喬 可 崔士超 胡捷先 陳獻(xiàn)華

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部／衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032）

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸可塑性和介導(dǎo)突觸興奮性活動(dòng)等方面發(fā)揮著重要的作用，對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、分化、遷移、成熟、修復(fù)等具有重要的影響［1］。但在病理情況下，過多谷氨酸積聚可導(dǎo)致谷氨酸受體的過度激活引起鈣超載，從而激活神經(jīng)毒性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。目前認(rèn)為谷氨酸興奮毒性與多種神經(jīng)元退行性疾病的神經(jīng)元丟失有關(guān)，包括阿爾茨海默病、帕金森綜合征、亨廷頓氏疾病、多發(fā)性硬化癥等［2－3］。研究證實(shí)，谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡模型具有良好的可重復(fù)性，可作為研究神經(jīng)元凋亡的可靠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?－5］。因此，建立和評(píng)價(jià)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，對(duì)研究神經(jīng)損傷和退行性疾病有重要意義。

高內(nèi)涵篩選（high－content screening，HCS）分析系統(tǒng)是利用顯微成像及圖像分析技術(shù)，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，實(shí)時(shí)快速檢測(cè)樣品多維立體的生物效應(yīng)信息，在單個(gè)細(xì)胞／亞細(xì)胞水平獲取樣品生物學(xué)變化的多元化數(shù)據(jù)，包括單細(xì)胞圖像和各項(xiàng)指標(biāo)、細(xì)胞群體的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果、細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)改變、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、熒光信號(hào)隨時(shí)間和空間的變化等［6－7］。該分析系統(tǒng)不僅能夠像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀那樣進(jìn)行群體分析，而且還可以對(duì)群體分析中具有特定數(shù)值特征的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察和數(shù)值檢測(cè)。神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a是小鼠神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞，因其易于轉(zhuǎn)染并大量表達(dá)微管蛋白等特點(diǎn)，在神經(jīng)細(xì)胞分化、軸突生長(zhǎng)及信號(hào)通路領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［8］。

本實(shí)驗(yàn)利用HCS技術(shù)，分析不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡比例；并結(jié)合活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)，跟蹤谷氨酸誘導(dǎo)不同時(shí)間下的N2a凋亡的形態(tài)學(xué)變化特征以及N2a凋亡過程的各項(xiàng)指標(biāo)，包括凋亡過程中細(xì)胞核的凝縮過程以及細(xì)胞核碎片化的過程。

材料和方法

儀器和試劑 HCS分析系統(tǒng)（Perkin Elmer Operetta）；Annexin V－FITC／PI試劑盒（BD），Hoechst 33342（Sigma），NucRed Live 647（Life Technologies）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Fisher Scientific）。

細(xì)胞培養(yǎng) N2a細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基（Gibco）中通氣培養(yǎng)（37℃、5%CO2）。每3天以0．05%胰酶消化，按1∶5的比例傳代。

谷氨酸處理細(xì)胞 將細(xì)胞接種于96孔板，每孔含100μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后每孔加入不同濃度谷氨酸（250、500、750、1 000μg／mL）處理24 h，對(duì)照孔不加谷氨酸。

細(xì)胞熒光標(biāo)記 谷氨酸處理24 h后，96孔板每孔100μL細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1μL Annexin VFITC、1μL PI、1μL Hoechst 33342，輕輕混勻置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育30 min后置于HCS系統(tǒng)。細(xì)胞凋亡形態(tài)實(shí)時(shí)追蹤選擇谷氨酸濃度750μg／mL處理20 h的N2a細(xì)胞，用NucRed Live 647和Annexin V－FITC標(biāo)記。

圖像獲取、處理和數(shù)據(jù)分析 分別使用60×、20×、40×物鏡（LWD），每孔選取10個(gè)視野分FITC、PI和Hoechst 33342等3個(gè)熒光通道拍攝圖片，熒光光源為250 W連續(xù)氙燈。恒溫37℃、5%CO2下連續(xù)拍攝活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像圖片。每隔0．5 h拍攝FITC和NucRed Live 647等2個(gè)熒光通道圖片，連續(xù)采集記錄6 h Time－lapse圖像，從T0～T12。同時(shí)啟動(dòng)系統(tǒng)遠(yuǎn)紅外激光自動(dòng)對(duì)焦功能，防止長(zhǎng)時(shí)間拍攝過程中焦點(diǎn)的漂移和維持焦平面穩(wěn)定。

使用HCS系統(tǒng)Operetta中的Columbus軟件來獲取圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行參數(shù)調(diào)整以及生成顯微縮時(shí)序列圖，通過Hoechst 33342或NucRed Live 647找到細(xì)胞核，分別計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、FITC熒光強(qiáng)度和早期凋亡細(xì)胞比例、胞核NucRed Live 647熒光染色面積以及熒光強(qiáng)度變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），CV＝（標(biāo)準(zhǔn)差÷平均值）×100%。對(duì)于谷氨酸對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的影響和谷氨酸誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)追蹤，各重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每孔統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)為417～1 176個(gè)，使用Excel結(jié)合SigmaPlot軟件計(jì)算±s并作二維折線圖。組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

