何承霖 陸 燁 莊曉珺 梁建英

（1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 上海 201203；2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院藥劑科 上海 200011）

法莫替丁屬于第3代組胺H2受體拮抗劑，具有拮抗胃黏膜壁細胞的組胺H2受體并抑制胃酸分泌的作用，與其結(jié)構(gòu)類似物雷尼替丁或西米替丁相比，具有更好的療效［1］。目前臨床上主要用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及由胃酸分泌過多所引起的疾病。根據(jù)相關(guān)文獻報道，現(xiàn)已有數(shù)種常見的血漿中法莫替丁含量的測定方法，包括毛細管電泳法［2－3］，高效液相色譜－紫外檢測法［4］以及液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［5－6］等。文獻中血樣前處理大多采用液液提取或固相萃取，方法相對繁瑣；樣品測定采用HPLC法，靈敏度較差；報道的液質(zhì)聯(lián)用法樣品制備繁瑣［7］或者基質(zhì)效應(yīng)較大［8］。本文以甲醇沉淀蛋白上清液用水1∶1稀釋，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定血漿中法莫替丁的含量，方法更加準確、快速。運用建立的方法，以上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的法莫替丁膠囊為參比制劑，對福建三愛藥業(yè)有限公司研制的法莫替丁膠囊進行相對生物利用度及其生物等效性評價的研究。通過測定23名健康志愿者交叉口服給藥后的經(jīng)時過程的血藥濃度，對計算所得的相對生物利用度以及有關(guān)藥動學(xué)參數(shù)cmax、tmax、AUC0－t、AUC0－∞進行統(tǒng)計分析處理并作出是否具有生物等效性的評價。

材料和方法

藥品與試劑 試驗?zāi)z囊（T）（法莫替丁膠囊，規(guī)格：20 mg，批號：120601，福建三愛藥業(yè)有限公司）；參比膠囊（R）（法莫替丁膠囊，規(guī)格：20 mg，批號：51120105，上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司）；法莫替丁對照品（批號：10305－0001，中國生物制品檢定所）；內(nèi)標鹽酸雷尼替?。ㄅ枺?00163－2041006，中國生物制品檢定所）；甲醇（HPLC級，批號：1586807117，德國默克公司）；甲酸（批號：14105，北京迪馬科技公司）；去離子純水均取自 Millipore Direct－Q純凈水發(fā)生器。

儀器 API－3000質(zhì)譜檢測器（美國Applied Biosystems公司）以及 Analyst色譜工作站（1．4．1版本，美國Applied Biosystems公司），Agilent公司1100型高效液相色譜儀，包括G1312A四元泵，G1316A柱溫箱，G1379A在線脫氣機和CTC HTS型控溫自動進樣器（瑞士CTC Analytics公司）；離心機：型號TGL－16G型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；旋渦混合器：型號KW－80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

色譜條件 色譜柱為Venusil XBP苯基柱（100 mm×2．1 mm，5μm）；流動相為0．1%甲酸水溶液－甲醇（體積分數(shù)為60∶40）；流速為0．30 mL／min；柱溫為40℃；進樣量為10μL。

質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源（Electronic Spray Ion，ESI）；正離子方式檢測；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴射電壓為5 000 V；離子源溫度為500℃；氣簾氣流速為10 L／min，霧化氣流速為8 L／min，碰撞氣流速為4L／min，掃描時間為0．2 s。

LC／MS／MS條件的優(yōu)化 采用正離子方式檢測，按擬訂的優(yōu)化程序分別優(yōu)化法莫替丁與雷尼替丁的測定條件，在一級全掃描質(zhì)譜圖中得到法莫替丁的準分子離子峰（Q1）［M＋H］＋（m／z：338．3），然后選擇性對其進行二級質(zhì)譜分析得到主要碎片離子（Q3）（m／z：189．2），最后再通過法莫替丁的Q1／Q3對CE、DP等參數(shù)逐一優(yōu)化。內(nèi)標物雷尼替丁的LC／MS／MS條件優(yōu)化步驟與法莫替丁相同。用于定量和定性分析的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)表Tab 1 Parameters of mass spectrum

血漿樣品處理 精密移取血漿200μL，置于1．5 mL EP管內(nèi)，加入20μL內(nèi)標溶液與800μL甲醇渦旋1 min，于12 000×g離心10 min，取上清液1∶1純水稀釋后進樣10μL，進行 LC／MS／MS分析。

