張莉亞 苗 青 李益明 葉紅英

（復旦大學附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 200040）

肥胖及其相關(guān)性疾病嚴重威脅著人類健康。肥胖主要的病理生理改變?yōu)橹炯毎龃蟆⒅窘M織分泌功能異常、巨噬細胞浸潤等，是肥胖致胰島素抵抗的重要因素。但肥胖致胰島素抵抗的始動因素、巨噬細胞浸潤增加的機制尚未完全闡明。

肥胖狀況下，白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）的分泌功能發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為炎性介質(zhì)分泌顯著增加和具有抗炎作用的脂聯(lián)素分泌減少，被認為是肥胖致胰島素抵抗的機制之一［1］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，肥胖時這些炎性介質(zhì)主要由浸潤于脂肪組織的巨噬細胞分泌［2］。在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織是局部持續(xù)性激活巨噬細胞的炎癥部位，表現(xiàn)為巨噬細胞特征性地圍繞個別脂肪細胞成冠狀而不是分散在脂肪細胞間，被巨噬細胞圍繞的脂肪細胞呈特征性縮小［3－4］。

2007年，Ye等［5－6］首次發(fā)現(xiàn)ob／ob小鼠和高脂飲食誘導肥胖（diet－induced obesity，DIO）小鼠的脂肪組織存在局部缺氧并伴隨炎性因子表達增加和脂聯(lián)素表達降低。此后有多項研究在肥胖模型鼠及肥胖人群中都證實了其脂肪組織存在缺氧的現(xiàn)象［7－14］。Rausch等［13］證實高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖小鼠的脂肪組織存在局部缺氧，且缺氧區(qū)域出現(xiàn)包繞脂肪細胞的F4／80陽性的巨噬細胞浸潤。但肥胖時脂肪組織缺氧是否是胰島素抵抗、巨噬細胞浸潤的始動因素仍不明確。

因此，我們利用DIO小鼠模型，動態(tài)觀察高脂飲食（high－fat diet，HFD）小鼠各時間點（4、8、12 w）病理生理特點的動態(tài)變化，明確缺氧是否為肥胖時脂肪組織胰島素抵抗和巨噬細胞浸潤的始動因素。

材料和方法

藥品與試劑 超敏小鼠胰島素ELISA試劑盒購自瑞典Mercodia公司；4%甲醛溶液、二甲苯、無水乙醇、伊紅、蘇木精均購自上?；び邢薰?；F4／80單抗購自美國 R＆D公司；hypoxyprobeTM－1試劑盒購自美國Chemicon公司。

實驗動物 SPF級4周齡C57BL／6J雄性小鼠60只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，按照SPF（無特定病原體動物）級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)，標準飼料（10%熱卡來自脂肪）及高脂飼料（60%熱卡來自脂肪）購自美國Research Diets公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為標準飼料組（CON）和HFD組，每組各30只。每周監(jiān)測攝食量、體質(zhì)量、空腹血糖。飲食干預后第4、8、12周時間點，兩組小鼠禁食不禁水6 h后稱重，進行實驗，并在上述時間點處死CON組及HFD組小鼠各10只。

腹腔注射葡萄糖耐量實驗評價小鼠糖代謝 采用50%注射用葡萄糖，按2．5 g／kg體質(zhì)量進行腹腔注射。注射前和注射后15、30、60、90 min分別尾尖采全血，用拜耳拜安易血糖儀測定血糖（德國拜耳公司，檢測高限30．5 mmol／L，血糖顯示高者按30．5 mmol／L計算。腹腔注射葡萄耐量實驗（intraperitioneal ghrcose tolerance test，ipGTT）曲線下面積計算公式：AUCipGTT（min·mmol／L）＝30 min×［1／2×（BG0＋BG90）＋1×（BG15＋BG30＋BG60）］。

