李 雯, 尹 碩, 張 娟, 王 賀, 劉繼明, 羅 瑩, 李正強(qiáng), 張穎麗

(吉林 長(zhǎng)春 130021: 1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院; 2 .長(zhǎng)春市中醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

MMP- 3對(duì)大鼠牙髓損傷后修復(fù)性牙本質(zhì)形成的促進(jìn)作用及意義

李 雯1, 尹 碩1, 張 娟1, 王 賀1, 劉繼明1, 羅 瑩2, 李正強(qiáng)1, 張穎麗1

(吉林 長(zhǎng)春 130021: 1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院; 2 .長(zhǎng)春市中醫(yī)院)

目的: 研究基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP- 3)對(duì)牙髓損傷后修復(fù)性牙本質(zhì)形成的作用。方法：取48只Wistar大鼠，分為3組(n=16)；在各組大鼠的左側(cè)上頜第一磨牙牙合面?zhèn)涠粗谅端韬?，分別用PBS、氫氧化鈣、MMP- 3(均以膠原蛋白海綿做載體)蓋髓。于術(shù)后3、7、14、28d各時(shí)間點(diǎn)，每組各隨機(jī)處死4只動(dòng)物，制備實(shí)驗(yàn)牙組織切片；HE和免疫組化染色，觀察各組修復(fù)性牙本質(zhì)形成及成牙本質(zhì)細(xì)胞中DMP- 1的表達(dá)情況。結(jié)果：MMP- 3組在蓋髓后DMP-1的表達(dá)情況: 3d時(shí)，呈弱陽(yáng)性表達(dá)；7d時(shí)，呈陽(yáng)性表達(dá)，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)散在的骨樣牙本質(zhì)；14d時(shí)， 呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)連續(xù)完整的鈣化橋；28d時(shí)，表達(dá)明顯減弱，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)大量修復(fù)性牙本質(zhì)。各時(shí)間點(diǎn)各組成牙本質(zhì)細(xì)胞中DMP- 1陽(yáng)性區(qū)的灰度值均以MMP- 3組最高，PBS組最低;MMP- 3組與PBS組相比，在術(shù)后3、7、14d時(shí)均有顯著性差異(P<0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，在術(shù)后3、7d時(shí)有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：MMP- 3對(duì)牙髓損傷后修復(fù)性牙本質(zhì)的形成具有促進(jìn)作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶3; 牙髓; 損傷修復(fù); 成牙本質(zhì)細(xì)胞

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):453]

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(DMP- 1)是一種酸性磷酸化的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是礦化組織中非膠原蛋白的重要組成部分，在牙齒中主要表達(dá)于分泌型成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞[1]，也是成牙本質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白。牙髓組織在受到外界各種刺激(如外傷、放射線、化學(xué)藥物、備洞時(shí)的機(jī)械力等)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列的反應(yīng)以抵御刺激并進(jìn)行自身修復(fù)[2-5]。在形成修復(fù)性牙本質(zhì)的過(guò)程中，成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌活動(dòng)的調(diào)節(jié)和成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化對(duì)損傷后牙髓的修復(fù)起著極其重要的作用[6]。有研究表明[7]，DMP- 1在深齲的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞胞漿和修復(fù)性牙本質(zhì)中均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明DMP- 1參與了牙髓的自身修復(fù)過(guò)程，并能反映牙髓損傷后硬組織的修復(fù)性再生情況。

近年來(lái)，研究較多的基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3 ，MMP- 3)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員, 其能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分,不僅參與組織形態(tài)發(fā)生、損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)等一系列生理、病理過(guò)程；還在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、動(dòng)脈粥樣硬化[9]、乳腺癌[10]等疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。已有體外實(shí)驗(yàn)[11]證明，MMP- 3在成熟牙齒的礦化牙本質(zhì)中呈高表達(dá)，所以大膽猜想 MMP- 3可能參與了硬組織的礦化過(guò)程。

