張琳琳, 畢春升, 陳發(fā)明, 金 巖

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室: 1. 牙周科; 2. 組織工程研發(fā)中心, 陜西 西安 710032)

·基礎(chǔ)研究·

同一個(gè)體來(lái)源正常與炎性牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)性能的比較

張琳琳1, 畢春升1, 陳發(fā)明1, 金 巖2

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室: 1. 牙周科; 2. 組織工程研發(fā)中心, 陜西 西安 710032)

目的: 比較同一個(gè)體來(lái)源正常與炎性牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)性能。方法：分別分離培養(yǎng)同一個(gè)體來(lái)源正常牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs)及炎性牙周膜干細(xì)胞(i- hPDLSCs)。流式細(xì)胞儀鑒定兩種干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記；MTT法、克隆形成率檢測(cè)并比較兩者的增殖能力；茜素紅染色及油紅O染色檢測(cè)并比較其分化能力；RT- PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因COL- 1、Runx- 2、BSP- mRNA及成脂相關(guān)基因LPL與PPAR γ mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： i- hPDLSCs及hPDLSCs均具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，i- hPDLSCs增殖能力強(qiáng)于hPDLSCs，但分化能力明顯弱于hPDLSCs(P<0.05); 兩者成脂能力比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：炎癥微環(huán)境對(duì)牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)性能有一定的影響。

牙周膜干細(xì)胞; 炎性牙周膜干細(xì)胞; 增殖; 分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1): 1]

牙周病是一種慢性進(jìn)行性疾病，其最終結(jié)果會(huì)導(dǎo)致牙齒脫落缺失，在我國(guó)牙周病的發(fā)病率高達(dá)90%以上，已成為我國(guó)成年人失牙的首要因素。因此，牙周病的治療越來(lái)越引起廣大學(xué)者的關(guān)注。隨著組織工程及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，牙周組織再生被認(rèn)為是牙周組織缺損治療的更好選擇，而人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cell，hPDLSCs)作為牙周再生的重要種子細(xì)胞也引起了公眾的更多關(guān)注，已經(jīng)證實(shí)hPDLSCs是良好的干細(xì)胞來(lái)源。有學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs在牙周損傷處可形成牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，達(dá)到牙周修復(fù)和再生的目的[1]。近年來(lái)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展將基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用緊密結(jié)合到一起。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)作為一種新的理念，旨在推動(dòng)基礎(chǔ)研究成果快速向臨床轉(zhuǎn)化并應(yīng)用于疾病的診斷、預(yù)防和治療[2]。在此理論基礎(chǔ)上，F(xiàn)eng等[3]將牙周膜祖細(xì)胞(類似hPDLSCs)應(yīng)用于3例患者身上，對(duì)患者進(jìn)行隨訪研究，并在探診深度、牙齦退縮和附著水平3個(gè)方面進(jìn)行了評(píng)估。此研究從臨床試驗(yàn)角度為牙周膜細(xì)胞在人類牙周炎治療中的安全性和有效性提供了有利證據(jù)?，F(xiàn)用于實(shí)驗(yàn)研究的hPDLSCs多取自患者正常第三磨牙或正畸牙，這就限制了hPDLSCs的來(lái)源，給臨床應(yīng)用造成了一定的局限，因此尋求更廣闊的種子細(xì)胞來(lái)源就成為人們進(jìn)一步追求的目標(biāo)。牙周炎最終會(huì)導(dǎo)致牙槽骨吸收，牙齒松動(dòng)脫落，近期Park等[4]從炎癥性牙周組織中提取出hPDLSCs命名為i-hPDLSCs(inflammatory human periodontal ligament stem cells，i- hPDLSCs)，并證實(shí)其保留了成牙骨質(zhì)及成牙周膜的能力，是否可以使用炎癥來(lái)源的牙周膜細(xì)胞來(lái)進(jìn)行牙周再生治療成為近年來(lái)廣大學(xué)者普遍關(guān)注的動(dòng)向。本研究主要比較同一患者來(lái)源正常hPDLSCs及，i- hPDLSCs的生物學(xué)性能，為，i- hPDLSCs的臨床應(yīng)用及牙周病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和設(shè)備

α- MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；L- 谷氨酰胺、青、鏈霉素(Gibco，美國(guó))；I型膠原酶(Sigma，美國(guó))； Dispase(Roche，美國(guó))2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國(guó))；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、吲哚美辛、IBMX、胰島素、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、茜素紅(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站)、油紅O；抗CD31、抗CD45、抗CD90、抗CD105、抗CD146(R&D Systems，美國(guó))；二氧化碳恒溫孵箱(Heraeus，德國(guó))；YJ- 875 型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；離心機(jī)(Kub- ota 2100，日本)；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(ELITE ESO型，BecKman- Coulter,美國(guó))；6孔培養(yǎng)板、平底96孔板(Falcon，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、RT- PCR試劑盒(TaKaRa)、超聲震蕩儀(上海生源器械廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO- TEK, 美國(guó))；紫外分光光度計(jì)(Eppendorf，德國(guó))； Real time PCR儀(Applied biosystems，美國(guó))。

1.2 方法

收集我院牙周病科同一患者因牙周炎導(dǎo)致松動(dòng)的無(wú)保留價(jià)值牙及因阻生新鮮拔除的健康第三磨牙,患者知情同意。

1.2.1 i- hPDLSCs及hPDLSCs的培養(yǎng)

i- hPDLSCs的培養(yǎng)：含雙抗的PBS浸泡10 min,PBS反復(fù)沖洗，銳利刀片刮取根面牙周膜組織，PBS清洗離心,棄上清，加入 3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL的Dispase，以 1 ∶1 比例混合均勻，放入37 ℃ 、50 mL/L CO2孵箱中消化30 min，800 r/min 離心5 min，棄上清,加入5 mL PBS清洗離心,棄除上清。收集組織并滴加少量培養(yǎng)液接種于6孔板中，上置蓋玻片，加入2 mL含100 mL/L胎牛血清的α- MEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d換液并觀察。hPDLSCs的培養(yǎng)：PBS沖洗 3遍，刮取根中1/3 區(qū)的牙周膜組織，并用PBS清洗離心。將收集的組織按上述步驟分離培養(yǎng)。當(dāng)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)到8O%時(shí)各自消化傳代。

1.2.2 有限稀釋法克隆分離hPDLSCs和i- hPDLSCs

hPDLSCs和i- hPDLSCs的克隆分離方法基本相同。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第1代上述細(xì)胞，消化后稀釋為10～15/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔加入0.1 mL，保證每個(gè)孔不多于1個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后在顯微鏡下挑出單個(gè)細(xì)胞孔并標(biāo)記，補(bǔ)加0.1 mL培養(yǎng)基，每隔3 d換液。當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞形成克隆集落并長(zhǎng)至孔底1/2后，胰蛋白酶消化并擴(kuò)大培養(yǎng)，即得到相應(yīng)的hPDLSCs和i- hPDLSCs。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志物

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/mL。用含30 mL/L胎牛血清的PBS清洗后移至EP管中，加入CD146、CD90、CD105、CD31、CD45抗體，置4 ℃ 冰箱中孵育0.5 h，用含30 mL/L FBS的PBS清洗3遍，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)，操作過(guò)程需避光。其中CD146、CD105為FITC標(biāo)記，CD90、CD31、CD45為PE標(biāo)記。比較兩種干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)率。

1.2.4 兩種細(xì)胞克隆形成能力的比較

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代hPDLSCs和i-hPDLSCs，分別制成單細(xì)胞懸液，將1×103個(gè)細(xì)胞接種于90 mm 的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)14 d；棄培養(yǎng)液，PBS浸洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，甲苯胺藍(lán)染色，鏡下觀察，以大于50個(gè)細(xì)胞的集落記為1個(gè)克隆。計(jì)算比較兩種細(xì)胞的克隆形成率(colony forming unit- fibroblastic，CFU- F)。

1.2.5 MTT法比較兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

分別取hPDLSCs和i- hPDLSCs的第3代細(xì)胞消化，重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL，以200 μL 細(xì)胞懸液/孔加入96孔板，即每孔含2×103個(gè)細(xì)胞。共設(shè)8塊96孔板，每板每種細(xì)胞設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每隔3 d換液。次日開(kāi)始檢測(cè)，每天同一時(shí)間點(diǎn)加入5 mg/mL的MTT 20 μL， 4 h后吸去培養(yǎng)液，加150 μL二甲基亞砜，振蕩器低速震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，繪制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線并比較。

