楊 楠, 周 威, 王 光, 丁 寅, 金 巖*

(1. 解放軍第309醫(yī)院口腔科, 北京 100091; 2. 解放軍91551部隊門診部, 江西 九江 332005；3. 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室, 陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室,第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院: *正畸科, **組織工程中心, 陜西 西安 710032)

miR- 21調控人骨髓間充質干細胞成骨分化的研究

楊 楠1, 周 威1, 王 光2, 丁 寅3*, 金 巖3**

(1. 解放軍第309醫(yī)院口腔科, 北京 100091; 2. 解放軍91551部隊門診部, 江西 九江 332005；3. 軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室, 陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室,第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院:*正畸科,**組織工程中心, 陜西 西安 710032)

目的: 觀察miR- 21在人骨髓間充質干細胞(hBMMSCs)成骨分化過程中的表達。方法：通過轉染使hBMMSCs過表達或抑制miR- 21后，分別采用ALP染色、茜素紅染色觀察各組ALP活性和鈣化結節(jié)的表達形成量；并采用Real time RT- PCR、Western blot檢測各組成骨相關基因Runxz、osterixmRNA及其蛋白的表達水平，以觀察miR- 21對hBMMSCs體外成骨分化的調控作用。將表達不同水平miR- 21的各組hBMMSCs與HA/TCP復合后植入裸鼠皮下，8周后取材，采用HE染色和Masson三色染色觀測各組類骨質的形成量。結果: miR- 21在hBMMSCs成骨過程中表達量較對照組明顯升高(P<0.05)。過表達miR- 21能促進hBMMSCs體外成骨分化及體內的異位成骨能力；而抑制miR- 21則能降低hBMMSCs體外成骨分化及體內的異位成骨能力。結論：miR- 21可外調控hBMMSCs成骨分化，在骨形成過程發(fā)揮作用。

miR- 21; 骨髓間充質干細胞(hBMMSCs); 成骨分化

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):465]

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有18～25個核苷酸的非編碼RNA，可通過與靶基因3′UTR區(qū)非完全配對來抑制靶基因的翻譯和穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對不同細胞的成骨分化均具有調控作用[1-3]。但如何挑選在骨髓間充質干細胞成骨分化中起關鍵作用的miRNAs，這些miRNAs在調控骨髓間充質干細胞體外、體內成骨分化中的作用如何，以及其具有哪些作用機理等，目前還未得到充分的研究。本課題組在前期研究中，利用基因芯片的方法篩查了人組織特異性骨髓間充質干細胞 (hBMMSCs) 成骨分化過程中差異性表達的miRNAs，并通過生物信息學技術對篩選的差異性miRNAs與hBMMSCs成骨分化的miRNA基因芯片結果進行了比較，發(fā)現(xiàn)miR- 21在hPDLSCs和hBMMSCs成骨分化過程中均有差異性表達。我們認為， miR- 21在間充質干細胞成骨分化中起到了重要作用，但其如何調控hBMMSCs成骨分化目前尚不清楚，亦未見相關研究報道。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和動物

Percoll分離液(GE Healthcare，美國)；MicroRNA檢測試劑盒(廣州銳博)；pre- miR- 21、anti- miR- 21、Cy3 labeled miR pre- negative control、 Cy3 labeled miR anti- negative control、siPORT NeoFX轉染試劑(Ambion，美國)；羥基磷灰石粉末(HA- TCP)(Zimmer Scandinavia，丹麥)；十二烷基磺酸鈉(SDS)(Sigma，美國)；8周齡無肥胖無糖尿病聯(lián)合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)，體質量(22～35)g，分籠飼養(yǎng)于實驗動物中心萬級凈化飼養(yǎng)間。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓間充質干細胞(hBMMSCs)的培養(yǎng)及鑒定

1.2.1.1 hBMMSCs的分離和培養(yǎng)

