李德才,華 駿,周 揚,趙世光,薛正蓮

(安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽蕪湖 241000)

基于添加物調(diào)控提高那西肽發(fā)酵效價

李德才,華 駿,周 揚,趙世光?,薛正蓮

(安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽蕪湖 241000)

研究不同添加物對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵過程的影響,以提升那西肽發(fā)酵效價．以單因素實驗考察7種添加物對那西肽發(fā)酵效價的影響,研究其各自的較優(yōu)添加水平及添加時間;綜合單因素實驗結(jié)果,以那西肽效價為指標(biāo),采用響應(yīng)面法對硫酸錳、硝酸鑭、硝酸鈰的添加濃度進行優(yōu)化．供試添加物均不同程度提升了那西肽發(fā)酵水平,提升效果依次為EDTA＞硫酸錳＞硝酸鈰＞橄欖油＞硝酸鑭＞殼聚糖＞制霉素．分別在發(fā)酵24 h添加9．27μg/L硫酸錳,96 h添加5．15μmol/L硝酸鑭和0．9 mmol/L硝酸鈰,那西肽發(fā)酵效價達到948.08μg/m L,比優(yōu)化前提高了30．97%．基于添加物調(diào)控策略可有效提升那西肽發(fā)酵效價．

活躍鏈霉菌;添加物調(diào)控;那西肽;響應(yīng)面法

那西肽,是由活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosu)產(chǎn)生的含硫肽脂類抗生素[1],對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均具有抑菌活性[2]．那西肽為屬胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物,僅有部分那西肽可通過細胞膜滲透到發(fā)酵液中[3]．活躍鏈霉菌代謝過程中,胞內(nèi)那西肽的大量累積會對其關(guān)鍵合成酶產(chǎn)生反饋抑制或反饋阻遏,因此,正常條件下活躍鏈霉菌無法大量分泌那西肽．

研究表明,采用超聲、微波介入等物理手段均可不同程度改善微生物細胞膜或細胞壁的通透性,可有效減弱微生物代謝過程中產(chǎn)物的反饋抑制作用．發(fā)酵過程中添加特定的化學(xué)物同樣可改善細胞透性,提高發(fā)酵單位．如添加抗生素能夠與霉菌細胞膜中的甾醇相結(jié)合,可改善細胞膜通透性[4];添加脂肪酸則能拮抗脂肪酸的生物合成,導(dǎo)致磷脂合成不足,損傷細胞膜結(jié)構(gòu),增大其透性[5];添加金屬離子[6-8]可引發(fā)化學(xué)沉淀,破壞細胞壁、細胞膜以及細胞間隙的結(jié)構(gòu),增大通透性,利于產(chǎn)物釋放;金屬離子螯合劑則能有效結(jié)合細胞壁中的鈣離子,破壞細胞壁[9]．多項研究表明[10-11],基于添加物調(diào)控策略的發(fā)酵過程控制可不同程度改善微生物細胞膜或細胞壁的通透性,有效減弱微生物代謝過程中產(chǎn)物的反饋抑制作用,提高微生物代謝產(chǎn)物的發(fā)酵單位活產(chǎn)量．

以單因素實驗研究不同添加物及其添加時機對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵過程的影響．采用響應(yīng)面設(shè)計法對添加物濃度進行優(yōu)化,以期為提高那西肽發(fā)酵水平及其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 菌株

活躍鏈霉菌(Streptomyces actuosu),安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院保藏．

1．2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(%):FeSO4·7H2O 0.001、NaCl 0.05、KNO30.1、MgSO4·7H2O 0.05、K2HPO4·3H2O 0.05、豆餅粉0.5、可溶性淀粉2、瓊脂2,p H自然．121℃滅菌20 min．

種子培養(yǎng)基(%):MgSO4·7H2O 0．05、(NH4)2SO40．3、玉米漿2．0、葡萄糖3、豆餅粉2．0、輕質(zhì)碳酸鈣0．5,p H 6．5．115℃滅菌25 min．

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):KNO30．05、(NH4)2SO40．1、NaCl 0．4、黃豆粉4．0、酵母0．2、葡萄糖0．5、淀粉酶(淀粉的0．1%)、淀粉7．0、輕質(zhì)碳酸鈣0．4,p H 7．0．115℃滅菌25 min．

1．3 培養(yǎng)方法

從活化的新鮮斜面切取黃豆大小的菌落接入種子培養(yǎng)基(40 m L/500 m L),260 r/min、28℃培養(yǎng)40 h后,按照200μL/1．5 m L接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基,260 r/min、28℃培養(yǎng)144 h．發(fā)酵培養(yǎng)在24孔微孔板中進行．

1．4 不同添加物對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽效價的影響

選取制霉素、橄欖油、殼聚糖、硝酸鑭、硝酸鈰、EDTA和硫酸錳7種化學(xué)添加物,配置適當(dāng)質(zhì)量濃度的母液,添加物添加梯度質(zhì)量濃度對照如表1所示．按照表1的梯度質(zhì)量濃度于96 h分別添加到發(fā)酵液中,發(fā)酵結(jié)束后,分別測定那西肽效價,考察不同表面活性物質(zhì)及其添加質(zhì)量濃度對那西肽效價的影響．