1.2.6 兩種細(xì)胞成骨分化能力的比較

分別取第3代的hPDLSCs和i-hPDLSCs，制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為5×104/mL，接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70% 時(shí)，換成骨誘導(dǎo)液(含 5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、100 mL/L FBS的α-MEM 培養(yǎng)液)培養(yǎng)，每2～3 d換液，培養(yǎng)至第10、30天時(shí)分別進(jìn)行如下檢測(cè)。

1.2.6.1 成骨基因檢測(cè)

培養(yǎng)至第10天時(shí)分別收集兩種細(xì)胞，采用TRIzol一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)對(duì)樣本RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定，A260/280為1.8～2.0 可用于實(shí)驗(yàn)。采用PrimeScriptTMRT- PCR Kit(Perfect Real Time)(Takara 公司)試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板， GAPDH作為內(nèi)參，Real- time PCR定量分析各成骨相關(guān)基因BSP、RUNX- 2、Col- 1的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件以及各操作步驟均嚴(yán)格按照RT- PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行特異性擴(kuò)增; 所用引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real- Time PCR各引物序列

1．2．6．2 茜素紅染色

培養(yǎng)至30 d時(shí)，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗后40 g/L多聚甲醛固定，茜素紅染色，鏡下觀察并拍照。然后再于每孔加入1%氯化十六烷基吡啶1 mL，待礦化結(jié)節(jié)溶解后，每孔取200 μL溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)590 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的定量分析。

1．2．7 兩種細(xì)胞成脂分化能力的比較

分別取第3代的hPDLSCs和i- hPDLSCs，制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整密度為5×104/mL，接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)換成脂誘導(dǎo)液(含1 μmol/L 地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，10 μg/mL 胰島素，100 mmol/L 吲哚美辛，100 mL/L FBS的α- MEM培養(yǎng)液)。每2～3 d換液，培養(yǎng)至第10天及21 d時(shí)分別進(jìn)行如下檢測(cè)：

1．2．7．1 成脂基因檢測(cè)

培養(yǎng)至第14天時(shí)分別收集兩組細(xì)胞，采用1.2.6.1 的方法檢測(cè)成脂相關(guān)基因LPL和PPAR γ的表達(dá)水平。所用引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表2。

表2 Real- time PCR各引物序列

1．2．7．2 油紅O染色

培養(yǎng)至21 d時(shí)鏡下觀察可見(jiàn)脂滴形成，棄培養(yǎng)液后PBS浸洗，40 g/L多聚甲醛固定，油紅O染色，鏡下觀察并照相。將異丙醇溶液加入6孔板中，待脂滴溶解后，測(cè)540 nm處吸光度值，比較兩種細(xì)胞的脂滴形成量。

1．2．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞的原代培養(yǎng)

經(jīng)酶消化法分離得到的i- hPDLSCs培養(yǎng)7 d左右，有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，梭形及多角形細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)，胞體豐滿，胞漿均勻，細(xì)胞核圓，核仁清晰；14 d 左右細(xì)胞生長(zhǎng)為80%左右，胰酶消化傳代。正常組織來(lái)源hPDLSCs經(jīng)相同方法培養(yǎng) 10 d 左右有細(xì)胞爬出，細(xì)胞多為梭形細(xì)胞，有突起，細(xì)胞核居中，2～3周達(dá)到80%匯合(圖1)。

2.2 兩種干細(xì)胞表面抗原比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種干細(xì)胞表面標(biāo)記物，表達(dá)基本一致。陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記CD146、CD105、CD90；陰性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性表

面標(biāo)記CD31及造血系干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記CD45。PDLSCs檢測(cè)表面標(biāo)記物表達(dá)如下: CD146為12.5%、 CD105為90.6%、 CD90為99.9%、CD45為0.7%、 CD31為1.1%。i- PDLSCs檢測(cè)表面標(biāo)記物表達(dá)如下：CD146為56.8%、CD105為92.4%、CD90為99.9%、CD45為0.2%、CD31為0.4%(圖2)。

hPDLSCs i- hPDLSCs

圖1 兩種細(xì)胞原代培養(yǎng)12 d(倒置相差顯微鏡，×40)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.3 兩種干細(xì)胞克隆形成能力比較