目前關(guān)于MMP- 3對(duì)牙髓損傷修復(fù)效果的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建大鼠牙髓機(jī)械性損傷的基礎(chǔ)上建立模型，分別將 MMP- 3、氫氧化鈣、PBS置于損傷牙髓斷面；然后以DMP- 1作為修復(fù)性牙本質(zhì)形成的特異性標(biāo)志物[12]，分別觀察不同蓋髓劑蓋髓后成牙本質(zhì)細(xì)胞中DMP- 1的表達(dá)情況，以期探討MMP- 3對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；1/4鎢鋼球鉆、高速渦輪機(jī)(上海醫(yī)用器械設(shè)備廠)；30 g/L水合氯醛、乙醚(長(zhǎng)春市永輝化工商貿(mào)有限公司)；膠原蛋白海綿(吉林大學(xué)口腔頜面外科提供)；基質(zhì)金屬蛋白酶3(Sigmag公司，美國(guó))；氫氧化鈣(登士柏，日本)；DMP- 1 單克隆抗體、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；富士Ⅸ玻璃離子(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院提供 )；顯微鏡和照相系統(tǒng)(OLYMPUS, BX71，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及蓋髓處理

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組

取8周齡健康雄性Wistar大鼠48只(體質(zhì)量180～220 g)，所有大鼠牙體、牙列完整，咬合關(guān)系正常，無(wú)齲病、牙周病及牙齒畸形；用軟硬混合飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，按不同蓋髓劑隨機(jī)分為3大組(n=16)：陰性對(duì)照組(PBS蓋髓)、陽(yáng)性對(duì)照組(氫氧化鈣蓋髓)、實(shí)驗(yàn)組(MMP- 3蓋髓), 每組大鼠再根據(jù)觀察時(shí)間各隨機(jī)分為3、7、14、28 d 4個(gè)亞組(n=4)。

1.2.2 牙髓損傷模型的制備及蓋髓處理

上述各組Wistar大鼠稱重后，用30 g/L水合氯醛肌肉注射(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉。然后將各大鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，20 g/L碘伏消毒口腔后，用1/4球鉆分別在每只大鼠的左側(cè)上頜第一磨牙牙合面中央制洞，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)小穿髓點(diǎn)時(shí)立即停止；用生理鹽水充分沖洗，無(wú)菌棉球壓迫止血并干燥窩洞后，按分組進(jìn)行蓋髓：實(shí)驗(yàn)組露髓處放置含MMP- 3(100 μg/μL)的膠原蛋白海綿; 陰性對(duì)照組露髓處放置含PBS(100 μg/μL)緩沖液的膠原蛋白海綿; 陽(yáng)性對(duì)照組露髓處放置含氫氧化鈣糊劑(100 μg/μL)的膠原蛋白海綿，最后用玻璃離子(富士Ⅸ)充填窩洞。以上所有操作均由一名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生單獨(dú)完成。

1.3 取材及組織切片制備

所有大鼠分別于蓋髓術(shù)后3、7、14、28 d用40 g/L多聚甲醛心內(nèi)注處死后，迅速分離各大鼠的上頜骨并制備包含左側(cè)上頜第一磨牙的骨組織塊。然后將各組骨組織塊置于新配置的40 g/L多聚甲醛中，常溫固定48 h后置于100 g/L EDTA(pH=7.4)溶液中脫鈣8周；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋后，平行于牙體長(zhǎng)軸方向做近、遠(yuǎn)中向連續(xù)切片(厚5 μm)。最后選取各組通過(guò)穿髓孔的組織切片用于以下觀察。

1.4 HE染色觀察

取上述各組組織切片常規(guī)脫蠟至水，分別經(jīng)蘇木素染色5 min、流水返藍(lán)15 min、伊紅染色3 min、流水沖洗5 min后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片；然后在顯微鏡下觀察各組修復(fù)性牙本質(zhì)的形成情況并采集圖像。