評價WAT量及其與體質(zhì)量的比值 ipGTT2日后禁食不禁水6 h，摘眼球取血后，分離附睪脂肪，記錄重量，4%甲醛溶液固定，液氮凍存。分離血樣得血清后－80℃凍存待用。

ELISA檢測血清胰島素 根據(jù)胰島素試劑盒操作手冊測定血清胰島素水平，并依據(jù)HOMA模型計算胰島素抵抗指數(shù) HOMA－IR，HOMA－IR＝FBG （mmol／L）×FINS（μg／L）／22．5。

鏡下觀察脂肪細胞大小 取兩組小鼠的附睪脂肪組織，4%甲醛溶液（pH＝7．0）固定后，進行組織處理、石蠟包埋、切片，HE染色。用Image pro plus（IPP）6．0軟件分析脂肪細胞的平均直徑，以分析不同時間點脂肪細胞大小的動態(tài)變化。

免疫組化染色檢測脂肪組織巨噬細胞浸潤 取兩組小鼠的附睪脂肪組織石蠟切片，用巨噬細胞特異性標記物F4／80抗體進行免疫組化，DAB顯色，以顯示脂肪組織中的巨噬細胞。

免疫組化染色檢測脂肪組織缺氧情況 采用hypoxyprobeTM－1試劑盒對兩組小鼠的附睪脂肪組織石蠟切片進行哌莫硝唑標記的免疫組化，DAB顯色，以檢測細胞缺氧情況。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11．5軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組之間采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料，兩組間采用Wilcoxon檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量的動態(tài)變化HFD組與CON組小鼠的基礎(chǔ)體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．5029）；隨著喂養(yǎng)時間延長，兩組小鼠體質(zhì)量均增加；4周時間點兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．2153）；8周時間點HFD組體質(zhì)量顯著高于CON組（P＜0．001），12周時間點兩組體質(zhì)量差異進一步增大（表1）。

表1 不同時間點HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量比較Tab 1 Comparison of body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表1 不同時間點HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量比較Tab 1 Comparison of body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

BW （g）CON group HFD group P 0wk 15．1±1．05 15．3±1．24 0．502 9 4 wk 25．7±1．06 26．5±1．66 0．215 3 8 wk 27．1±1．97 34．7±3．06 0 12 wk 29．2±1．40 40．2±2．70 0

HFD組和CON組小鼠WAT重量與體質(zhì)量比值的動態(tài)變化 CON組附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值（Wepi／BW）在各時間點均無明顯變化，而HFD組進行性增加。兩組相比，HFD組 Wepi／BW在4周時間點即顯著高于CON組（P＜0．001），在8周和12周時間點兩組差異進一步增大（表2）。如果按脂肪比例增加為判斷標準，HFD組在HFD4周時即已出現(xiàn)肥胖。

表2 不同時間點HFD組和CON組小鼠附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值比較Tab 2 Comparison of the ratio of epididymal fat weight to body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表2 不同時間點HFD組和CON組小鼠附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值比較Tab 2 Comparison of the ratio of epididymal fat weight to body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

Wepi／BW （%）CON group HFD group P 4 wk 1．17±0．25 2．90±0．81 0 8 wk 1．16±0．31 5．15±0．75 0 12 wk 1．28±0．30 5．37±0．77 0

HFD組和CON組小鼠糖耐量及胰島素抵抗水平的動態(tài)變化 4周時間點HFD組的AUCipGTT即顯著高于CON組（P＜0．001），提示4周時間點即已經(jīng)存在明顯糖耐量異常；在8和12周時間點兩組間糖耐量差異進一步增大（表3）。4周時間點，兩組間HOMA－IR水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．505 1）；8周時間點 HFD組 HOMA－IR水平顯著高于CON組（P＜0．001），12周時間點兩組HOMA－IR水平的差異進一步增大（表4）。

表3 不同時間點HFD組和CON組小鼠的AUCipaTT比較Tab 3 Comparison of AUCipGTTat different weeks of HFD group and CON group （±s）