分別將1×103個(gè)i- hPDLSCs和hPDLSCs接種于90 mm 的培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)， 4 d時(shí)可以觀察到i- hPDLSCs有細(xì)胞集落形成，7 d時(shí)可以觀察到hPDLSCs有細(xì)胞集落形成。鏡下觀察細(xì)胞集落呈漩渦狀生長(zhǎng)，排列緊密，細(xì)胞密度隨時(shí)間增長(zhǎng)。培養(yǎng)14 d，甲苯胺藍(lán)染色后計(jì)算克隆形成率。 i- hPDLSCs克隆形成率約為 (33.02±1.8)%，高于hPDLSCs( 19.28±1.4 )%，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖3)。

hPDLSCs i- hPDLSCs

圖3 兩種細(xì)胞培養(yǎng)14 d時(shí)形成的單細(xì)胞克隆

(倒置相差顯微鏡，×40)

2.4 兩種干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：兩種干細(xì)胞在1～2 d時(shí)均處于“潛伏期”，從第3天開(kāi)始，進(jìn)入“對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期”，自第7天以后，兩種干細(xì)胞逐漸進(jìn)入“平臺(tái)期”。對(duì)第1、4、7天兩種細(xì)胞的吸光度值進(jìn)行比較，第1天，初始兩種細(xì)胞接種數(shù)一致(P>0.05)。第4、7天i- hPDLSCs的增殖能力明顯快于hPDLSCs(P<0.05)(圖4)。

2.5 兩種干細(xì)胞成骨能力比較

PDLSCs 成骨誘導(dǎo)10 d左右，細(xì)胞開(kāi)始呈復(fù)層

生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形；誘導(dǎo)21 d，鏡下可見(jiàn)復(fù)層生長(zhǎng)細(xì)胞出現(xiàn)褐色圓形結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)逐漸增大。i- hPDLSCs成骨誘導(dǎo)8 d左右，細(xì)胞開(kāi)始復(fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度逐漸增大，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；誘導(dǎo)24 d，鏡下可見(jiàn)復(fù)層生長(zhǎng)細(xì)胞中出現(xiàn)少量褐色圓形結(jié)節(jié)。誘導(dǎo)30 d后，茜素紅染色顯示，hPDLSCs礦化結(jié)節(jié)面積及數(shù)量均明顯高于i- hPDLSCs。氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化結(jié)節(jié)，酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm處吸光度值，定量結(jié)果顯示hPDLSCs成骨能力明顯強(qiáng)于i- hPDLSCs(P<0.05)(圖5)。

圖4 兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(2種細(xì)胞4、7 d相比P<0.05)

hPDLSCs i- hPDLSCs

圖5 兩種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)30 d (*與hPDLSCs組相比P<0.05)

兩種干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)10 d，收集樣本，Real- time PCR 檢測(cè)成骨相關(guān)Runx- 2基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示hPDLSCs中BSP、Runx2及Col- 1 mRNA的表達(dá)明顯高于i- hPDLSCs組(P<0.05)(圖6)。

2.6 兩種干細(xì)胞成脂能力比較

兩種細(xì)胞誘導(dǎo)10 d左右，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)較培養(yǎng)初期飽滿，出現(xiàn)小脂肪滴，隨著培養(yǎng)繼續(xù)，脂肪滴逐漸增大并連接成片。培養(yǎng)21 d行油紅O染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)兩者均有脂肪滴形成，并且hPDLSCs組脂肪滴形成面積較i- hPDLSCs組大。異丙醇溶解后比較兩種細(xì)胞脂肪滴形成量，結(jié)果顯示

兩組細(xì)胞的成脂分化能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖7)。

(*與hPDLSCs組相比P<0.05)

hPDLSCs i- hPDLSCs

圖7 兩種細(xì)胞成脂誘導(dǎo)21 d(倒置相差顯微鏡，×200)