1.5 免疫組化染色觀察

取上述各組組織切片脫蠟至水，用PBS 洗滌并

擦干組織周圍的多余水分后，浸入新鮮配置的30 mL/L過(guò)氧化氫液中室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶； 0.1 mol/L PBS洗滌5 min×3次，滴加正常非免疫動(dòng)物血清封閉 30 min；甩去多余液體,不洗，滴加稀釋的DMP- 1單克隆抗體 (1 ∶200)， 4 ℃ 濕盒過(guò)夜；次日37 ℃復(fù)溫45 min，0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)孵育20 min； 0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)孵育20 min； 0.1 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB顯色后，蘇木精輕度復(fù)染胞核1～3 min；流水沖洗，梯度乙醇水化后，二甲苯透明(5～10 min)、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察DMP- 1表達(dá)情況并照相。同時(shí)，在高倍鏡下從每張切片的染色陽(yáng)性區(qū)各隨機(jī)選取3個(gè)不重疊區(qū)域，用Image- Pro Plus軟件測(cè)其陽(yáng)性灰度值，并取均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察結(jié)果

PBS組：蓋髓后3 d時(shí)，露髓點(diǎn)下方有大量炎細(xì)胞聚集(較MMP- 3組炎癥反應(yīng)重)，呈化膿性征兆(圖1a)；7 d時(shí)，炎癥細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，可見(jiàn)少量前期牙本質(zhì)形成(圖1b)；14 d時(shí)，露髓點(diǎn)下方炎細(xì)胞密集，可見(jiàn)前期牙本質(zhì)不均勻增厚而形成的少量修復(fù)性牙本質(zhì)(圖1c)；28 d時(shí)，可見(jiàn)髓室內(nèi)的牙髓呈變性壞死征兆 (圖1d)。

a.術(shù)后3d,炎癥反應(yīng)明顯,成牙本質(zhì)樣細(xì)胞活躍b.術(shù)后7d,露髓點(diǎn)下方大量炎細(xì)胞聚集,成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂,有前期牙本質(zhì)形成c.術(shù)后14d,穿髓孔下方仍有大量炎細(xì)胞聚集,可見(jiàn)前期牙本質(zhì)增厚而形成的修復(fù)性牙本質(zhì)d.術(shù)后28d,前期牙本質(zhì)增厚而形成的少量修復(fù)性牙本質(zhì),髓腔中有局限的液化變性壞死灶

圖1 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PBS組大鼠的牙髓組織學(xué)觀察(#示前期牙本質(zhì), *示修復(fù)性牙本質(zhì); HE染色)

氫氧化鈣組：蓋髓后3 d時(shí)，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)大量炎細(xì)胞及明顯擴(kuò)張的血管(圖2a)；7 d時(shí)，穿髓孔下方的炎細(xì)胞和擴(kuò)張的血管數(shù)目進(jìn)一步增多(圖2b)；14 d時(shí)，可見(jiàn)少量不連續(xù)的鈣化橋形成，并可見(jiàn)牙髓呈壞死征兆(圖2c)；28 d時(shí)，牙髓鈣化壞死(圖2d)。

MMP- 3組：蓋髓后3 d時(shí)，露髓點(diǎn)下方有少量炎細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)明顯擴(kuò)張的血管及新生血管(圖3a)；7 d時(shí)，炎癥和血管擴(kuò)張明顯，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)少量前期牙本質(zhì)及散在的骨樣牙本質(zhì)(圖3b)；14 d時(shí)，穿髓孔下方可見(jiàn)連續(xù)完整的鈣化橋形成,無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3c)；28 d時(shí)，露髓點(diǎn)下方可見(jiàn)大量修復(fù)性牙本質(zhì)，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3d)。

2.2 DMP- 1免疫組化染色觀察結(jié)果

PBS組：蓋髓后3 d時(shí)，穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(圖4a)；7 d時(shí)呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖4b)；14 d時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)，但其強(qiáng)度較MMP- 3 組和氫氧化鈣組弱(圖4c)；28 d時(shí)穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(圖4d)。

