李馨剛 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132000)

研究表明，葛根素具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗氧化、降血糖等功能〔1～3〕。李娟等〔4〕表明，葛根素可以抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446的增殖;Yu等〔5〕的研究也證實(shí)，葛根素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，而葛根素對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用葛根素處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，觀察對(duì)其細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1材料 乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司;葛根素(純度 ＞99%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胰蛋白酶、優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)及Triton X-100購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蛋白抽提-RIPA裂解液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司;Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3單克隆抗體及內(nèi)參還原型輔酶(GAPDH)購(gòu)自美國(guó)Cell Sigaling Technology公司;二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京賽寶生物公司;其他試劑均為分析純。

1.2儀器 5417小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)自德國(guó)Eppendorf公司;Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽自美國(guó)Bio-Rad公司;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀自Thermo公司;TS100型顯微鏡自日本Nikon公司;FACS CaliburTM流式細(xì)胞儀自美國(guó)BD公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則，將已解凍的MCF-7細(xì)胞于含15%胎牛血清的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)(37℃、5%CO2飽和濕度)，每隔24 h更換培養(yǎng)基，鏡下觀察待達(dá)到80% ～90%融合，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，穩(wěn)定傳3～5代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以1×105/孔的密度接種培養(yǎng)板(96孔)，24 h后向培養(yǎng)基中加入葛根素，使終濃度依次為 0、20、50、100、200 μg/ml，其中以0 μmol/L為對(duì)照組，其余濃度則設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)條件(37℃、5%CO2飽和濕度)下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng) 24、48、72、96 h后向每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，4 h后在492 nm波長(zhǎng)下采用酶標(biāo)儀讀取各組吸光值(A)，增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。同一觀察時(shí)間點(diǎn)每個(gè)濃度重復(fù)3次。

1.3.3細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。按1×106/孔的密度將MCF-7細(xì)胞接種培養(yǎng)板(6孔)，24 h后向培養(yǎng)基中加入葛根素使終濃度依次為0、20、50、100、200 μg/ml，常規(guī)條件(37℃、5%CO2飽和濕度)下培養(yǎng)，24 h 后收集細(xì)胞并行磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，根據(jù)Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別加入Annexin V/FITC和PI，染色15 min后上機(jī)測(cè)定凋亡率及細(xì)胞周期。

1.3.4凋亡指數(shù)檢測(cè) 向預(yù)先置入培養(yǎng)板底部的滅菌小玻片接種MCF-7單細(xì)胞懸液，鏡下觀察待細(xì)胞貼壁后，加入葛根素，使終濃度依次為 0、20、50、100、200 μg/ml，培養(yǎng) 48 h 后采用多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS沖洗采用Hoechst 33258(5 μg/ml)，室溫下避光染色，30 min后于熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)片子隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.5免疫印跡 收集 0、20、50、100、200 μg/ml葛根素處理48 h后的MCF-7細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，向細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液，于冰上采用裂解后，測(cè)定蛋白濃度(BCA法)，每個(gè)樣本取定量蛋白，與上樣緩沖液混合后，常規(guī)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，根據(jù)膜大小加入適量一抗，除Bax的稀釋比例為1∶100外，其余均為1∶200，4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后加入二抗(1∶3 000)，室溫2 h后行ECL顯色，采用Gel-Pro analyzer軟件分析各條帶光密度，以目的蛋白與GAPDH光密度的比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q法。

2結(jié)果

2.1不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 葛根素可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖活性，除20 μg/ml葛根素作用24 h外，各濃度作用24、48、72、96 h后的增殖抑制率均高于0 μg/ml(P ＜0.05)，且 20、50、100、200 μg/ml組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);總體上葛根素可呈劑量和時(shí)間依賴的方式提高增殖抑制率(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制情況

2.2不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 葛根素可提高 MCF-7 細(xì)胞的早期、晚期凋亡率，20、50、100、200 μg/ml的早期、晚期凋亡率均高于0 μg/ml(P＜0.05)，且各濃度組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);同時(shí)，葛根素可提高M(jìn)CF-7細(xì)胞的凋亡指數(shù)，隨葛根素濃度的增加，凋亡指數(shù)升高，且各濃度間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表2 不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響(x ± s，%)

2.3不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 葛根素可降低S期及G2/M期細(xì)胞比例，提高G0/G1期細(xì)胞比例，各濃度間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響(x ± s，%)

2.4不同濃度葛根素對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 葛根素可降低Bcl-2蛋白水平，且升高Bax和Cleaved caspase-3的蛋白水平，各濃度間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響(s)

表4 不同濃度葛根素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響(s)

濃度(μg/ml)Bcl-2 Bax Cleaved caspase-3 0 0.65±0.07 0.24±0.05 0.27±0.05 20 0.54±0.051) 0.31±0.061) 0.36±0.021)50 0.43±0.031)2) 0.44±0.041)2) 0.45±0.031)2)100 0.31±0.041)2)3)0.52±0.021)2)3)0.53±0.041)2)3)200 0.22±0.031)2)3)4)0.61±0.031)2)3)4)0.65±0.031)2)3)4)

3討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類生命和健康，其發(fā)病率和死亡率在許多國(guó)家和地區(qū)均高居首位〔6〕。腫瘤的化學(xué)治療同手術(shù)治療和放療一樣，已成為治療腫瘤的重要手段之一，然而目前使用的腫瘤化療藥物常伴有嚴(yán)重的副作用，如疼痛、嘔吐、脫發(fā)、進(jìn)食困難等〔7〕。近年來(lái)，從傳統(tǒng)中藥中篩選抗腫瘤先導(dǎo)化合物及抗腫瘤活性成分逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，來(lái)源于植物藥的抗癌制劑已超過(guò)總抗癌藥物的30%，其中紫杉醇、長(zhǎng)春新堿和喜樹(shù)堿等已成為許多腫瘤治療的首選藥〔8〕。

本研究提示葛根素可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期紊亂是癌細(xì)胞的基本特征，而抗癌效果或增敏劑一般通過(guò)影響細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮抗癌作用〔9〕。本研究亦發(fā)現(xiàn)葛根素可影響MCF-7的細(xì)胞周期，葛根素可將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。除細(xì)胞過(guò)度增殖與細(xì)胞周期異常外，惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡減少亦有關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理細(xì)胞相比，葛根素處理后的MCF-7細(xì)胞凋亡率、凋亡指數(shù)及凋亡促進(jìn)基因的蛋白水平均上調(diào)，而凋亡抑制基因的表達(dá)下降，以上表明葛根素可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡。該作用可能與提高凋亡促進(jìn)蛋白表達(dá)、降低凋亡抑制蛋白表達(dá)有關(guān)。

1 Zhang H，Zhang L，Zhang Q，et al.Puerarin:a novel antagonist to inward rectifier potassium channel(IK1)〔J〕.Mol Cell Biochem，2011;352(1-2):117-23.

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3 Li Z，Shangguan Z，Liu Y，et al.Puerarin protects pancreatic β-cell survival via PI3K/Akt signaling pathway〔J〕.J Mol Endocrinol，2014;53(1):71-9.

4 李 娟，胡永華.葛根素對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞周期和相關(guān)周期蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中草藥，2008;39(10):1535-7.

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6 徐 珊，徐昌芬.腫瘤多藥耐藥性發(fā)生機(jī)制及中藥逆轉(zhuǎn)作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2006;13(6):404-11.

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