兩種細(xì)胞成脂誘導(dǎo)14 d時(shí)，收集樣本，Real-time PCR 檢測(cè)成脂相關(guān)基因LPL及PPAR γ mRNA表達(dá)水平，成脂相關(guān)基因在hPDLSCs中的表達(dá)高于i- hPDLSCs，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖8)。

圖8 兩種細(xì)胞成脂相關(guān)基因的表達(dá)水平比較

3 討論

牙周病是一類常見(jiàn)的口腔疾病，其主要原因是細(xì)菌侵犯牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)等牙周支持組織，如未及時(shí)治療，最終將導(dǎo)致牙齒松動(dòng)甚至脫落[5]。現(xiàn)階段牙周病的治療方法主要有潔治術(shù)、翻瓣術(shù)以及引導(dǎo)性組織再生術(shù)等。近年來(lái)，再生醫(yī)學(xué)與組織工程技術(shù)的研究取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，給牙周再生帶來(lái)新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，牙周組織再生技術(shù)的發(fā)展也進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)期。組織工程需要具備三大要素：種子細(xì)胞、支架材料及信號(hào)分子。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞是組織工程理想的種子細(xì)胞,現(xiàn)已在機(jī)體許多成熟組織器官中發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞。目前常用的牙周組織工程種子細(xì)胞主要包括牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells, PDLCs) 、骨髓基質(zhì)細(xì)胞( bone marrow stromal cells, BMSCs)和脂肪基質(zhì)細(xì)胞( adipose tissue derived stromal cells, ADSCs) 。其中對(duì)牙周膜細(xì)胞的研究目前較為深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明PDLCs具有良好的牙周組織再生潛能[6]。施松濤等[7]在人牙周組織中發(fā)現(xiàn)了PDLSCs ,并發(fā)現(xiàn)其在一定條件下可以分化形成成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞,但PDLSCs數(shù)量有限,較難用于大面積缺損的修復(fù)。而且現(xiàn)在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中常用的PDLSCs多為患者因阻生而拔除的第三磨牙或正畸牙，這就限制了其來(lái)源,并且由于此種方法取材有創(chuàng)，不易被患者接受。因此尋求來(lái)源廣泛、易獲得的干細(xì)胞成為牙周再生的首要問(wèn)題。近期Park等[4]從炎癥性牙周組織中提取出hPDLSCs，并證實(shí)其保留了成牙骨質(zhì)及成牙周膜的能力。該i- hPDLSCs是否可以用來(lái)進(jìn)行牙周再生治療成為廣大學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。陸續(xù)有學(xué)者將其與正常組織來(lái)源hPDLSCs進(jìn)行了比較[8]，然而,Zhang等[9]發(fā)現(xiàn), hPDLSCs擴(kuò)增、遷移及分化能力均隨年齡增長(zhǎng)而降低。為盡可能地降低各種影響因素，本實(shí)驗(yàn)提取同一患者PDLSCs與i- hPDLSCs分別進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，并對(duì)兩者的生物學(xué)性能進(jìn)行了比較。

口腔本身是一個(gè)污染的環(huán)境，取材很容易受到污染，炎性組織中混有細(xì)菌等污染源，增加了細(xì)胞分離的難度；另外患者本身的個(gè)體差異也會(huì)對(duì)細(xì)胞的成功分離造成影響。我們?cè)谌〔那皩?duì)患牙進(jìn)行潔治，盡量去除牙石等污染源；實(shí)驗(yàn)中用含雙抗的PBS對(duì)所取組織進(jìn)行反復(fù)沖洗，盡量降低細(xì)菌等污染源的影響。本實(shí)驗(yàn)共取材11例，其中i- hPDLSCs培養(yǎng)成功7例，hPDLSCs培養(yǎng)成功10例，共同培養(yǎng)成功5例。將成功培養(yǎng)的同一患者來(lái)源i- hPDLSCs 和hPDLSCs進(jìn)行了增殖及分化能力的比較，發(fā)現(xiàn)i- hPDLSCs具有較強(qiáng)的增殖能力，但其分化能力不及hPDLSCs，可能是由于炎癥微環(huán)境的刺激引起細(xì)胞發(fā)生了相應(yīng)的改變。兩種干細(xì)胞對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD146、CD105、CD90均呈陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)造血系標(biāo)志物CD45及內(nèi)皮系標(biāo)志物CD31均不表達(dá)，表明兩種干細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性標(biāo)志物的表達(dá)率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)體外克隆形成率的比較，i- hPDLSCs的克隆形成能力要高于hPDLSCs，說(shuō)明其克隆增殖能力要強(qiáng)。在體外誘導(dǎo)環(huán)境下，i- hPDLSCs的成骨能力要弱于hPDLSCs，兩者成脂能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①i- hPDLSCs 和hPDLSCs的生物學(xué)性能具有一定的差異，i- hPDLSCs能否和hPDLSCs一樣具有良好的牙周組織形成能力，并且作為牙周組織工程的候選種子細(xì)胞，需要進(jìn)一步深入研究；②本實(shí)驗(yàn)所用樣本為同一個(gè)體所提取的hPDLSCs，兩者生物學(xué)性能具有一定差異，表明炎性微環(huán)境刺激對(duì)hPDLSCs有一定的影響，提示我們牙周炎癥可能與表觀遺傳具有相關(guān)性。