經(jīng)倫理委員會批準和患者知情同意后，選取5例需行髂骨移植術和開放性骨折手術的患者(排除其他全身性疾病和骨質疏松)，分別在術中抽取其骨髓5 mL置于含有枸櫞酸鋰的抗凝管中。在超凈臺內將骨髓與等體積不含血清的低糖α- MEM培養(yǎng)液(含青霉素鈉100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)混合，用吸管反復吹打使骨髓組織均勻分散后，室溫下400 g離心10 min；去掉脂肪層，并用低糖α- MEM 培養(yǎng)液重懸細胞后，將其緩慢注入預先加入等體積1.073 g/mL Percoll分離液的離心管內，注意保持液體分界面完整(Percoll分離液位于下方，而稀釋血液位于上方)；再次400 g離心 30 min，吸取中間的單核細胞層，用PBS洗滌2次后重懸于含100 mL/L胎牛血清和100 U/mL青、鏈霉素的低糖α- MEM培養(yǎng)液中；調整細胞濃度為1×106/L后將其接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，并置于CO2孵箱中。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，首次換液并去除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，并用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況。待細胞生長至80%～90% 融合時，用 2.5 g/L胰蛋白酶消化，并按1 ∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期第3代細胞用于實驗。

1.2.1.2 hBMMSCs的鑒定

取對數(shù)生長期第3代hBMMSCs，用2.5 g/L胰酶消化后制備細胞密度為1×106/mL的單細胞懸液，并將其分別加入8個1.5 mL的EP管中(每管100 μL)；然后分別在各管中加入CD29、CD90、CD14、CD34、CD- 146、CD44 、CD45和STRO- 1 抗體，室溫孵育1 h。孵育結束后，將細胞重懸于預冷的PBS中，并用流式細胞儀分別檢測細胞各表面分子的表達水平。

1.2.2 Real time RT- PCR檢測miR- 21在hBMMSCs成骨分化中的表達

取對數(shù)生長期第3代hBMMSCs接種于成骨誘導液(含10-8mol/L地塞米松、50 μmol/L 維生素C、10 mmol/L β- 甘油磷酸鈉、100 mL/L胎牛血清的α- MEM培養(yǎng)液)中常規(guī)條件下進行成骨誘導培養(yǎng)。分別于誘導培養(yǎng)0、1、3、7、10、14、21、28 d各時間點取一組細胞，按Trizol RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA；并利用miRNAs抽提試劑盒反轉錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，并按照real time RT- PCR試劑操作說明加入檢測體系，用ABI7500實時定量儀(ABI，德國)檢測miR- 21在人骨髓間充質干細胞成骨分化中的表達。所用引物由廣州銳博生物有限公司合成。

1.2.3 miR- 21對hBMMSCs體外成骨分化影響的觀察

1.2.3.1 miR- 21的轉染和成骨誘導

取對數(shù)生長期第3代hBMMSCs，用新鮮α- MEM培養(yǎng)液常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h以確保細胞的生長活力。轉染時，用2.5 g/L胰酶消化細胞，并將其接種于6孔培養(yǎng)板(每孔接種2×105個)，然后用siPORT NeoFX轉染試劑分別轉染pre- miR- 21、pre- miR negative control、anti- miR- 21、anti- miR negative control。轉染2 d后換用成骨分化誘導培養(yǎng)基(100 mL/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α- MEM)進行成骨誘導培養(yǎng)。1.2.3.2 miR- 21轉染后hBMMSCs成骨能力的檢測

分別于誘導培養(yǎng)7、21 d時，取轉染pre- miR- 21、 pre- miR negative control、 anti- miR-21、anti- miR negative control 的各組分化細胞，分別進行堿性磷酸酯酶(ALP)染色和茜素紅染色。其中誘導培養(yǎng)7 d的各組細胞按ALP染色試劑盒說明進行ALP活性定量檢測。誘導培養(yǎng)21 d的各組細胞用40 g/L多聚甲醛液固定20 min后，加入40 mmol/L 茜素紅染色10 min，相差顯微鏡下觀察并拍照；再次染色后，在6孔板內加入100 mmol/L的氯化十六烷基吡啶溶液，充分溶解后，用分光光度儀計測各孔的吸光度值并進行定量分析。