氫氧化鈣組：蓋髓后3 d時(shí)，穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖5a)；7 d時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)(圖5b)；14 d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且其表達(dá)強(qiáng)度介于PBS組和MMP- 3組之間(圖5c)；28 d時(shí)呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖5d)。

MMP- 3組：蓋髓后3 d時(shí)，穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖6a)；7 d時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)(圖6b)；14 d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖6c)；28 d時(shí)呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖6d)。

各組DMP- 1染色陽(yáng)性區(qū)的灰度值分析結(jié)果顯示：蓋髓后3、7、14、28 d各時(shí)間點(diǎn)，各組灰度值由高至低依次為MMP- 3組、氫氧化鈣組、PBS組；MMP- 3組與PBS組灰度值相比，術(shù)后3、7、14 d各時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05), 術(shù)后28 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，術(shù)后3、7 d各時(shí)間點(diǎn)，兩者的灰度值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，術(shù)后14、28 d各時(shí)間點(diǎn)，兩者的灰度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

a.術(shù)后3d,炎癥反應(yīng)明顯,血管擴(kuò)張b.術(shù)后7d,露髓點(diǎn)下方有大量炎細(xì)胞聚集,擴(kuò)張血管數(shù)目增多c.術(shù)后14d,穿髓孔下方形成不連續(xù)鈣化橋,可見(jiàn)牙髓呈壞死征兆 d.術(shù)后28d,牙髓鈣化壞死

圖2 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)氫氧化鈣組大鼠的牙髓組織學(xué)觀察(#示擴(kuò)張血管, *示修復(fù)性牙本質(zhì); HE染色)

a.術(shù)后3d,炎癥反應(yīng)較輕,可見(jiàn)新生血管,成牙本質(zhì)細(xì)胞排列正常b.術(shù)后7d,血管擴(kuò)張,成牙本質(zhì)細(xì)胞活躍,露髓點(diǎn)下方見(jiàn)前期牙本質(zhì)形成及散在的骨樣牙本質(zhì)c.術(shù)后14d,成牙本質(zhì)細(xì)胞增生活躍,炎癥反應(yīng)減輕,露髓點(diǎn)下方有連續(xù)的鈣化橋形成d.術(shù)后28d,成牙本質(zhì)細(xì)胞活躍程度減弱,露髓點(diǎn)下方已形成大量修復(fù)性牙本質(zhì)

圖3 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)MMP- 3組大鼠的牙髓組織學(xué)觀察(#示新生血管, *示修復(fù)性牙本質(zhì); HE染色)

a.術(shù)后3d,幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá) b.術(shù)后7d,呈弱陽(yáng)性表達(dá)c.術(shù)后14d,呈陽(yáng)性表達(dá),弱于實(shí)驗(yàn)組d.術(shù)后28d,幾乎無(wú)陽(yáng)性表達(dá)

圖4 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PBS組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質(zhì)細(xì)胞)

a.術(shù)后3d,呈弱陽(yáng)性表達(dá)b.術(shù)后7d,呈陽(yáng)性表達(dá)c.術(shù)后14d,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)d.術(shù)后28d,呈弱陽(yáng)性表達(dá)

圖5 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)氫氧化鈣組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質(zhì)細(xì)胞)

a.術(shù)后3d,呈弱陽(yáng)性表達(dá)b.術(shù)后7d,呈陽(yáng)性表達(dá)c.術(shù)后14d,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)d.術(shù)后28d,呈弱陽(yáng)性表達(dá)

圖6 蓋髓術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)MMP- 3組DMP- 1免疫組化染色 (#示成牙本質(zhì)細(xì)胞)