谷氨酸對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的影響 在N2a細(xì)胞凋亡的檢測(cè)中，Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色），Annexin V－FITC標(biāo)記胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（綠色），PI標(biāo)記胞膜完整性被破壞的凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞的胞核（紅色）。于谷氨酸處理24 h后，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入上述染色劑，利用HCS技術(shù)捕捉和分析細(xì)胞凋亡不同階段的特征，并統(tǒng)計(jì)不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的比例。

谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡在不同階段的特征 谷氨酸處理N2a細(xì)胞24 h后，利用HCS技術(shù)可以捕捉到細(xì)胞凋亡在不同階段的特征。其中，未發(fā)生凋亡的細(xì)胞僅胞核被Hoechst 33342染色（藍(lán)色）（圖1A）；細(xì)胞凋亡早期胞核被 Hoechst 33342染色（藍(lán)色），胞膜被 AnnexinV－FITC染色（綠色）（圖1B）；細(xì)胞凋亡中晚期胞核同時(shí)被 Hoechst 33342（藍(lán)色）和PI（紅色）染色，胞膜被AnnexinVFITC染色（綠色）（圖1C、D）。

圖1 谷氨酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡在不同階段的特征圖像（×60）Fig 1 Characteristic images of N2acells at different apoptotic periods induced by glutamate（×60）

不同谷氨酸濃度誘導(dǎo)對(duì)N2a細(xì)胞早期凋亡比例的影響 隨著谷氨酸誘導(dǎo)濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞比例逐漸增加。當(dāng)谷氨酸濃度為750μg／mL時(shí)，早期凋亡細(xì)胞比例達(dá)到峰值42．07%；當(dāng)谷氨酸濃度為1 000μg／mL時(shí)，早期凋亡細(xì)胞比例開始減少（圖2、3）。這可能與較高濃度谷氨酸誘導(dǎo)下直接進(jìn)入壞死狀態(tài)的細(xì)胞增多以及凋亡晚期進(jìn)入壞死期細(xì)胞的增加有關(guān)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)下早期凋亡N2a細(xì)胞的比例Fig 2 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate

圖3 不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)下早期凋亡N2a細(xì)胞比例的變化（×20）Fig 3 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate（×20）

谷氨酸誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)追蹤選擇可誘導(dǎo)N2a細(xì)胞達(dá)凋亡峰值的谷氨酸濃度750μg／mL處理N2a細(xì)胞20 h作為拍攝起點(diǎn)，利用HCS系統(tǒng)對(duì)N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤。由于PI染料不適合長(zhǎng)時(shí)間染色和追蹤細(xì)胞凋亡動(dòng)態(tài)，我們采用可進(jìn)行活細(xì)胞染色和成像分析的NucRed Live 647標(biāo)記細(xì)胞核（紅色），同時(shí)結(jié)合Annexin V－FITC標(biāo)記發(fā)生凋亡細(xì)胞的胞膜（綠色）。

結(jié)果顯示，隨著拍攝追蹤時(shí)間的增加，帶有綠色熒光（Annexin V－FITC）的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，即發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目增多，而且細(xì)胞核逐漸出現(xiàn)碎片化（圖4）。此外，還可以捕捉到同一個(gè)細(xì)胞發(fā)生凋亡的動(dòng)態(tài)過程（圖4中白色三角和箭頭分別標(biāo)示了兩個(gè)細(xì)胞的凋亡動(dòng)態(tài)變化）。與之相對(duì)應(yīng)，隨著拍攝追蹤時(shí)間的增加，胞核的紅色熒光（NucRed Live 647）強(qiáng)度不均一且熒光強(qiáng)度CV逐漸增大（圖5A），凋亡細(xì)胞的胞核面積逐漸縮?。▓D5B）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖4 谷氨酸誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)實(shí)時(shí)追蹤（×40）Fig 4 The morphological real－time tracking images of apoptotic N2acells induced by glutamate（×40）

圖5 凋亡的N2a細(xì)胞的胞核熒光強(qiáng)度CV值（A）及胞核面積（B）隨谷氨酸誘導(dǎo)時(shí)間的變化Fig 5 CV of nucleus fluorescence intensity of glutamate induced apoptotic N2acells at different induction time