1.2.3.3 成骨相關基因的檢測

轉染pre- miR- 21、pre- miR negative control、 anti- miR- 21、 anti- miR negative control后的各組細胞于成骨誘導7 d后, 分別按照Trizol RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA；用分光光度儀測量各樣品中的RNA含量后，按照反轉錄試劑盒的操作說明，將RNA反轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板按照real time RT- PCR試劑操作說明書加入檢測體系，用ABI7500實時定量儀(ABI，德國)檢測各組各成骨相關基因Runx2、OsterixmRNA的表達水平。所用引物由上海生工生物有限公司合成，具體序列見表1。

表1 Real time RT- PCR所用的引物序列

1.2.3.4 Western blot檢測成骨相關基因的蛋白表達

轉染pre- miR- 21、 pre- miR negative control、 anti- miR- 21、 anti- miR negative control后的各組細胞于成骨誘導7 d后, 分別用2.5 g/L胰蛋白酶進行消化，并離心收集細胞于1.5 mL的 EP管中；然后加入蛋白裂解液制備蛋白樣本。用Bradford法測定各樣品中的蛋白含量后，按照所測目的基因蛋白的大小，選擇不同濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白質電泳。電泳完成后，利用電場作用將凝膠中的蛋白質分子轉移到PVDF 膜上，并利用抗原、抗體特異結合作用使結合于膜上的目的基因蛋白被Runx2、Osterix(一抗、二抗)特異性標記(二抗上標記的辣根過氧化酶可催化底物使之發(fā)光)；用X線片將光信號轉化成肉眼所見的條帶后，Image J軟件分析各條帶的灰度值，并計算各目的基因蛋白的相對含量。

1.2.4 miR- 21轉染后hBMMSCs的體內異位成骨分析

1.2.4.1 hBMMSCs復合HA/TCP植入體內的過程

取第3代hBMMSCs分別轉染pre- miR- 21、pre-miR- 21 negative control、anti-miR-21、anti-miR- 21 negative control，并將轉染后的hBMMSCs與羥基磷灰石粉末(HA/TCP)復合后植入免疫缺陷鼠皮下。具體方法如下：首先取40 mg羥基磷灰石粉末，用100 μL基礎培養(yǎng)液濕潤后吸入1 mL注射器中；然后取上述轉染后的各組hBMMSCs，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后重懸于200 μL α- MEM培養(yǎng)液中，并制成細胞密度為4×106的細胞懸液，將其小心加入1 mL注射器中濕潤的HA/TCP團塊上面，置于CO2孵箱中孵育過夜(每組細胞各制備4個樣本)。取8周齡免疫缺陷鼠，用10 g/L戊巴比妥腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉后，碘伏消毒術區(qū)，并在其一側皮膚做10～12 mm長的切口，同時將注射器插入皮下使之形成一個約 3 mm 的皮下袋。然后取裝有移植物(HA/TCP復合不同組細胞)的注射器, 去除一部分HA/TCP 上層培養(yǎng)液后，將其插入預先形成的皮下袋中并注入移植物；緩慢拔出注射器后，嚴密縫合傷口。同時在對側再植入另外一個移植物。

1.2.4.2 異位成骨分化過程的組織學分析

移植物植入8周后取材，置于多聚甲醛液中4 ℃下固定2 d后，100 g/L EDTA(pH=7.0)脫鈣1周；流水沖洗2 h后石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色和Massons三色染色，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗或秩和檢驗，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 體外培養(yǎng)的hBMMSCs表型鑒定結果

流式細胞儀檢測結果顯示，采用Percoll分離并結合貼壁法培養(yǎng)的hBMMSCs過表達間充質干細胞表面標志物STRO- 1和CD- 146， 同時也表達間充質標志物CD29、CD90、CD44；不表達造血干細胞標志物CD14、CD34和CD45(圖1)。

圖1 hBMMSCs表面分子鑒定結果

2.2 miR- 21在hBMMSCs成骨分化過程中的表達

第3代hBMMSCs經(jīng)成骨誘導0、1、3、7、10、14、21、28 d后，real time RT- PCR 檢測結果顯示，miR- 21在hBMMSCs中的表達水平隨著誘導培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，誘導培養(yǎng)第10天時表達水平最高， 此后逐漸下降; 各時間點的miR- 21表達量均明顯高于對照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR- 21轉染后其轉染效率的檢測