*與PBS組相比P<0.05；#與氫氧化鈣組相比P<0.05

3 討論

牙髓組織的自身修復(fù)是很復(fù)雜的過(guò)程，而且取決于炎癥的程度及其他相關(guān)因素。炎癥較重時(shí)，一方面，未分化的牙髓干細(xì)胞向損傷處遷移并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞來(lái)抵抗外界刺激[13]；另一方面，牙髓組織中的一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF- β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF- 1)等可通過(guò)自身的調(diào)節(jié)作用來(lái)參與牙髓組織的修復(fù)[14]。而且有研究證明，成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞通過(guò)分泌基質(zhì)蛋白形成修復(fù)性牙本質(zhì)是牙髓損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-16]。近年來(lái)，關(guān)于牙髓受損后的保髓治療已成為備受關(guān)注的牙髓治療方法，即在牙髓的創(chuàng)傷面上放置保護(hù)性材料，可使牙髓-修復(fù)體界面形成連續(xù)的牙本質(zhì)橋，并最終形成修復(fù)性牙本質(zhì)。MMPs是一類在細(xì)胞外基質(zhì)的生理性和病理性降解過(guò)程中起重要作用的蛋白酶超家族，它廣泛存在于各結(jié)締組織中，并與多種疾病的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系[17-19]。在病理?xiàng)l件下，MMP- 3不僅可降解細(xì)胞外基質(zhì)，還可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、遷移而完成組織的重建過(guò)程[20-21]，是參與機(jī)體損傷組織修復(fù)的重要因子。

本實(shí)驗(yàn)首次將MMP- 3作為蓋髓劑用于大鼠牙髓損傷的蓋髓治療，并以PBS、氫氧化鈣作為對(duì)照，分別觀察不同蓋髓劑蓋髓后成牙本質(zhì)細(xì)胞中DMP- 1的表達(dá)情況，以探討MMP- 3對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成作用。HE染色結(jié)果顯示：PBS組牙髓組織炎癥反應(yīng)從3 d開(kāi)始就較明顯，蓋髓后期(14 d)僅有少量修復(fù)性牙本質(zhì)形成，但依然可見(jiàn)一定范圍內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及牙髓壞死征兆。氫氧化鈣組在蓋髓初期的牙髓炎癥反應(yīng)亦較重，14 d時(shí)髓腔逐漸縮小并形成不連續(xù)的鈣化橋，雖然氫氧化鈣的強(qiáng)堿性可以中和牙髓炎癥產(chǎn)生的酸性物質(zhì)[22]，但在28 d時(shí)牙髓組織仍出現(xiàn)了凝固性變性壞死。而MMP- 3組在蓋髓后3 d時(shí)，其牙髓組織的炎癥反應(yīng)即較PBS組和氫氧化鈣組輕，并可見(jiàn)新生血管的形成，從而證實(shí)了MMP- 3在牙髓損傷修復(fù)過(guò)程中可以促進(jìn)血管再生的說(shuō)法[23]；從7 d開(kāi)始，前期牙本質(zhì)逐漸增厚而形成連續(xù)的鈣化橋，并最終形成明顯的修復(fù)性牙本質(zhì)。有學(xué)者通過(guò)建立成年大鼠輕度牙髓損傷修復(fù)模型證實(shí)，當(dāng)牙髓的炎癥局限于露髓點(diǎn)下方較小范圍時(shí)， MMP- 3有一定的抗炎作用[24]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中MMP- 3可以促進(jìn)血管再生和修復(fù)性牙本質(zhì)形成的結(jié)果, 提示MMP- 3是一種良好的蓋髓劑。免疫組化染色結(jié)果顯示，DMP- 1在MMP- 3組成牙本質(zhì)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)從第3天開(kāi)始出現(xiàn)，隨后逐漸增強(qiáng)并于蓋髓后第14天達(dá)到最高峰， 28 d時(shí)陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱。蓋髓術(shù)后各時(shí)間，各組成牙本質(zhì)細(xì)胞中DMP- 1表達(dá)陽(yáng)性區(qū)的平均灰度值均以MMP- 3組最高，PBS組最低。MMP- 3組與PBS組相比，在術(shù)后3、7、14 d時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)；MMP- 3組與氫氧化鈣組相比，在術(shù)后3、7 d時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，MMP- 3在炎癥初期和中期可增強(qiáng)成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的活躍性，使之在受到外界刺激時(shí)可通過(guò)分泌DMP- 1而逐漸形成修復(fù)性牙本質(zhì)；28 d時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞活躍程度降低，其分泌的DMP- 1也相應(yīng)減少，所以DMP- 1的陽(yáng)性表達(dá)也減弱。

