張銳銳，龔蕾蕾，王珊珊，陳倩倩，顧曉松，李石營

（南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇226001）

在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的microRNA（miRNA）是一類約22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，通過降解靶基因mRNA或者阻礙靶基因的翻譯來下調(diào)靶基因的表達，廣泛參與機體的各種生理及病理過程[1-3]。周圍神經(jīng)因炎癥反應(yīng)、髓鞘崩解，從而產(chǎn)生髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物阻礙軸突向前生長。組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）是一種絲氨酸蛋白酶，能夠把無活性的纖溶酶原激活成有活性的纖維蛋白溶酶（plasmin），是清除這些堆積物的主要蛋白酶[4-6]。我們研究發(fā)現(xiàn)miR-340可抑制施萬細胞的纖溶能力，靶基因預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)tPA是miR-340的潛在靶基因，因此我們構(gòu)建tPA的熒光素酶報告質(zhì)粒，通過雙基因報告系統(tǒng)確定miR-340可直接作用于tPA的3'UTR，從而負性調(diào)控靶基因tPA的表達。

1 材料和方法

1.1 纖溶實驗 用12孔板制作纖維蛋白板，將低熔點瓊脂糖溶于0.01mol/L PBS中，制成1%低熔點瓊脂糖凝膠。每孔包含0.8 mL瓊脂糖溶液、thrombin（0.125 unit）、125 μL fibrinogen （10 mg/mL）、2.5 μL plasminogen（10 u/mL）。無菌條件下，室溫放置1 h完全凝固后，在孔中央挖5 mm的小孔。miR-340模擬物、阻遏物（廣州銳博生物公司）及各自對照轉(zhuǎn)染永生化的施萬細胞RSC96，6 h后移植在纖維蛋白板的小孔中。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，18 h后測量溶圈的寬度。

1.2 tPA 3'UTR的構(gòu)建 大鼠基因組的制備采用基因組提取PCR試劑盒（福際生物公司）。tPA 3'UTR構(gòu)建的上游引物為CGGAATTCCAAAGAAAGCCCAGCTCCT，下游引物為CCCTCGAGTAAGTGTGAAAAATACCTTG。用Pyrobest DNA聚合酶從基因組上擴增出目的條帶，EcoRI-XhoI雙酶切后插入pLUC-UTR報告基因載體（復(fù)旦大學(xué)惠贈），構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pLuc-tPA-3'UTR，測序確定構(gòu)建序列的正確性。

1.3 熒光素酶活性檢測 將miR-340模擬物及對照共轉(zhuǎn)染RSC96細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，冰冷PBS液收細胞，加入100 μL PLB裂解液室溫裂解細胞15 min。取20μL裂解上清加入96孔板，然后加入30 μL LAR II，混勻后立即在熒光/化學(xué)發(fā)光儀上檢測 Firefly熒光素酶活性（F值）。然后每孔再加入15 μL的Stop&Glo溶液檢測 Renilla熒光素酶活性（R值），R值與F值的比值為相對熒光強度，反映報告基因的相對表達水平，實驗設(shè)3次重復(fù)。

1.4 大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型的建立 16只健康成年雄性SD大鼠，體重180～220g，隨機分為2組，用復(fù)合麻醉劑麻醉大鼠，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)中段夾傷坐骨神經(jīng)，方法為用止血鉗壓傷15 s，停3 s，重復(fù)2次。在夾傷后的0 h和7 d處死大鼠，取夾傷段坐骨神經(jīng)用于分析。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測 （RT-PCR）mRNA逆轉(zhuǎn)錄和miRNA逆轉(zhuǎn)錄用MicroRNA Reverse Transcription Kit(Thermo)進行。反應(yīng)體系如下：10 mM dNTPs 2 μL，Reverse Transcriptase 1μL，5×Reverse Transcription Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 20 U/μL 0.25 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物 2μL，RNA sample 1 μg，加DEPC水至20 μL。在PCR儀器上運行，37℃ 60 min，70℃5 min。RT-PCR檢測以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系如下：2×Premix 10 μL，F(xiàn)orward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.4 μL，雙蒸水 7.8 μL。在 ABI StepOne PCR儀上進行，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，45 個循環(huán)。每個反應(yīng)設(shè)置3個復(fù)孔，mRNA檢測用GAPDH作為內(nèi)參，miRNA檢測用U6作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用STATA7.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，組間差異分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-340抑制施萬細胞的纖溶能力 坐骨神經(jīng)損傷后的再生過程中，軸突在生長過程中需要穿過髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物，因此溶解這些障礙物，清除軸突生長的路障，在坐骨神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)過程中具有重要作用。我們在篩選影響施萬細胞纖溶能力的miRNA時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-340模擬物的RSC96細胞組，溶圈明顯比對照組小。而轉(zhuǎn)染miR-340抑制物的RSC96細胞組，溶圈明顯比對照組大（圖1），說明miR-340能夠抑制施萬細胞的纖溶能力。

