高向楠 柴 芳 趙樹(shù)鵬 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

目前對(duì)2型糖尿病(T2DM)的治療以內(nèi)科方式為主，如控制飲食、增加運(yùn)動(dòng)、口服各種降糖藥及注射胰島素等，但血糖控制不理想遠(yuǎn)期效果差。胃旁路術(shù)(RYGB)手術(shù)治療T2DM，術(shù)后短期就可控制血糖、降低體重且遠(yuǎn)期效果較好〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)RYGB可以改善T2DM患者胰島β細(xì)胞凋亡程度〔2〕，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究觀察RYGB術(shù)后β-catenin及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相關(guān)凋亡蛋白caspase-12的表達(dá)，探討RYGB對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與藥品 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)買于Sigma生物公司，β-catenin、caspase-12抗體、胰島細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2T2DM動(dòng)物模型建立和分組 健康雄性SD大鼠60只，10周齡，體重210～243 g(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。所有大鼠清潔級(jí)飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度40%左右，12 h光照，自由進(jìn)食水，適應(yīng)環(huán)境3 d后隨機(jī)分成正常對(duì)照組(C組)，糖尿病控制大鼠手術(shù)組(RYGB)和假手術(shù)組(S-RYGB)各20只。糖尿病組大鼠給予高脂飼料(50%脂肪，10%碳水化合物，2%膽固醇和5%正常食物)飼養(yǎng)3 w，于2 w時(shí)腹腔注射STZ(25 mg/kg)。20只正常SD大鼠作為健康組給予同等量的鹽水注射。2型糖尿病大鼠在注射STZ 3 d后測(cè)量空腹血糖≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定1 w為造模成功〔3〕。成模大鼠(RYGB組17只、S-RYGB組15只)和C組同條件下飼養(yǎng)。

1.3RYGB模型制作 手術(shù)組大鼠術(shù)前12 h禁食，采用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重經(jīng)腹腔給藥麻醉。RYGB組取腹正中做4 cm長(zhǎng)切口，逐層入腹。胃大小彎間進(jìn)行離斷，保留賁門(mén)附近約20%胃體并保護(hù)迷走神經(jīng)，距十二指腸懸韌帶下方約10 cm處橫斷空腸，遠(yuǎn)端上提與殘胃吻合，在距吻合口約10 cm處行空腸近端與空腸端側(cè)吻合。C組和S-RYGB組分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，與手術(shù)組相同操作開(kāi)腹，行胃切開(kāi)術(shù)在胃前壁做7 mm切口后予以縫合。所有大鼠吻合口均用6-0無(wú)損傷線縫合，理順腸道后用青霉素(40 000 U/kg)和生理鹽水沖洗腹腔，并給予適量生理鹽水補(bǔ)液后關(guān)腹。術(shù)后禁食2 d后給予正常飲食，禁食期間給予10%葡萄糖溶液口服。所有大鼠飼養(yǎng)4 w后處死。

1.4血糖、體重檢測(cè) 測(cè)量術(shù)前和術(shù)后1、2、3、4 w大鼠空腹血糖和體重，測(cè)定空腹血糖前需禁食12 h。

1.5TUNEL檢測(cè)胰島β細(xì)胞凋亡率 處死大鼠后分離胰腺組織，測(cè)定胰島細(xì)胞凋亡率，按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。用DAB顯色凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。每份樣品高倍鏡下隨機(jī)選取視野(×400)，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核，計(jì)算胰島細(xì)胞凋亡率。

1.6免疫組化檢測(cè)胰腺組織β-catenin、caspase-12蛋白表達(dá)胰腺組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，石蠟組織4 μm切片后使用二甲苯和梯度乙醇(由高到低)依次脫蠟和水化，切片使用枸櫞酸鈉溶液進(jìn)行抗原修復(fù)。冷卻至室溫后滴加封閉液，按SABC檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。陽(yáng)性結(jié)果為胞質(zhì)/膜出現(xiàn)棕黃色區(qū)域。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分級(jí)。染色程度:基本不著色為0分;染色淡者為1分;著色適中者為2分;著色深者為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比:著色細(xì)胞數(shù)占計(jì)數(shù)細(xì)胞＜5%為0分;6% ～25%為1分;26% ～50%為2分;≥51%為3分。將每張切片著色程度和著色細(xì)胞百分比得分相加，最后得分0～3分為陰性表達(dá)，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1存活率 C組死亡5只，存活率75%，3只因?yàn)閭诹验_(kāi)于術(shù)后4 d死亡，2只因?yàn)槟c壞死于術(shù)后3～5 d死亡;RYGB組死亡3只，存活率82%，2只因?yàn)樾g(shù)后吻合口漏引起腹膜炎，于術(shù)后第1～3天死亡，1只因小腸壞死于術(shù)后4 d死亡;S-RYGB組死亡2只，存活率87%，均因小腸壞死于術(shù)后5 d死亡。

2.2體重變化 術(shù)后1 w各組大鼠體重均下降，術(shù)后2 w起RYGB組體重降低顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)C組和S-RYGB組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3空腹血糖變化 RYGB組術(shù)后第1周空腹血糖值已開(kāi)始下降，術(shù)后第4周空腹血糖值為(3.9±0.7)mmol/L，明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)S-RYGB組(P＜0.05)。S-RYGB組、C組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空腹血糖值無(wú)明顯改變。見(jiàn)表1。

2.4術(shù)后TUNEL法測(cè)胰島β細(xì)胞凋亡率 RYGB組大鼠胰島細(xì)胞凋亡率術(shù)后4 w為(4.01±0.39)%，明顯低于同時(shí)間SRYGB組〔17.94±0.53)%，P＜0.05〕。C組胰島細(xì)胞凋亡率為(3.56±0.36)%。見(jiàn)圖1。

