)約1500 bp 的DNA 片段,與預(yù)期大小一致(圖1)。將BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的PCR 產(chǎn)物和pXJ-40-myc 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),挑克隆后進(jìn)行菌液PCR 鑒定,若獲得與目的條帶1500 bp大小接近(圖2)的克隆,則初步認(rèn)為是帶有人PKM2 基因的陽(yáng)性重組克隆。將所得陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定,可切出2 條長(zhǎng)度分別約為5000 和1500 bp 的條帶,且相應(yīng)的載體經(jīng)酶切只見大片段,符合預(yù)期結(jié)果(圖3)。DNA 序列測(cè)序結(jié)果表明,插入的DNA 序列與人PKM2 基因的編碼序列完全一致(數(shù)據(jù)略)。
圖1 PCR擴(kuò)增人PKM2的編碼序列
圖2 重組質(zhì)粒pmyc-PKM2的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜
將構(gòu)建的pmyc-PKM2 重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系,24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDSPAGE,Western 印跡檢測(cè)myc-PKM2 的表達(dá)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后,用myc-HRP 抗體能在相對(duì)分子質(zhì)量約60×103處檢測(cè)到明顯的特異性條帶,而空載體無(wú)條帶(圖4)。
將pmyc-PKM2真核表達(dá)載體及pXJ-40-myc 載體轉(zhuǎn)染腎癌Caki-1 細(xì)胞,通過(guò)CCK8 法進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,myc-PKM2 能促進(jìn)腎癌Caki-1細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖5)。
圖3 重組質(zhì)粒pmyc-PKM2的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜
圖4 Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)
圖5 PKM2促進(jìn)Caki-1細(xì)胞生長(zhǎng)
1924 年Warburg 觀察到,即使在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞依然通過(guò)糖酵解途徑獲取能量,而非有氧呼吸,這一現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)或有氧糖酵解,是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的特征之一。近年來(lái)的研究表明,PKM2 可能通過(guò)激活Warburg 效應(yīng)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[11-14]。
PKM2 是PK 的同工酶之一,由PKM 基因編碼。PKM 基因前體mRNA 經(jīng)由核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1/A2 和多嘧啶序列結(jié)合蛋白(PTB)剪切拼接后可以形成PKM1 和PKM2,其中PKM1 包含外顯子9,PKM2則包含外顯子10[15-16]。PKM2主要在胚胎時(shí)期表達(dá),在成人組織中多被其他同工酶替代,腫瘤組織中多伴有PKM1 向PKM2 的轉(zhuǎn)變[17-19]。與PKM1不同,PKM2的催化活性受外顯子10編碼的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域調(diào)控,當(dāng)與1,6-二磷酸果糖(FBP)結(jié)合時(shí),可引起PKM2 二聚體的變構(gòu)、結(jié)合,形成四聚體結(jié)構(gòu),這種PKM2 四聚體對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)具有較強(qiáng)的親和力和催化能力,可以促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行;在不與FBP 結(jié)合時(shí),PKM2 以二聚體形式存在,這種二聚體對(duì)PEP的催化能力較弱,從而引起糖酵解中間產(chǎn)物的累積,促進(jìn)生物合成,支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖[20-21]。四聚體/二聚體的比例受一些代謝中間產(chǎn)物如FBP 的調(diào)節(jié),PKM2 通過(guò)這一方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝與生物合成之間的平衡。近年發(fā)現(xiàn)PKM2 還具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞周期進(jìn)程的功能[22-23]。
PKM2 在多種腫瘤組織中過(guò)量表達(dá),且在乳腺癌、結(jié)腸癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、胃腸道腫瘤患者的血清中可觀測(cè)到PKM2 的升高。腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,Brinck通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)PKM2分布在正常腎臟的遠(yuǎn)曲小管和癌組織中,RT-PCR 顯示癌組織中PK活性升高2~7倍[10]。Wechsel觀察到,成功切除腎細(xì)胞癌后,血清PKM2 可在11 周內(nèi)恢復(fù)到正常水平,而當(dāng)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí),血清PKM2 會(huì)再次升高,提示PKM2與腎癌關(guān)系密切[24]。
綜上所述,我們構(gòu)建的myc-PKM2 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中獲得表達(dá),且能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞系Caki-1 的生長(zhǎng)。這為后續(xù)研究PKM2 在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ),有望為腎癌的診斷和靶向治療提供新的思路。
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