本結(jié)果顯示，在同一患者口腔內(nèi)不同環(huán)境所分離獲得的細(xì)胞，其生物學(xué)性能有所改變，與先前報(bào)道一致[10]，由于本實(shí)驗(yàn)所選兩種細(xì)胞來(lái)自同一患者，患牙僅是所處環(huán)境不同，所以本實(shí)驗(yàn)更有力的證實(shí)了炎性微環(huán)境對(duì)于細(xì)胞的生物學(xué)特性有一定影響。另有研究表明，慢性炎癥的存在和細(xì)菌的感染都可能引起DNA甲基化的改變[11]。由此提醒我們，細(xì)胞生物學(xué)性能的改變，可能與表觀遺傳也有一定的關(guān)系。表觀遺傳學(xué)是指研究有絲分裂以及在某些情況下減數(shù)可遺傳的表型變化，可以嚴(yán)格規(guī)范的特異性表達(dá)基因信息而不改變DNA序列[12]。表觀遺傳學(xué)建立在有預(yù)見(jiàn)性和妊娠期的水平上。事實(shí)上，在配子形成和妊娠時(shí)父方和母方暴露的環(huán)境因素均可能對(duì)于后代的表觀遺傳基因產(chǎn)生影響[13]。另一方面，在生命的早期階段,繼承了的表觀遺傳狀態(tài)幾經(jīng)變化，以確保正常的細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程。環(huán)境刺激或隨機(jī)錯(cuò)誤等因素均能夠誘導(dǎo)表觀遺傳配置在生命早期和晚期階段發(fā)生變化，而這些變化大多數(shù)情況下可以負(fù)責(zé)如發(fā)育、分化、應(yīng)激反應(yīng)和病理?xiàng)l件等過(guò)程在壽命期間發(fā)生[14]。在盡可能地排除體內(nèi)及體外影響因素的情況下，同卵雙生的雙胞胎成為研究表觀遺傳現(xiàn)象的一個(gè)經(jīng)典模型——具有完全相同基因的2個(gè)人，在相同或相似的生長(zhǎng)環(huán)境中長(zhǎng)大后，性格以及疾病易感性等方面仍會(huì)有較大的差異[15]。在對(duì)雙胞胎牙周疾病的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)其牙周病的表型往往有所不同。Torres等[16]發(fā)現(xiàn),同卵雙胞胎的牙周病表型如附著喪失、牙槽骨吸收程度等均不一致,且隨年齡增長(zhǎng), 雙胞胎的牙周表型差異性越大，此項(xiàng)研究是在排除了教育程度、吸煙、病原菌等因素的影響后進(jìn)行的。由此提示，牙周病與表觀遺傳兩者相互影響，牙周炎的發(fā)生及細(xì)菌的存在可引起表觀遺傳的改變，表觀遺傳修飾可能參與了牙周病相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。而對(duì)于牙周病與表觀遺傳的相關(guān)研究現(xiàn)在仍處于初期階段，需進(jìn)一步探索。

[1]Akizuki T, Oda S, Komaki M,etal. Application of periodontal ligament cell sheet for periodontal regeneration: a pilot study in beagle dogs [J].JPeriodontalRes, 2005,40(3):245-251.