表1 添加物添加梯度質(zhì)量濃度對照表

1．5 添加時間對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽效價的影響

選取上述添加物,在其最優(yōu)質(zhì)量濃度下,分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h添加至發(fā)酵液中,發(fā)酵結(jié)束后,分別測定那西肽效價．

1．6 添加物添加質(zhì)量濃度響應(yīng)面優(yōu)化

綜合文獻資料及單因子實驗結(jié)果,采用3因素3水平響應(yīng)面法對硫酸錳、硝酸鈰及硝酸鑭添加質(zhì)量濃度進行優(yōu)化．響應(yīng)面設(shè)計因素及水平如表2所示．

表2 響應(yīng)面設(shè)計因素及水平表

1．7 那西肽產(chǎn)量的測定

分光光度計法測定那西肽效價[12-13]:取發(fā)酵液5 m L(含菌絲體)于10 m L離心管中,加入5 m L無水乙醇,搖勻后放入37℃恒溫水浴中保溫45 min,離心,取上清液0．5 m L,于另一10 m L離心管中,加入5 m L硼酸緩沖液和4 m L正丁醇溶液,充分搖勻,于37℃水浴中靜置20 min,取上清液2 m L,加無水乙醇2 m L,搖勻測定OD408nm．當(dāng)OD值≤0．5時,效價＝OD×2×1088;當(dāng)OD值＞0．5時,取發(fā)酵液5 m L,加入無水乙醇10 m L,同上法操作,效價＝OD×3×1088．

2 結(jié)果與討論

2．1 不同添加劑對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵的影響

EDTA、橄欖油、硝酸鈰、硝酸鑭、制霉素、殼聚糖、硫酸錳對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽的影響如圖1～圖7所示．由圖1～圖7可知,活躍鏈霉菌發(fā)酵過程中,不同的化學(xué)添加物均影響那西肽的產(chǎn)量,那西肽效價呈現(xiàn)不同程度的濃度依賴性,且存在最適添加濃度．總體上表現(xiàn)出低濃度促進,高濃度抑制．原因在于:低濃度添加物對細胞膜、細胞壁造成損傷,可增加細胞壁或細胞膜的通透性,有效提高那西肽的滲出,解除活躍鏈霉菌發(fā)酵過程的反饋作用;而添加物濃度過高,可導(dǎo)致細胞損傷過度或死亡,抑制活躍鏈霉菌的生長,反而不利于那西肽的合成．不同添加劑對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵的影響如圖8所示．由圖8可知,各添加物在最適添加劑量下,那西肽合成效價存在顯著差異．不同添加物對那西肽發(fā)酵效價提升效果依次為EDTA＞硫酸錳＞硝酸鈰＞橄欖油＞硝酸鑭＞殼聚糖＞制霉素．

有研究表明,EDTA為金屬離子螯合劑,能結(jié)合細胞壁中的鈣離子[14],而橄欖油也可與金屬離子結(jié)合形成脂肪酸鹽,發(fā)酵過程中同時添加二者及金屬離子后,有可能削弱鑭、鈰金屬離子對那西肽效價的提升作用．綜合考慮添加物多因素優(yōu)化實驗需要,選擇硫酸錳、硝酸鈰和硝酸鑭進行下一步研究．

2．2 添加劑添加時間對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽的影響

為考察化學(xué)添加物的加入時機對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵的影響,分別在0～144 h發(fā)酵周期內(nèi)定時加入各最適濃度的添加物,測定那西肽效價,結(jié)果如圖9所示．由圖9可知,各添加物添加時機的不同會顯著影響那西肽的合成．過早及過遲添加均不利于那西肽合成,存在不同的最適加入時機．硫酸錳、硝酸鑭和硝酸鈰分別在發(fā)酵24 h、96 h和96 h添加為最佳．且那西肽效價達到峰值時,表現(xiàn)出添加物對其合成促進效果依次為硫酸錳＞硝酸鈰＞硝酸鑭．推測原因在于鈰和鑭對活躍鏈霉菌的毒性較大,較早地加入到發(fā)酵液中可能破壞細胞組織,使菌體不能大量的繁殖,導(dǎo)致那西肽在發(fā)酵結(jié)束時產(chǎn)量較低,而錳離子可能參與細胞結(jié)構(gòu)的組成,不僅能增大細胞膜的通透性,同時也參與菌體自身的生長,促進效果較為顯著．

由圖9還可以看出,同一時間點不同添加物對活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽發(fā)酵的效價也存在差異性．表現(xiàn)出在發(fā)酵前期(0～72 h)硫酸錳對那西肽產(chǎn)量的促進作用優(yōu)于硝酸鑭、硝酸鈰,而在后期(72～120 h)其對那西肽產(chǎn)量促進效果則依次為硝酸鈰＞硝酸鑭＞硫酸錳．由此進一步說明不同金屬離子在添加時間上存在差異性,且相對于硝酸鈰和硝酸鑭,硫酸錳則可能具有促進生長代謝和增大細胞膜透性的雙重作用．