2.5術(shù)后免疫組化檢測(cè)凋亡蛋白β-catenin、caspase-12的表達(dá)術(shù)后4 w β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率在RYGB組、S-RYGB組和C組分別為78.5%、30.8%和60.0%;RYGB組與S-RYGB組比較有差異(P=0.021)，與C組比較無(wú)差異(P=0.427)。術(shù)后4 w caspase-12陽(yáng)性表達(dá)率在RYGB組、S-RYGB組和C組的分別為35.7%、84.6%和33.3%;RYGB組與S-RYGB組比較有差異(P=0.018)，與C組比較無(wú)差異(P=1.000)。見(jiàn)圖2、圖3。

表1 三組大鼠體重的比較(s)

表1 三組大鼠體重的比較(s)

與同時(shí)間點(diǎn)S-RYGB組比較:1)P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn)C組比較:2)P＜0.05

組別 n 體重(g)空腹血糖(mmol/L)4 w RYGB組 14 277.5±15.9 240.4±12.9229.5±10.51)2)235.0±14.31)2)238.0±16.61)2)17.6±0.6 11.5±1.4 6.3±0.8 5.5±0.7 3.9±0.71)術(shù)前 術(shù)后1 w 術(shù)后2 w 術(shù)后3 w 術(shù)后4 w 術(shù)前 術(shù)后1 w 術(shù)后2 w 術(shù)后3 w 術(shù)后S-RYGB組 13 273.3±20.8 258.9±14.9 272.9±15.1 286.9±18.6 304.3±25.6 17.5±0.7 15.6±0.8 15.3±0.7 15.4±0.8 15.5±1.0 C組 15 274.5±17.8 265.5±13.2 280.0±22.8 310.8±24.4 325.0±15.8 3.7±0.4 3.5±0.3 3.7±0.2 3.6±0.3 3.5±0.4 P值 0.771 0.111 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 術(shù)后胰島TUNEL染色結(jié)果(×400)

圖2 胰島β細(xì)胞β-catenin蛋白免疫組化結(jié)果(DAB，×400)

圖3 胰島β細(xì)胞caspase-12蛋白免疫組化結(jié)果(DAB，×400)

3討論

在2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中胰島β細(xì)胞功能受損起著重要的作用〔4〕。造成胰島β細(xì)胞功能受損的眾多因素中，細(xì)胞凋亡是胰島β細(xì)胞功能減低的主要因素之一。傳統(tǒng)治療只能單純控制血糖，對(duì)減緩胰島細(xì)胞凋亡作用不顯著，而RYGB不僅能夠迅速降低體重，長(zhǎng)期控制血糖，而且能減少胰島細(xì)胞凋亡，但具體的機(jī)制尚不清楚〔5〕。

β-catenin是wnt通路里的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上升可引起增殖相關(guān)基因(如TCF/LEF)表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞增殖〔6〕。在細(xì)胞質(zhì)中β-catenin與Axin、GSK3和APC等結(jié)合成無(wú)活性復(fù)合體，當(dāng)wnt通路激活時(shí)，復(fù)合體解體，β-catenin不能被磷酸化而分解，從而進(jìn)入細(xì)胞核引起核表達(dá)促使細(xì)胞發(fā)生增殖〔7〕。有文獻(xiàn)〔8〕指出胰島內(nèi)wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)血糖以及能量平衡起著重要作用。敲除β-catenin基因的胰腺中，β細(xì)胞數(shù)量銳減，糖耐量立刻損壞引起高糖，而高糖又可以抑制wnt信號(hào)的表達(dá)，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子β-catenin，同時(shí)促發(fā)caspase活化以增加細(xì)胞凋亡〔9〕;且RYGB干預(yù)后，糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率可能恢復(fù)到正常胰島凋亡水平。

caspase-12是ER應(yīng)激標(biāo)志性分子，介導(dǎo)非依賴性線粒體的細(xì)胞凋亡。活化的caspase-12可以直接通過(guò)細(xì)胞色素C非依賴途徑引起細(xì)胞凋亡〔10〕，因此其可以作為檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一個(gè)很好的蛋白。caspase-12和ER應(yīng)激有關(guān)，而肥胖、高糖及胰島細(xì)胞過(guò)度分泌使胰島β細(xì)胞內(nèi)ER過(guò)度負(fù)荷，引起細(xì)胞凋亡〔11〕。國(guó)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)胃旁路術(shù)可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善胰島細(xì)胞生成環(huán)境，減少胰島細(xì)胞凋亡〔12〕。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們觀察到在糖尿病陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠維持較高血糖的同時(shí)胰島細(xì)胞胞質(zhì)里存在大量的caspase-12蛋白，且胰島細(xì)胞凋亡增多;相反的情況出現(xiàn)在糖尿病RYGB手術(shù)組和C組里。由此我們推測(cè)RYGB通過(guò)減輕ER應(yīng)激，調(diào)節(jié)caspase-12表達(dá)來(lái)參與胰島β細(xì)胞凋亡，并有效的控制血糖。

本實(shí)驗(yàn)血液生化學(xué)檢查和病理形態(tài)結(jié)果表明，RYGB能夠顯著降低糖尿病大鼠的血糖，并能夠改善胰島功能，減少胰島凋亡，對(duì)胰島起到保護(hù)作用。wnt/β-catenin通路和caspase-12在分別參與胰島細(xì)胞凋亡的同時(shí)，它們之間也可能存在一些因子進(jìn)行二者相互的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。wnt/β-catenin和caspase-12的關(guān)系及其參與胰島凋亡的具體機(jī)制還需深入研究。

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