[2]陳發(fā)明，金巖，施松濤，等. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué):十年回顧與展望[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2011,27(1):5-11.

[3]Feng F, Akiyama K, Liu Y,etal. Utility of PDL progenitors for in vivo tissue regeneration: a report of 3 cases [J].OralDis, 2010,16(1):20-28.

[4]Park JC, Kim JM, Jung IH,etal. Isolation and characterization of human periodontal ligament (PDL) stem cells (PDLSCs) from the inflamed PDL tissue: in vitro and in vivo evaluations [J].JClinPeriodontol, 2011,38(8):721-731.

[5]Chen FM, Sun HH, Lu H,etal. Stem cell- delivery therapeutics for periodontal tissue regeneration [J].Biomaterials, 2012,33(27):6320-6344.

[6]Gronthos S, Mrozik K, Shi S,etal. Ovine periodontal ligament stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential [J].CalcifTissueInt, 2006,79(5):310-317.

[7]Seo BM, Miura M, Gronthos S,etal. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament [J].Lancet, 2004,364(9429):149-155.

[8]談珺. 人牙周炎癥組織中干/祖細(xì)胞的體外分離、純化及初步鑒定[D]. 西安：第四軍醫(yī)大學(xué), 2011-04-01.

[9]Zhang J, An Y, Gao LN,etal. The effect of aging on the pluripotential capacity and regenerative potential of human periodontal ligament stem cells [J].Biomaterials, 2012,33(29):6974-6986.

[10]劉亞麗，劉文佳，胡成虎，等. 牙周慢性炎癥對(duì)牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 [J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2014，24(1):21-25.

[11]Stenvinkel P, Karimi M, Johansson S,etal. Impact of inflammation on epigenetic DNA methylation a novel risk factor for cardiovascular disease? [J].JInternMed, 2007,261(5):488-499.

[12]Waddington CH. The epigenotype. 1942 [J].IntJEpidemiol, 2012,41(1):10-13.

[13]Puri D, Dhawan J, Mishra RK. The paternal hidden agenda: Epigenetic inheritance through sperm chromatin [J].Epigenetics, 2010,5(5):386-391.

[14]Cedar H, Bergman Y. Programming of DNA methylation patterns [J].AnnuRevBiochem, 2012,81:97-117.

[15]Fraga MF, Ballestar E, Paz MF,etal. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2005,102(30):10604-10609.

[16]Torres DHG, Loos BG, van der Velden U. Monozygotic twins are discordant for chronic periodontitis: clinical and bacteriological findings [J].JClinPeriodontol, 2010,37(2):120-128.

Comparasion of the biological characteristics of normal and inflammatory periodontal ligament stem cells from the same donor

ZHANG Lin- lin*, BI Chun- sheng, CHEN Fa- ming, JIN Yan

(*StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology,DepartmentofPeriodontology，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

AIM: To compare the biological characteristics of inflammatory periodontal ligament stem cells (i- hPDLSCs) and healthy periodontal ligament stem cells ( hPDLSCs) from the same donor．METHODS: i- hPDLSCs and hPDLSCs were isolated from the same donor．Their colony-forming ability，proliferative capacity, cell surface antigens and differentiation ability were evaluated and quantified for statistical analysis．RESULTS: Both stem cells have highly proliferative and differentiative potential．i- hPDLSCs had a significantly higher rate of successive culture and proliferation than hPDLSCs(P<0.05). hPDLSCs had a higher rate of cell osteogenic differentiation than i- hPDLSCs (P<0.05). The adipogenic potential of i- hPDLSCs and hPDLSCs showed no statistical difference．CONCLUSION: Inflammatory environment influences the biological properties of periodontal ligment stem cells.

periodontal ligament stem cells (hPDLSCs); inflammatory periodontal ligament stem cells ( i- hPDLSCs); proliferation; differentiation

2014-07-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170912)

張琳琳(1985-)，女，漢族，臨沂人。碩士生(導(dǎo)師：陳發(fā)明、金巖)

陳發(fā)明, E-mail: cfmsunhh@fmmu.edu.cn

金 巖, E-mail: yanjin@fmmu.edu.cn

R781.4

A

1005-2593(2015)01-0001-07

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-12-1005)