王東偉，陳建華，周 磊

（1.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽 110034；2.遼寧省沈陽市獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽 110031；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

高效液相色譜法測定飼料中己烯雌酚含量的方法學(xué)考察

王東偉1，陳建華2，周 磊3

（1.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽 110034；2.遼寧省沈陽市獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽 110031；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

己烯雌酚是一種人工合成的雌性激素，被禁止添加在畜禽飼料中，人們長期食用這種含有雌激素的畜禽、魚蝦等，可以在人體內(nèi)引起蓄積，引發(fā)一系列的健康問題。應(yīng)用BP028—2002高效液相色譜法可以快速檢測到飼料中己烯雌酚的微量含量。此方法經(jīng)過大量的試驗操作，方法摸索，方案優(yōu)化，具有靈敏度高、檢測時間短、回收率高等優(yōu)點。

高效液相；色譜柱；色譜峰；己烯雌酚；回收率

己烯雌酚（diethylstilbestol，DES）別名乙底酚，是人工合成的非甾體雌激素物質(zhì)，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。小劑量己烯雌酚可刺激垂體前葉促性腺激素，大劑量則抑制垂體前葉促性腺激素和促乳素的分泌，有抵消雄激素并抑制催產(chǎn)素酶而增強催產(chǎn)素的作用。己烯雌酚添加到飼料中主要發(fā)揮提高產(chǎn)崽率或催情作用，人食用含有己烯雌酚的動物制品后造成體內(nèi)激素失調(diào)，從而給健康帶來危害。2002年我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定己烯雌酚禁止在飼料中添加使用，2003年農(nóng)業(yè)部規(guī)定己烯雌酚在可食性動物組織中不得檢出。筆者等采用外標法建立了飼料中己烯雌酚的高效液相色譜法檢測方法，適用于配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中己烯雌酚的測定。

1 材料

1.1 儀器、試劑與藥品

高效液相相色譜儀，日本日立公司。己烯雌酚標準品，含量99.9%，批號SZBA110X，SIGMA-ALORICH公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純。提取液：80%甲醇溶液，水為屈臣氏純凈水。抗壞血酸，乙酸乙酯，三氯甲烷，1 mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱為C18（6.2 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.043mol/L磷酸二氫鈉:甲醇=30:70（用磷酸調(diào)節(jié)pH=5），流動相過0.45 μm有機濾膜。流速1.0 mL/min；進樣體積20 μL；柱溫25℃。

1.3 標準儲備液的配制

準確稱取0.025 g己烯雌酚標準品，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻，配制成1 mg/mL儲備液，密封，-20℃保存。

1.4 標準中間工作液的配制

用移液器取一定量的儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即為50 μg/mL己烯雌酚標準工作液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品前處理

取飼料10 g（準確至0.001 g）和抗壞血酸2 g，置于50 mL離心管中，加乙酸乙酯適量，充分振蕩約1 min，再置于超聲儀中超聲提取2 min，期間用手回搖2次，取出后以4000～5000 r/min離心，傾出上清液，再分別加適量乙酸乙酯提取2次，合并上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，68～72℃減壓蒸發(fā)至干。

將蒸發(fā)的乙酸乙酯提取物用三氯甲烷溶解，分3次定量轉(zhuǎn)移至150 mL的分液漏斗中，加少許抗壞血酸（0.3～0.5 g），用氫氧化鈉10 mL將DES萃取至水相?；匦鹗?0 s，并用三氯甲烷洗滌2～3次，每次20 mL，回旋振蕩10 s，然后用碳酸氫鈉溶液12～15 mL將pH值調(diào)至10.3～10.6，再用30、30、20 mL三氯甲烷萃取3次，將DBS回提至三氯甲烷中，并令三氯甲烷層通過無水碳酸鈉干燥。將干燥過的三氯甲烷溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在55～57℃、減壓蒸發(fā)至干，以適量甲醇溶解后，上樣測定。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準曲線的繪制

分別準確吸取一定量的標準工作液（50 μg/mL），用流動相稀釋成0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的標準溶液，分別進樣20 μL，得到峰面積。以濃度和峰面積分別為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線，采用外標法定量。

2.2 線性關(guān)系考察

準確量取適量標準儲備液，用甲醇稀釋成濃度分別為0.00、0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的對照品溶液，按照“1.2”色譜條件進行高效液相色譜分析。檢測結(jié)果表明，己烯雌酚在0.3～16.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=31355x-186.89，相關(guān)系數(shù)R2=1.00，見圖1。

圖1 己烯雌酚標準曲線

2.3 回收率測定

根據(jù)BP028—2002、農(nóng)業(yè)部193號公告，制定飼料濃度點為20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg（每個濃度設(shè)5個重復(fù)），依次添加的目標化合物分別為（稱樣量為10 g）200、400、800 μg，取適當濃度的儲備液或工作溶液進行添加。測定結(jié)果見表1，回收率和變異系數(shù)表明本方法適用于飼料中己烯雌酚的測定。

表1 飼料中己烯雌酚回收率測定結(jié)果

2.4 空白試驗結(jié)果

按照“1.2”色譜條件分別進樣，進行高效液相色譜分析，所得空白樣品色譜圖、空白試驗色譜圖（不加樣品）、空白樣品加樣圖分別見圖2～4。

圖2 空白樣品HPLC色譜圖

圖3 空白實驗HPLC色譜圖

圖4 空白樣品加標HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗

選擇20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg濃度樣品，按照“1.2”色譜條件進行高效液相色譜分析，每個濃度設(shè)6組重復(fù)，測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，飼料中己烯雌酚在20～80 mg/kg濃度范圍內(nèi)，變異系數(shù)和精密度較好（RSD≤15%）。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.6 定量限、檢測限

按照本標準，檢測限0.25 mg/kg。標準曲線中的最低點0.3 μg/mL，甲醇溶液100 mL，稀釋倍數(shù)100倍，所以測定最低濃度點為0.3 μg/mL×100 mL/10 g=3 μg/g。

3 結(jié)論

該方案根據(jù)是BP028—2002、農(nóng)業(yè)部168號公告而設(shè)計的。檢測結(jié)果表明，該方法的前處理方法操作簡單、快速、準確，回收率、重復(fù)性、檢測限均能滿足飼料中己烯雌酚殘留檢測的要求。

［1］ 吳紅軍，成強，臧素娟，等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚的殘留量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（14）：4447-4448.

［2］ 韓迪，張艷，周建于，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉中5種雌激素殘留［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，35（7）：32-36.

［3］ 郭捷，花錦，王蓉珍，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中3種違禁雌激素［J］.食品工程，2014（4）：48-52.

S816

A

2095-3887（2015）06-0074-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.024

2015-10-09

王東偉（1979-），男，助理研究員，碩士。

周磊（1979-），男，助理研究員，碩士，從事畜牧生產(chǎn)系統(tǒng)管理工作。