張德志

（哈爾濱凱程制藥有限公司·150025）

目前我國已經(jīng)進(jìn)入老齡化高峰期，老年癡呆的患病率也越來越高。老年癡呆給患者本人、家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，是老齡化社會(huì)必須要面對(duì)的一個(gè)重要衛(wèi)生問題[1]，開發(fā)治療老年癡呆的中藥新藥是目前業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn)。地黃健憶丸是在地黃飲子的基礎(chǔ)上加減而成，本實(shí)驗(yàn)在前期藥學(xué)研究的基礎(chǔ)上根據(jù)功能主治，通過該藥對(duì)模型動(dòng)物空間記憶能力、被動(dòng)回避條件反射記憶的影響觀察其改善癡呆后記憶作用，及對(duì)模型動(dòng)物腦組織SOD、MDA影響的藥效研究驗(yàn)證其防治癡呆的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠，清潔級(jí)，體重18～22g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京 )2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

地黃健憶丸，自制具有補(bǔ)腎益精、健腦益智的功效，用于腎虛型癡呆病的健忘失認(rèn)等?？诜蝗?次，一次4～6g。飯后服用，或遵醫(yī)囑。批號(hào)131105

復(fù)方活腦舒膠囊：吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司。功能主治：補(bǔ)氣養(yǎng)血，健腦益智，用于健忘氣血虧虛證，記憶減退，倦怠乏力，頭暈心悸，以及老年性癡呆以上癥狀的改善。用法用量：口服，一次3粒（重癥5粒），一日2次，飯后服；12～15天為一療程。規(guī)格：每粒裝0.25g。批號(hào)130706。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Aβ25-35由美國Singma公司提供，貨號(hào)：A4559、生理鹽水、多聚甲醛、水合氯醛等常規(guī)試劑均為市售。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

腦立體定位儀，型號(hào)：ST51600美國；程控水迷宮，型號(hào)：SMG-2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制；程控避暗箱，型號(hào)：SBA-2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制；半自動(dòng)生化儀，型號(hào)：70VB0370法國。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠水迷宮潛伏期的影響

2.1.1 AD小鼠模型制備[2]小鼠均用戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后固定在腦立體定位儀上，剪開頭頂部皮膚，酒精棉擦拭，暴露出前囟，采用右側(cè)腦室定位，自前囟向后1.8mm，矢狀縫旁開1.5 mm，顱骨表面向下2.5mm處注射3μLAβ25-35 (2μg/μL，無菌生理鹽水配制)，假手術(shù)組用同樣方法注射等體積的無菌生理鹽水。留針2min后拔針，縫合頭皮。上述操作均在無菌條件下進(jìn)行。

2.1.2 動(dòng)物分組和給藥方法 取模型制備成功的小鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后隨機(jī)均分為5組：AD模型組、地黃健憶丸低、中、高劑量組(1.17g/kg、2.34g/kg、4.68g/kg)、復(fù)方活腦舒膠囊陽性對(duì)照組（0.195g/kg）。另取10只同樣方法操作但注射生理鹽水的小鼠作為假手術(shù)組。假手術(shù)組及模型組均給予等體積生理鹽水。各組均給藥20天。

2.1.3 小鼠水迷宮潛伏期測定 給藥第10天，開始手術(shù)造模。術(shù)后第3天進(jìn)行小鼠學(xué)習(xí)訓(xùn)練（訓(xùn)練方法：小鼠由固定位置入水后，觀察其在300s內(nèi)找到出口到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間即潛伏期，若小鼠不能在300s內(nèi)到達(dá)平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員引領(lǐng)其到達(dá)。實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)及測試過程保持室內(nèi)安靜，周圍實(shí)驗(yàn)人員及物體位置固定不變），每天1次，每次300s，連續(xù)2天。術(shù)后第6天測定小鼠學(xué)習(xí)情況，記錄每只鼠的潛伏期，作為小鼠記憶學(xué)習(xí)成績。

2.2 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠避暗箱潛伏期的影響

模型制備、動(dòng)物分組及給藥方法同上。給藥第10天，開始手術(shù)造模。術(shù)后第7天進(jìn)行小鼠避暗箱測試訓(xùn)練。每日1次，連續(xù)2天，每次180s。訓(xùn)練及測試過程保持室內(nèi)安靜，周圍實(shí)驗(yàn)人員及物體位置固定不變。術(shù)后第9天測定小鼠學(xué)習(xí)情況，記錄每只鼠第一次進(jìn)入暗箱時(shí)間即潛伏期及180s內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，作為學(xué)習(xí)記憶成績。

2.3 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠腦組織SOD、MDA含量的影響

腦組織SOD含量測定：做完暗箱實(shí)驗(yàn)和水迷宮各實(shí)驗(yàn)組小鼠斷頭，冰盤上取腦，棄去嗅球和小腦，稱量左側(cè)皮質(zhì)腦組織100 mg左右，用預(yù)冷的生理鹽水制成1%勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，測定方法按照試劑盒說明書。

腦組織MDA含量測定：取材同上，制成10%勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，測定方法按照試劑盒說明書。

2.4統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠水迷宮潛伏期、避暗箱潛伏期的影響

結(jié)果見表1。

表1 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠水迷宮潛伏期、避暗箱潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)的影響（）

表1 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠水迷宮潛伏期、避暗箱潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)的影響（）