綜上所述，將 MMP- 3置于損傷牙髓的露髓處，對(duì)增強(qiáng)成牙本質(zhì)細(xì)胞的活躍性和提高修復(fù)性牙本質(zhì)的形成能力均有一定的促進(jìn)作用，證實(shí)了Biochem等[25]報(bào)道的MMP- 3可誘導(dǎo)炎癥牙髓細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和礦化這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論。本結(jié)果提示，基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP- 3)是一種良好的蓋髓劑，可與氫氧化鈣等蓋髓劑聯(lián)合應(yīng)用于臨床，為開(kāi)發(fā)新的蓋髓劑提供了理論基礎(chǔ)和新思路。

[1]Jacob A,Zhang Y,George A,etal.Transcriptional regulation of dentin matrix protein 1 (DMP1) in odontoblasts and osteoblasts[J].ConnectTissueRes, 2014,55(1):107-112.

[2]Mead B, Logan A, Berry M,etal. Intravitreally transplanted dental pulp stem cells promote neuroprotection and axon regeneration of retinal ganglion cells after optic nerve injury[J].InvestophthalmolVisSci, 2013,54(12):7544-7556.

[3]Simon S, Smith AJ. Regenerative endodontics[J].BrDentJ, 2014,216(6):E13.

[4]郝靖惠，楊博，白慶霞，等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與牙髓損傷修復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012,22(4):189-193.

[5]Lee YL, Liu J, Clarkson BH,etal. Dentin- pulp complex response to carious lesions [J].CariousRes, 2006,40(3):256-264.

[6]Taira Y, Shinkai K, Suzuki M,etal. Direct pulp capping effect with experimentally developed adhesive resin systems containing reparative dentin- promoting agents on rat pulp：mixed amounts of additives and their effect on wound healing[J].Odontology, 2011,99(2):135-147.

[7]逢鍵梁，吳補(bǔ)領(lǐng)，張亞慶，等. 牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白在人不同齲壞牙齒中的免疫定位[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2003,19(5):414-417.

[8]Mamehara A, Sugimoto T, Sugiyama D,etal. Serum matrix metalloproteinase- 3 as predictor of joint destruction in rheumatoid arthritis, treated with non- biological disease modifying anti-rheumatic drugs[J].KobeJMedSci, 2010,56(3):E98-E107.

[9]Samneg?rd A, Silveira A, Lundman P,etal. Serum matrix metalloproteinase- 3 concentration is influenced by MMP- 3- 1612 5A/6A promoter genotype and associated with myocardial infarction[J].JInternMed, 2005,258:411-419.

[10]LaBarge MA. Breaking the canon: indirect regulation of Wnt signaling in mammary stem cells by MMP3[J].CellStemCell, 2013,13(3):259-260.

[11]Mazzoni A, Papa V, Nato F,etal. Immunohistochemical and biochemical assay of MMP- 3 in human dentine[J].JDent, 2011,39(3):231-237.

[12]Choussain C, Eapen AS, Huet E,etal. MMP2- cleavage of DMP1 generates a bioactive petide promoting differention of dental pulp stem / progenitor cell[J].EurCellMater,2009,18:84-95.

[14]Horda MJ, Watonabe E, Mikami Y,etal. Mesenchymal dental stem cells for tissues regeneration[J].IntJOralMaxillofacImplants, 2013,28(6):e451-e460.

[15]叢明宇，趙亮，常蓓，等. 修復(fù)性牙本質(zhì)形成的機(jī)理與調(diào)控[J]. 牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014,24(10):615-622.

[16]Murrary PE, Hafez AA, Smith AJ,etal. Hierarchy of pulp capping and repair activities responsible for dentin brige formation[J].AmJDent, 2002,15(4):236-243.

[17]Gronthos S, Mankani M, Brahim J,etal. Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCS) in vitro and in vivo[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000, 97(25):13625-13630.