表3 不同時間點HFD組和CON組小鼠的AUCipaTT比較Tab 3 Comparison of AUCipGTTat different weeks of HFD group and CON group （±s）

AUCipGTT（min·mmol／L）CON group HFD group P 4 wk 58．62±7．41 85．075±7．88 0 8 wk 55．595±9．85 99．845±9．24 0 12 wk 54．505±9．34 103．52±15．14 0

表4 不同時間點HFD組和CON組小鼠的胰島素抵抗水平比較Tab 4 Comparison of HOMA－IR at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表4 不同時間點HFD組和CON組小鼠的胰島素抵抗水平比較Tab 4 Comparison of HOMA－IR at different weeks of HFD group and CON group （±s）

HOMA－IR CON group HFD group P 4 wk 0．8±0．22 0．72±0．3 0．5051 8 wk 0．52±0．29 1．9±0．69 0 12 wk 0．81±0．23 3．03±1．37 0

HFD組和CON組小鼠脂肪細胞體積的動態(tài)變化 在不同時間點，CON組脂肪細胞的直徑無明顯變化，而HFD組進行性增大。4周時間點HFD組附睪脂肪組織的細胞大小即大于CON組，在8和12周時間點兩組脂肪細胞大小的差異進一步增大（圖1）。

HFD組和CON組小鼠脂肪組織巨噬細胞浸潤的動態(tài)變化 F4／80為巨噬細胞的特異性標記物，經(jīng)免疫組織化學染色，表達F4／80的巨噬細胞內(nèi)可見黃褐色顆粒沉淀，而其他細胞則不被染色。在12周時HFD組附睪脂肪組織F4／80陽性染色的巨噬細胞浸潤較CON組增加，且呈聚集現(xiàn)象，包繞一個直徑明顯小于周圍細胞的脂肪細胞（圖2）。

HFD組和CON組小鼠脂肪組織脂肪組織缺氧狀況的動態(tài)變化 12周時間點HFD組哌莫硝唑陽性染色的脂肪細胞較CON組增加，證實HFD組小鼠附睪脂肪組織局部存在缺氧，而在4和8周時間點未顯示哌莫硝唑陽性染色（圖3）。

討 論

圖1 不同時間點HFD組和CON組小鼠附睪脂肪細胞大小Fig 1 The size of adipose cells of epididymal fat at different weeks of HFD group and CON group

圖2 不同時間點HFD組和CON組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)巨噬細胞浸潤情況Fig 2 The macrophage infiltration into epididymal fat at different weeks of HFD group and CON group

DIO小鼠模型被廣泛用于肥胖和胰島素抵抗為特點的代謝綜合征及相關(guān)疾病的研究。本研究選用60%熱卡來自脂肪的高脂喂養(yǎng)5周齡C57BL／6J小鼠，利用簡單的動態(tài)觀察有效地展現(xiàn)了DIO小鼠的體質(zhì)量、WAT重量與體質(zhì)量的比值、糖耐量及胰島素抵抗狀況、缺氧、脂肪組織巨噬細胞浸潤的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，盡管4周時HFD組小鼠的體質(zhì)量無顯著升高，但已出現(xiàn)脂肪細胞直徑增大及Wepi／BW顯著升高。而脂肪組織比例的增加正是肥胖的關(guān)鍵要素，如果按脂肪比例增加為判斷標準，HFD組在4周時即已肥胖；在8和12周時HFD組小鼠的平均體質(zhì)量較對照組分別增高28%和37．7%，達到了體質(zhì)量增加20%的肥胖建模標準。另外，4周時HFD組小鼠的AUGCipGTT即顯著高于對照組，提示在4周時即已存在明顯的糖耐量異常；在8周時HFD組小鼠HOMA－IR水平較對照組顯著升高，提示在8周時存在明顯的胰島素抵抗。