將pre- miR- 21、pre- miR negative control、 anti-miR- 21、 anti- miR negative control分別轉染hBMMSCs，并于轉染后2、7 d利用real time RT-PCR 檢測其轉染效率。結果顯示：pre- miR- 21轉染2 d后，miR- 21的表達量較對照組上升了554倍，7 d后的表達量為對照組的133倍 (圖3a)；而anti- miR- 21轉染2 d后，miR- 21表達量則下降了90%，7 d后下降82% (圖3b)。同時Cy3 標記的pre- miR和anti- miR作為陰性對照，在熒光顯微鏡下觀測轉染陽性細胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，miR- 21轉染效率達到了98%以上。

圖2 miR- 21在 hBMMSC 成骨分化過程中的表達

a.轉染pre-miR-21后 b.轉染anti-miR-21后

圖3 轉染后miR- 21的表達(*與對照組相比P<0.05)

2.4 miR- 21體外調控hBMMSCs成骨分化的觀察結果

化學合成miR- 21前體(pre- miR- 21)和抑制劑(anti- miR- 21)分別轉染hBMMSCs后，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)前者過表達miR- 21，后者抑制miR- 21的表達，同時觀察miR- 21表達水平的變化對hBMMSC成骨分化的影響。轉染2 d后的各組hBMMSCs經(jīng)成骨分化誘導7 d后，ALP染色結果顯示: 過表達miR- 21組的ALP染色較對照組增加，而抑制miR- 21組的ALP染色較對照組減弱 (圖 4a)；過表達miR- 21后ALP活性上升了2倍，而抑制miR- 21后ALP活性降低了52%(P<0.05)(圖4b)。成骨誘導21 d茜素紅染色結果顯示：與對照組相比，過表達miR- 21組的礦化結節(jié)增加，而抑制miR- 21組的礦化結節(jié)明顯減少(P<0.05)(圖4c)。成骨誘導后，分別檢測各組hBMMSCs的成骨特異性基因Runx2、Osterix mRNA和蛋白的表達水平結果顯示: 過表達miR- 21組的Runx2和Osterix的表達水平分別上升了1.7倍和2.2倍，而抑制miR- 21組的Runx2和Osterix基因的表達水平分別下降了42%和58%(P<0.05)(圖4d、e)；Runx2和Osterix蛋白在過表達miR- 21組的表達水平也顯著高于對照組(P<0.05)，而抑制miR- 21組的Runx2和Osterix蛋白表達水平均低于對照組(P<0.05)(圖4f)。

2.5 miR- 21體內調控hBMMSCs成骨分化的觀察結果

為進一步驗證miR- 21在體內是否能夠促進異位骨的形成，分別將pre- miR- 21、anti- miR-21、pre- miR negative control和anti- miR negative control轉染hBMMSCs；將轉染48 h后的各組細胞與HA/TCP支架材料復合并植入8周齡免疫缺陷鼠的皮下。8周后取材，HE染色和Masson三色染色觀察結果顯示：過表達miR- 21組的類骨質形成量明顯多于對照組；而抑制miR- 21組的類骨質形成量明顯少于對照組(P<0.05)(圖5～6)。該結果顯示，過表達miR- 21能夠增強hBMMSCs的體內成骨分化能力。

a. ALP及茜素紅染色; b. ALP活性定量結果; c. 鈣化結節(jié)定量結果; d、e. Runx2、Osterix mRNA表達水平比較;

f. Runx2、Osterix 蛋白表達水平比較; 1為pre-miR-cont; 2為pre-miR-21; 3為anti-miR-cont; 4為anti-miR-21

圖4 miR- 21對hBMMSCs體外成骨分化能力的影響(相同符號之間相比P<0.05)

圖5 HE、Masson's三色染色觀察類骨質形成情況(HA為羥基磷灰石; B為bone)

1為pre-miR-cont; 2為pre-miR-21;