2．3 響應(yīng)面實驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,以硝酸鈰(X1)、硝酸鑭(X2)、硫酸錳(X3)為自變量,以那西肽效價(Y)為響應(yīng)值進行響應(yīng)面實驗,實驗結(jié)果如表3所示．

表3 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

根據(jù)表3的實驗結(jié)果,用Design-export軟件對響應(yīng)面實驗進行分析,得到以那西肽效價(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:

響應(yīng)面ANOVA分析如表4所示．由表4可知,模型的Pr＞F＝0．0073,失擬項Pr＞F＝0．169 6,表明該模型回歸性極顯著,失擬不顯著．相關(guān)系數(shù)R2＝0．954 7,表明相關(guān)性較好,校正相關(guān)系數(shù)R2adj＝0．873 0,說明響應(yīng)面87．30%的數(shù)據(jù)變化可以由此模型解釋,模型與實際情況擬合較好,因此可以用此回歸方程代替各組實驗對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測．回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明,方程中X2,X1X1對Y值影響顯著,X2X2對Y值得影響極顯著,表明實驗因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系,二次項對響應(yīng)值也有很大的關(guān)系,交互作用的影響相對較小．這和模型回歸中的線性和平方項顯著相對應(yīng)．

表4 響應(yīng)面ANOVA分析

各因子交互作用的響應(yīng)面3D直觀圖及等高線圖如圖10～圖12所示．由圖10、圖11、圖12可知,在控制單一因素不變的情況下,在一定范圍內(nèi)提高其他兩種添加物濃度,那西肽產(chǎn)量不斷提高,趨勢逐漸平緩后又略有下降．那西肽效價在各因子所選范圍內(nèi)存在極大值．

為進一步確定最佳條件的值,對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零．求解得X1＝0．900 602 mmol/L,X2＝75．147 49μmol/L, X3＝9．269 813μg/L．結(jié)合實驗的實際操作,優(yōu)化條件應(yīng)進行修正,即得硝酸鈰、硝酸鑭、硫酸錳的最優(yōu)添加濃度為0.90 mmol/L、75.15μmol/L、9.27μg/L．在此條件下,那西肽產(chǎn)量的理論最佳值為952.488μg/m L．為了驗證上述條件的可行性,在該條件下發(fā)酵144 h后測定,得到那西肽效價為948.08μg/m L,與理論值相差0．46%．因此,響應(yīng)面法對化學(xué)添加物促進活躍鏈霉菌產(chǎn)那西肽優(yōu)化是可行的,得到的添加物添加條件具有實際應(yīng)用價值．

3 結(jié)論

基于添加物調(diào)控策略,采用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面分析法,考察不同化學(xué)添加物對活躍鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)那西肽的影響,并對優(yōu)選添加物進行優(yōu)化．結(jié)果表明,化學(xué)添加物在一定濃度范圍內(nèi)能夠有效提升細胞結(jié)構(gòu)的通透性,增加那西肽的產(chǎn)量．添加物對那西肽發(fā)酵效價提升效果依次為EDTA＞硫酸錳＞硝酸鈰＞橄欖油＞硝酸鑭＞殼聚糖＞制霉素．響應(yīng)面實驗確定了發(fā)酵過程中分別在24 h、96 h和96 h添加濃度為9．27μg/L、75．15μmol/L、0．90 mmol/L的硫酸錳、硝酸鑭和硝酸鈰,對那西肽合成具有最大提升效果,那西肽效價達到948．08μg/m L,比優(yōu)化前提高了30．97%．

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Improvement of nosiheptide fermentation titer by additives regulation

LI De-cai,HUA Jun,ZHOU Yang,ZHAO Shi-guang?,XUE Zheng-lian
(Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation, Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Effects of different additives on the nosiheptide fermentation by Streptomyces actuosus were studied to enhance its titer．Single factor experimental method was used to study the effects of seven additives on nosiheptide fermentation titer as well as their proper adding time and concentration respectively．Resulting from single factor experiments,concentrations of MnSO4,La(NO3)3and Ce(NO3)3were optimized with response surface method with the nosiheptide titer as the indicator．All tested additives enhanced the level of nosiheptide fermentation in varying degrees with the order of EDTA＞MnSO4＞Ce(NO3)3＞Olive oil＞La(NO3)3＞Chitosan＞Nystatin．when MnSO4(9．27μg/L),La(NO3)3(75．15μmol/L)and Ce(NO3)3(0．9 mmol/L)were added for a period of 24 h,96 h and 96 h respectively,nosiheptide titer reached 948．08μg/m L,30．9%higher than that of initial．Additives regulation strategy effectively enhanced nosiheptide fermentation titer．

streptomyces actuosus;additive regulation;nosiheptide;response surface

TQP27

A

1672-2477(2015)04-0020-06

2015-02-16

安徽省高校自然科學(xué)基金資助項目(KJ2013A048);國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃基金資助項目(201410363070,201410363025)

李德才(1987-),男,安徽蕪湖人,碩士研究生．

趙世光(1977-),男,安徽蕪湖人,副教授,博士．