哌莫硝唑因其特殊的化學性質(zhì)可以作為缺氧化學探針，哌莫硝唑在缺氧環(huán)境（PO2＜10 mmHg）中和蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生新蛋白質(zhì)化合物［7］，標記這些新生成的蛋白質(zhì)并根據(jù)標記信號的強弱可反映缺氧狀況。F4／80是巨噬細胞的特異性表達抗原，利用F4／80抗體對脂肪組織行免疫組化染色可以將巨噬細胞與其他脂肪組織間質(zhì)細胞鑒別［4］。本研究分別用哌莫硝唑和F4／80為標記對DIO小鼠的附睪脂肪組織進行了免疫組化染色。我們的研究結(jié)果顯示，脂肪組織缺氧和巨噬細胞浸潤增加同步出現(xiàn)在HFD后12周時間點，遲于糖代謝異常和胰島素抵抗的出現(xiàn)。

圖3 不同時間點HFD組和CON組小鼠附睪脂肪組織缺氧情況Fig 3 The existence of hypoxia of epididymal fat at different weeks of HFD group and control group

Ye等［5］僅對肥胖模型的12周時間點進行了觀察，只能觀察到胰島素抵抗、脂肪因子分泌變化、巨噬細胞浸潤、缺氧等病理生理變化同時存在，提示了相關(guān)性，但卻無法回答其中可能的因果關(guān)系。Elias等［15］發(fā)現(xiàn)過表達血管內(nèi)皮生長因子的脂肪組織可通過增加氧供而改善胰島素抵抗，但并未闡明缺氧是否啟動了胰島素抵抗的發(fā)生。而我們的研究通過動態(tài)觀察提示了各種病理生理改變的時間先后關(guān)系，至少可以得出結(jié)論---缺氧可能不是HFD致糖代謝異常和胰島素抵抗的啟動因素。

巨噬細胞作為炎性因子的經(jīng)典來源，其在肥胖和代謝疾病發(fā)生機制中的作用已越來越受到關(guān)注。多項研究表明，只有在肥胖個體的脂肪組織中才出現(xiàn)巨噬細胞浸潤而正常個體并沒有這種現(xiàn)象［4，16］。在肥胖發(fā)展過程中，脂肪組織中的巨噬細胞浸潤呈漸進性，其數(shù)量甚至可達到脂肪組織細胞總數(shù)的40%，而這種增多與胰島素抵抗密切相關(guān)［17］。相反，體質(zhì)量減輕則會減少巨噬細胞浸潤、改善胰島素抵抗［18］。此外，采用特異性基因敲除阻斷巨噬細胞的炎癥信號通路也可改善肥胖小鼠的胰島素抵抗［19］。然而，對于造成肥胖個體脂肪組織巨噬細胞浸潤的原因，目前尚不明確，可能與脂肪細胞增生與肥大導致的脂肪細胞因子異常分泌、局部脂肪組織缺氧狀態(tài)及營養(yǎng)性內(nèi)毒素血癥有關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織缺氧和巨噬細胞浸潤增加同步出現(xiàn)在同一時間點，提示缺氧與巨噬細胞浸潤相關(guān)，前者可能是后者的原因、伴隨現(xiàn)象或加重因素。

為了進一步研究脂肪組織缺氧與巨噬細胞浸潤的關(guān)系，我們后續(xù)建立了體外間歇缺氧的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)體外間歇缺氧改變脂肪組織多種脂肪因子基因表達但脂肪組織內(nèi)巨噬細胞并未增加。此外，我們開展的體外試驗發(fā)現(xiàn)，與正常培養(yǎng)相比，體外缺氧（1%O2）環(huán)境下的脂肪細胞培養(yǎng)液對單核細胞的趨化作用未增加。以上研究結(jié)果提示肥胖時脂肪組織缺氧可能并非巨噬細胞浸潤的始動因素。但缺氧與肥胖時脂肪組織巨噬細胞浸潤的關(guān)系仍待進一步研究。

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