討 論

有研究報(bào)道［9－10］，離體培養(yǎng)的大腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)不同濃度谷氨酸刺激后分別引起細(xì)胞的壞死和凋亡，低濃度谷氨酸（1×10－3mol／L）即可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著谷氨酸濃度的增高，凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，但高濃度谷氨酸（1×10－2mol／L）則使膠質(zhì)細(xì)胞的死亡方式以壞死為主。本實(shí)驗(yàn)選取介于兩者之間的濃度250、500、750、1 000μg／mL（1．7～6．8×10－3mol／L）作為谷氨酸的誘導(dǎo)劑量，摸索其誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡達(dá)到峰值的濃度。通過HCS分析結(jié)合活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像跟蹤拍攝，可以捕捉到谷氨酸誘導(dǎo)后N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)變化過程，包括從活細(xì)胞（Hoechst 33342＋／AnnexinV－／PI－）進(jìn)入凋亡早期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI－）的胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞核凝縮狀態(tài)，進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞核碎裂的凋亡晚期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI＋）等各個(gè)階段。

HCS分析系統(tǒng)通過全自動(dòng)高速顯微成像在短時(shí)間內(nèi)生成大量的圖像，全自動(dòng)圖像分析從這些圖像中提取大量的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)管理軟件負(fù)責(zé)建檔存儲(chǔ)、注釋比較、檢索分享這些圖像和數(shù)據(jù)。高內(nèi)涵分析軟件具有預(yù)設(shè)解決方案（ready－made solutions），預(yù)先安裝常用圖像分析方法和預(yù)設(shè)數(shù)據(jù)處理方案，如發(fā)現(xiàn)胞核、發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)、發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)、選擇細(xì)胞區(qū)域、計(jì)算圖像紋理密度特性數(shù)據(jù)、計(jì)算熒光特性數(shù)據(jù)、計(jì)算形態(tài)學(xué)特性數(shù)據(jù)等，不僅能獲取大量細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，而且能對(duì)其進(jìn)行有效的管理和分析［11－12］。

HCS分析不僅能夠像傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀那樣對(duì)樣品進(jìn)行群體分析，而且還可以對(duì)群體分析中具有特定數(shù)值特征的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和數(shù)值檢測(cè)，如對(duì)細(xì)胞核熒光強(qiáng)度變異系數(shù)以及胞核面積大小的改變等形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)。HCS分析結(jié)合活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)可直觀清晰地追蹤拍攝谷氨酸誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化特征，是一種體外追蹤單一神經(jīng)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的理想方法。該方法也可應(yīng)用于藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)或抑制作用的形態(tài)學(xué)變化特征的研究。

［1］ Aoyama K，Nakaki T．Neuroprotective properties of the excitatory amino acid carrier 1 （EAAC1）［J］．Amino Acids，2013，45（1）：133－142．

［2］ Cassano T，Serviddio G，Gaetani S，et al．Glutamatergic alterations and mitochondrial impairment in a murine model of Alzheimer disease［J］．Neurobiol Aging，2012，33（6）：1121．e1－e12．

［3］ Cao L，Li L，Zuo Z．N－acetylcysteine reverses existing cognitive impairment and increased oxidative stress in glutamate transporter type 3 deficient mice ［J］．Neuroscience，2012，220（18）：85－89．

［4］ Park SY，Jin ML，Kim YH，et al．Involvement of heme oxygenase－1 in neuroprotection by sanguinarine against glutamate－triggered apoptosis in HT22 neuronal cells［J］．Environ Toxicol Pharmacol，2014，38（3）：701－710．

［5］ 朱加應(yīng)，張廣云，王建怡，等．雌激素及雌激素受體α減輕谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷［J］．中國病理生理雜志，2013，30（1）：121－127．

［6］ Christophe T，Ewann F，Jeon HK，et al．High－content imaging of Mycobacterium tuberculosis－infected macrophages：anin vitromodel for tuberculosis drug discovery［J］．Future Med Chem，2010，2（8）：1283－1293．

［7］ Zock JM．Applications of high content screening in life science research ［J］．Comb Chem High Throughput Screen，2009，12（9）：870－876．

［8］ Wang C，Zeng Z，Liu Q，et al．Se－methylselenocysteine inhibits apoptosis induced by clusterin knockdown in neuroblastoma N2a and SH－SY5Y cell lines［J］．Int J Mol Sci，2014，15（11）：21331－21347．

［9］ Yu X，Sun L，Luo X，et al．Investigation of the neuronal death mode induced by glutamate treatment in serum－，antioxidant－free primary cultured cortical neurons［J］．Brain Res Dev Brain Res，2003，145（2）：263－268．

［10］ 王偉，唐榮華，劉洋，等．谷氨酸對(duì)大鼠膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡壞死的影響［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2000，80（1）：67－68．

［11］ Anguissola S，Garry D，Salvati A，et al．High content analysis provides mechanistic insights on the pathways of toxicity induced by amine－modified polystyrene nanoparticles［J］．PLoS One，2014，9（9）：e108025．

［12］ Singh S，Carpenter AE，Genovesio A．Increasing the Content of High－Content Screening：An Overview［J］．J Biomol Screen，2014，19（5）：640－650．