[18]Iyer RP, Patterson NL, Fields GB,etal. The history of the matrix metalloproteinases: milestones, myths, and misperceptions[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol, 2012, 303(8):H919-H930.

[19]Galliera E, Randelli P, Dogliotti G,etal. Matrix metalloproteinases MMP- 2 and MMP- 9 :are they early biomarkers of bone remodeling and healing after arthroscopic armoioplasty? [J].Injury, 2010,41(11): 1204-1207.

[20]田鯤，陳宇，耿寧，等. 基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑表達(dá)失衡與涎腺惡性腫瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)的關(guān)系[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2005,23(4)：273-279.

[21]Yamashita CM, Dolgonos L, Zemans RL,etal. Matrix metalloproteinase 3 is a mediator of pulmonary fibrosis[J].AmJPathol, 2011,179(4):1733-1745.

[22]Li M, Moeen Rezakhanlou A, Chavez- Munoz C,etal. Keratinocyte- releasable factors increased the expression of MMP1 and MMP3 in co- cultured fibroblasts under both 2D and 3D culture conditions[J].MolCellBiochem, 2009,332(1/2):1-8.

[23]Swarup SJ, Rao A, Boaz K,etal. Pulpal response to nano hydroxyapatite, mineral trioxide aggregate and calcium hydroxide when used as a direct pulp capping agent: an in vivo study[J].JClinPediatrDent, 2014, 38(3): 201-206.

[24]Zheng L, Amano K, Iohara K,etal. Matrix metalloproteinase- 3 accelerates wound healing following dental pulp injury[J].AmJPathol, 2009, 175(5): 1905-1914.

[25]Eba H, Murasawa Y, Iohara K,etal. The anti- inflammatory effects of matrix metalloproteinase- 3 on irreversible pulpitis of mature erupted teeth[J].PLoSOne, 2012,7(12):e52523.

[26]Eguchi T, Kubota S, Kawata K,etal. Novel transcription factor-like function of human matrix metalloproteinase 3 regulating the CTGF/CCN2 gene[J].MolCellBiol, 2008, 28(7):2391-413.

Effects of MMP-3 on the reparative dentin formation in rats after dental pulp injury

LI Wen*, YIN Shuo, ZHANG Juan, WANG He, LIU Ji- ming , LUO Ying, LI Zheng- qiang , ZHANG Ying- li

(*DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)

AIM: To study the role of MMP- 3 on the reparative dentin formation after pulp injury. METHODS: 48 Wistar rats were divided into 3 groups(n=16). A cavity on the occlusal surface of maxillary first molars on left side was prepared in each rat, PBS, calcium hydroxide, and MMP-3 was applied on the exposed pulp in the rats of the 3 groups respectively. On day 3, 7, 14 and 28 after operation, the rats were sacrificed. The tooth were stained with HE and immunohistochemistry.DMP- 1 expression was observed. RESULTS: In MMP- 3 group, DMP- 1 was weakly expressed on d 3, positively expressed on d 7 and strongly expressed on d 14, but its expression decreased on d 28 in odontoblasts. A large number of scattered osteoid dentin was observed under the exposed pulp on d 7. Continuous calcified bridge was observed under the exposed pulp on d 14 . A thick layer of reparative dentin was observed under the exposed pulp, MMP- 3 group showed stronger DMP- 1exoression(P<0.05) and more reparative dentin than PBS group at each time point, and than calcium hydroxide group on d 3 and d 5. CONCLUSION: MMP- 3 may promote the repair of dental pulp after injury.

matrix metalloproteinase 3(MMP-3); dental pulp; wound healing; odontoblas

2015-01-07

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃(20130102096JC)

李 雯(1989-)，女，漢族，山西長(zhǎng)治人。碩士生(導(dǎo)師：張穎麗)

張穎麗，E-mail：zhangyingli1989@163.com

R

A

1005-2593(2015)08-0453-07

長(zhǎng)春市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (12SF88)