與模型組比較，*p＜0.05,**p＜0.01 與假手術(shù)組比較，▲p＜0.05, ▲▲p＜0.01

水迷宮潛伏期（s） 避暗箱錯(cuò)誤次數(shù) 潛伏期（s）假手術(shù)組 10 等體積 86±43.13 2.0±2.79 184.8±99.42模型組 10 等體積 146.3±39.4▲▲ 6.0±2.85▲ 85.3±31.13▲▲高劑量組 10 4.68 85.3±39.51** 3.5±2.38* 133.0±64.06*中劑量組 10 2.34 90±47.99** 4.3±4.52 138.6±65.72*低劑量組 10 1.17 104.3±48.7 4.0±3.21 125.1±55.08陽對(duì)組 10 0.195 81.1±37.94** 2.8±2.99* 142.1±73.89*組別 只數(shù)(n)劑量(g/kg)

由上表可見，與假手術(shù)組比較，模型組避暗箱錯(cuò)誤次數(shù)及潛伏期及水迷宮潛伏期均明顯增高，差異具有顯著性意義（P＜0.05），說明AD模型制備成功；與模型組比較，各給藥組避暗箱錯(cuò)誤次數(shù)均有所降低，高劑量組、陽對(duì)組與模型組比較差異有顯著性意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組避暗箱潛伏期均有所增加，高、中劑量組、陽對(duì)組與模型組比較差異有顯著性意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組水迷宮潛伏期均有所降低，高、中劑量組、陽對(duì)組與模型組比較差異具有極顯著性意義（P＜0.01）。說明地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠被動(dòng)回避條件反射記憶功能及空間記憶功能具有一定改善作用。

3.2 地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠腦組織SOD活性的影響

結(jié)果見表2

表2地黃健憶丸對(duì)AD模型小鼠腦組織MDA 、SOD活性的影響（ ±S）

由上表可見，與假手術(shù)組比較，模型組SOD顯著降低、MDA顯著增高，差異具有顯著性意義（P＜0.05），說明AD模型制備成功；與模型組比較，各給藥組SOD含量均有所升高、MDA含量均有所降低，但高劑量組、陽對(duì)組SOD含量與模型組比較差異有極顯著性意義（P＜0.01），中、低劑量組與模型組比較差異有顯著性意義（P＜0.05）。MDA含量高、中、低劑量組、陽對(duì)組與模型組比較差異有極顯著性意義（P＜0.01）。

4 討論

老年癡呆是一種以高級(jí)認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性病變，主要病理基礎(chǔ)為廣泛的神經(jīng)元丟失、腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT) 和老年斑(SP) 的出現(xiàn)。[3]以淀粉樣蛋白(Aβ) 為核心聚集和沉積而形成 SP 是其重要的發(fā)病機(jī)制，已有的證據(jù)充分表明Aβ在老年癡呆的發(fā)病過程中起到至關(guān)重要的起始及樞紐作用[4],因此本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腦內(nèi)注射Aβ25-35方法制備制備老年癡呆模型。

老年癡呆主要表現(xiàn)為記憶障礙或失語、失用、失認(rèn)、執(zhí)行功能障礙等其中，記憶功能障礙嚴(yán)重影響患者的日常生活、職業(yè)活動(dòng)和社交功能。[5]對(duì)老年癡呆記憶功能的改善將有利于改善此類患者的生活質(zhì)量。老年癡呆屬于中醫(yī)“癡呆”范疇。癡呆作為一種疾病，早在先秦時(shí)期就有類似記載。老年癡呆的發(fā)生雖然與五臟相關(guān)，但與腎的關(guān)系最為密切，腎精虧虛是老年癡呆發(fā)病的根本。[6]地黃健憶丸是在地黃飲子的基礎(chǔ)上加減而成具有補(bǔ)腎益精、健腦益智的功效,地黃健憶丸具有縮短水迷宮潛伏期、延長避暗箱潛伏期及減少錯(cuò)誤次數(shù)的作用；給予該藥后模型動(dòng)物腦組織SOD活力增高、MDA含量降低，本研究證明了地黃健憶丸具有改善癡呆模型腦組織損傷改善其記憶功能的療效。

綜上，在老年癡呆的發(fā)病機(jī)制中Aβ毒性在其發(fā)病中占有重要作用，為此本研究以此發(fā)病機(jī)制的老年癡呆模型為基礎(chǔ)，經(jīng)過研究確證了地黃健憶丸改善模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，且該作用與藥物自身抗氧化作用有相關(guān)性。然而地黃健憶丸為中藥制劑成分復(fù)雜性，其防治老年癡呆的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 雷婷.馬亞娜.探討老年癡呆疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的評(píng)價(jià)方法,現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué) [J].2010（38）18：3491-3493.

[2] 王紅梅，宋彩梅，劉新民等.六味地黃丸對(duì)腎虛型老年癡呆動(dòng)物模型的改善作用,中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志[J].2012（18）5：112-116.

[3] 吳建明，馬娜，張鴻程等.舒肝解郁膠囊對(duì)老年癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志[J].2015（21）1：126-129.

[4] 肖增平,吉愛國. 老年癡呆的發(fā)病機(jī)制及治療的研究進(jìn)展,中國老年學(xué)雜志[J], 2008（28）1：95-97.

[5] 盛樹力.老年性癡呆的治療和護(hù)理[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2000：17.

[6] 胡永年,周嵐.老年癡呆基本病機(jī)的理論探討.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志 [J], 2005（11）11：805-807.