3 討論

hBMMSCs成骨分化是一個復雜的過程，受多條信號通路在轉錄水平和轉錄后水平的調控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs能調控多種細胞的成骨分化；其中miR-204/211可通過抑制其靶基因Runx2的表達，從而促進間充質干細胞 (MSCs) 的成骨分化，并抑制其成脂分化[4]。有文獻報道，Runx2能夠負向調控miR簇23a～27a～24-2的表達，從而增強成骨標志基因的表達和成骨分化[5]。Luzi等[6]發(fā)現(xiàn)，在人脂肪組織來源的MSCs中，miR- 26能通過抑制Smad1的翻譯負向調控成骨分化，而過表達miR- 196則能夠抑制HOXC8，促進成骨分化，并抑制脂肪間充質干細胞的增殖；mir- 125b 能夠抑制小鼠間充質細胞系ST2的成骨分化，而miR- 133、miR- 135能夠分別作用于Runx2和Smad5從而抑制C2C12細胞系的成骨分化。以上研究結果表明，miRNAs在調控干細胞成骨分化中起到了重要的作用。

本研究利用生物信息學技術檢索了目前報道的hBMMSCs成骨分化的miRNA 基因芯片結果，結合本課題組前期研究的牙周膜干細胞成骨芯片結果，我們發(fā)現(xiàn)miR- 21在hBMMSCs成骨分化中表達量升高。因此，我們認為miR- 21可能是調控間充質成骨分化的關鍵miRNA之一。本實驗中通過對miR- 21在hBMMSCs成骨過程中表達譜的分析發(fā)現(xiàn)，miR- 21的表達量在成骨過程中的各時間點均較對照組明顯升高，這一結果與基因芯片結果一致。對miR- 21體外調控hBMMSCs成骨分化的功能進行研究發(fā)現(xiàn)，上調miR- 21能夠促進hBMMSCs的成骨分化，而下調miR- 21則抑制hBMMSCs的成骨分化。為了進一步驗證miR- 21對hBMMSCs體內成骨分化的影響，我們將表達不同水平miR- 21 的hBMMSCs與HA/TCP復合后植入裸鼠皮下，并觀察各組類骨質的形成情況。結果顯示，上調miR- 21組的類骨質形成量明顯多于對照組，而miR- 21抑制組的類骨質的形成量則明顯少于對照組。Eskildsen等(2011)利用基因芯片的方法篩選出了hBMMSCs成骨分化中下調的miR- 138，通過對miR- 138體外與體內成骨功能的研究發(fā)現(xiàn)，miR- 138能抑制hBMMSCs在體內和體外的成骨分化，并發(fā)現(xiàn)hBMMSCs在向其他中胚層組織分化中也出現(xiàn)miR- 21的表達下調；由此作者推測miR- 138可能與干細胞分化狀態(tài)的維持有關[7]。但本實驗中則發(fā)現(xiàn)，miR- 21對干細胞成骨分化的作用則與miR- 138相反。另有文獻報道，miR- 21在人脂肪來源的間充質干細胞成脂分化中表達上調，說明miR- 21能夠促進人脂肪來源的MSCs成脂分化[8-9]。以上結果均提示，miR- 21在干細胞分化過程中起到了重要作用。

miR- 21是一個具有多種功能的miRNAs， 并在多種生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，miR- 21幾乎在所有實體腫瘤中都過表達，并且能促進腫瘤細胞的增殖和遷移，因此miR- 21在腫瘤中得到了廣泛的研究[10-12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR- 21對心肌成纖維細胞也具有調控作用，并參與心血管疾病的發(fā)生[13]。雖然miR- 21也在多種正常組織中表達，但是對于它在生理狀況下的功能還研究甚少。Raymond Ng等[14](2012)發(fā)現(xiàn)，miR- 21能夠促小鼠肝臟的再生。本實驗中也發(fā)現(xiàn)，miR- 21在BMMSCs中過表達，并能促進hBMMSCs的成骨分化。但miR- 21是通過哪些靶基因來調控hBMMSCs成骨分化的，還需進一步深入的研究。

[1]Gao J,Yang T, Han J,etal. MicroRNA expression during osteogenic differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells from bone marrow[J].JCellBiochem, 2011,112(7): 1844-1856.

[2]Li H, Xie H, Liu W,etal. A novel microRNA targeting HDAC5 regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans[J].JClinInvest, 2009,119(12): 3666-3677.

[3]Mizuno Y, Tokuzawa Y, Ninomiya Y,etal. miR- 210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b[J].FEBSLett, 2009, 583(13): 2263-2268.