圖1 miR-340能夠抑制施萬細胞的纖溶能力（*0.01＜P＜0.05）

2.2 miR-340可直接靶向作用于tPA的3'UTR TargetScan和miRanda軟件預(yù)測分析顯示，miR-340可能作用于tPA的3'UTR。我們用熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)來驗證miR-340是否靶向tPA的3'UTR。將miR-340與tPA匹配區(qū)的3'UTR構(gòu)建到p-Luc熒光素酶報告基因的下游，構(gòu)成報告基因質(zhì)粒（圖2A）。構(gòu)建的質(zhì)粒分別與miR-340的模擬物或?qū)φ展餐D(zhuǎn)入RSC96細胞中，與對照組相比，miR-340模擬物可顯著降低相對熒光強度（圖2B）。說明miR-340能直接靶向作用于tPA的3'UTR，從而可以抑制tPA的表達。

圖2 miR-340可直接作用于基因tPA的3'UTR（**P＜0.01）

2.3 大鼠坐骨神經(jīng)再生過程中tPA與miR-340的表達基本呈負相關(guān)性 通過RT-PCR來檢測夾傷段坐骨神經(jīng)中tPA和miR-340的表達變化情況，如圖3所示，與0 h相比，tPA的mRNA表達在7 d顯著增加。而miR-340的表達在7 d顯著降低，表明tPA與miR-340的表達呈負相關(guān)性。

圖3 大鼠坐骨神經(jīng)再生過程中tPA與miR-340表達變化（**P＜0.01）

3 討 論

周圍神經(jīng)損傷后近側(cè)端神經(jīng)發(fā)生創(chuàng)傷性潰變，遠側(cè)端神經(jīng)發(fā)生瓦勒氏變性[7]，產(chǎn)生的髓鞘碎片和膠原纖維等堆積物阻礙軸突向前生長。tPA主要由施萬細胞分泌，是清除這些沉積的髓鞘碎片和膠原纖維的主要蛋白酶。文獻報道tPA在周圍神經(jīng)再生過程中具有重要的調(diào)控作用，神經(jīng)損傷后，tPA的分泌迅速增加[8-9]。而tPA敲除的大鼠感覺和運動功能的恢復(fù)明顯減弱[10]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，具有迅速、精細、可逆等特點。小的分子屬性使它也相對容易通過血--神經(jīng)屏障，因此是一種新的潛在的治療靶點。本研究首次報道m(xù)iR-340可直接靶向tPA的3'UTR，從而通過降低靶基因tPA的表達，抑制施萬細胞的纖溶能力。本研究從轉(zhuǎn)錄后水平解讀了tPA的調(diào)控機制，是miRNA在周圍神經(jīng)再生過程中的調(diào)控作用的良好補充，也為miR-340作為新的治療靶點的研究與開發(fā)提供了科學(xué)前提。

[1]Jinek M，D oudna JA.A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference［J］.Nature，2009，457（7228）：405-412.

[2]Vasudevan S，Tong Y，Steitz JA.Switching from repression to activation:microRNAs can up-regulate translation［J］.Science，2007，318（5858）：1931-1934.

[3]Krol J，Loedige I，F(xiàn)ilipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis，function and decay［J］.Nat Rev Genet，2010，11（9）：597-610.

[4]Chang YM，Shih YT，Chen YS，et al.Schwann cell migration induced by earthworm extract via activation of PAs and MMP2/9 mediated through ERK1/2 and p38 ［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2011 2011；2011：395458.doi：10.1093/ecam/nep131.Epub 2011 Jan 4.

[5]García-Rocha M，Avila J，Armas-Portela R.Tissue-type plasminogen activator（tPA)is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones［J］.Neurosci Lett，1994，180（2）：123-126.

[6]Mack TG，Reiner M，Beirowski B，et al.Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene［J］.Nat Neurosci，2001，4（12）：1199-1206.

[7]Lee SK，Wolfe SW.Peripheral nerve injury and repair［J］.J Am Acad Orthop Surg，2000，8（4):243-252.

[8]Siconolfi LB，Seeds NW.Induction of the plasminogen activator system accompanies peripheral nerve regeneration after sciatic nerve crush［J］.Journal of Neuroscience，2001，21（12）：4336-4347.

[9]Strong AM，Setaluri V，Spiegelman VS.microRNA-340 as a modulator of RAS-RAF-MAPK signaling in melanoma［J］.Arch Biochem Biophys，2014，563（SI）：118-124.

[10]Siconolfi LB，Seeds NW.Mice lacking tPA，uPA，or plasminogen genes showed delayed functional recovery after sciatic nerve crush［J］.J Neurosci，2001，21（12）：4348-4355.