[4]Huang J,Zhao L,Xing L,etal. MicroRNA- 204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation[J].StemCells, 2010, 28(2): 357-364.

[5]Hassan MQ, Gordon JA, Beloti MM,etal. A network connecting Runx2, SATB2, and the miR- 23a～27a～24-2 cluster regulates the osteoblast differentiation program[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010, 107(46): 19879-19884.

[6]Luzi E, Marini F, Sala SC,etal. Osteogenic differentiation of human adipose tissue- derived stem cells is modulated by the miR- 26a targeting of the SMAD1 transcription factor[J].JBoneMinerRes, 2008, 23(2): 287-295.

[7]Eskildsen T, Taipaleenmaki H, Stenvang J,etal. MicroRNA-138 regulates osteogenic differentiation of human stromal (mesenchymal) stem cells in vivo[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,108(15): 6139-6144.

[8]Kim YJ, Hwang SH, Cho HH,etal. MicroRNA 21 regulates the proliferation of human adipose tissue- derived mesenchymal stem cells and high- fat diet- induced obesity alters microRNA 21 expression in white adipose tissues[J].JCellPhysiol, 2012, 227(1):183-193.

[9]Kim YJ, Hwang SJ, Bae YC,etal. MiR- 21 regulates adipogenic differentiation through the modulation of TGF- beta signaling in mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue[J].StemCells, 2009, 27(12):3093-3102.

[10]Krichevsky AM, Gabriely G.miR-21: a small multi- faceted RNA[J].JCellMolMed, 2009,13(1):39-53.

[11]Bhatti I, Lee A, James V,etal. Knockdown of microRNA- 21 inhibits proliferation and increases cell death by targeting programmed cell death 4 (PDCD4) in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].JGastrointestSurg, 2011, 15(1): 199-208.

[12]Schramedei K, Morbt N, Pfeifer G,etal. MicroRNA- 21 targets tumor suppressor genes ANP32A and SMARCA4[J].Oncogene, 2011, 30(26): 2975-2985.

[13]Thum T, Gross C, Fiedler J,etal. MicroRNA- 21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts[J].Nature, 2008, 456(7224): 980-984.

[14]Ng R, Song G, Roll GR,etal. A microRNA- 21 surge facilitates rapid cyclin D1 translation and cell cycle progression in mouse liver regeneration[J].JClinInvest, 2012,122(3):1097-1108.

MiR- 21 regulates osteogenesis of human marrow- derived mesenchymal stem cells

YANG Nan*, ZHOU Wei, WANG Guang, DING Yin, JIN Yan

(*DepartmentofStomatology,The309HospitalofPLA,Beijing100091,China)

AIM: To investigate the expression and the role of miR- 21 in osteogenesis of human marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMMSCs). METHODS: The expression level of miR- 21 after transfection of synthetic per-miR-21 was confirmed by real time RT- PCR. After 2 days of transfection, hBMMSCs were induced to osteoblast differentiation. ALP and Alizarin red S staining were used to determine osteogenic ability. Real time RT- PCR and western blot were used to analyze the estrogenic marker gene expression. hBMMSCs transfected with pre- miR- 21, anti- miR- 21 or miR control were loaded on hydroxyapatite- tricalcium phosphate scaffold and implanted s.c. in NOD/SCID mice. 8 weeks after transplantation HE staining and Masson's trichrome staining were used to observe the new bone formation. RESULTS: miR- 21 was increased during osteogenic differentiation of hBMMSCs. Gain- loss- functional analysis showed that up- regulation of miR- 21 promoted osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and in vivo. On the contrary, silencing of miR- 21 inhibited the osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and in vivo. CONCLUSION：miR- 21 can promote osteogenic differentiation of hBMMSCs in vitro and enhance ectopic bone formation in vivo.

miR- 21; human bone marrow- derived mesenchymal stem cells (hBMMSC); osteogenic differentiation

2014-05-25;

2015-01-07

國家自然科學基金(81020108019)

楊 楠(1982-)，女，滿族，北京人。 博士，主治醫(yī)師

丁 寅, E-mail: Dingying@fmmu.edu.cn

金 巖, E-mail: yanjin@fmmu.edu.cn

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0465-07