藥動學(xué)試驗

受試者的選擇 本試驗選擇24名男性健康志愿受試者，年齡為（25．42±3．72）歲，身高為（173．04±4．12）cm，體重為（67．08±4．22）kg，體重指數(shù)（body mass index，BMI）為18～24。經(jīng)詢問病史并進行臨床檢查及生化檢查證實心、肺、肝、腎功能均正常，無消化道、代謝異常病史，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病史及過敏史，無藥物依賴史，身體健康志愿參加法莫替丁生物利用度試驗。受試者在試驗前2周至整個試驗期間禁服任何其他藥物，并簽署知情同意書。后1人因自身原因退出試驗，因此實際完成試驗人數(shù)為23人。

圖1 空白血樣色譜圖Fig 1 Chromatograms of blank plasma

試驗方案 24名男性健康志愿受試者禁食過夜（10 h以上），于次日早晨單劑量空腹服用等劑量試驗?zāi)z囊或參比膠囊40 mg，用250 mL溫開水送服。本試驗采用隨機、單盲、交叉試驗的方法，將24名受試者隨機編號分為兩組，交叉口服給藥進行試驗。血樣采集前，埋置肝素留置針頭，服藥前取空白血樣（0h），給藥后于0．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5、4、6、8、12、16 h共13個時間點分別于前臂肘正中靜脈采集靜脈血3 mL，收集于加有肝素的離心管內(nèi)，4 000×g離心10 min，分離出血漿置于－20℃冰箱中保存。用藥期間和用藥過后，受試者均未發(fā)生任何不良反應(yīng)。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用DAS 2．1．1軟件對測得的數(shù)據(jù)（cmax、AUC0－t、AUC0－∞等）進行計算及統(tǒng)計學(xué)處理。

結(jié) 果

方法學(xué)驗證

分析方法特異性 在本試驗條件下，法莫替丁的保留時間約為1．30 min，內(nèi)標（雷尼替?。┑谋Ａ魰r間約為1．38 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與測定藥物分離完全，不干擾藥物測定。其典型圖譜見圖1～3。

標準曲線與線性范圍 取若干只1．5 mL EP管，各加入空白血漿190μL，加入法莫替丁對照品溶液10μL，使血漿中藥物濃度分別為2．5、5．0、10．0、25．0、50．0、100．0、250．0ng／mL，每個濃度5管，按“血樣處理”項下的方法操作后，作LC／MS／MS分析。以樣品峰面積（Ai）與內(nèi)標峰面積（As）比值對藥物濃度（C，ng／mL）進行線性回歸，計算結(jié)果為Y＝0．002 102X＋0．001 837（r＝0．999 9，n＝7）。線性范圍：2．5～250 ng／mL。

圖2 空白血樣加法莫替丁與內(nèi)標雷尼替丁的色譜圖Fig 2 Chromatograms of control of Famotidine and control of Ranitidine

圖3 志愿者血樣加內(nèi)標雷尼替丁色譜圖Fig 3 Chromatograms of sample plasma with Ranitidine

精密度試驗 配制定量限、低、中、高4個點（2．5、5．0、50．0、250．0ng／mL）的標準血樣各6份，于同一天按血樣預(yù)處理的方法操作后進樣10μL，作LC／MS／MS分析，計算批內(nèi)精密度連續(xù)3天，同法作LC／MS／MS分析，綜合3天的數(shù)據(jù)，計算批間精密度，結(jié)果見表2。

準確度試驗-方法回收率 取健康人的空白血漿190μL若干，分別加入法莫替丁對照品溶液，使法莫替丁濃度分別為2．5、5．0、50．0、250．0ng／mL，再按“血樣預(yù)處理”項下的方法操作后，作LC／MS／MS分析。將藥物峰面積與內(nèi)標峰面積比值代入標準曲線的方程中，計算所得的濃度除以理論濃度，即得方法回收率，分別為99．64%、97．23%、99．18%、99．47%，計算RSD，結(jié)果見表2。

提取回收率試驗 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、50．0、250．0ng／mL，按血樣預(yù)處理后作LC／MS／MS分析，記錄藥物峰面積。另取相同量的法莫替丁對照液，用流動相稀釋后，進相同量的法莫替丁，記錄峰面積，計算提取回收率，分別為89．29%、93．37%、87．10%，計算 RSD，結(jié)果見表2。

表2 方法學(xué)驗證結(jié)果Tab 2 Result of method validation （RSD%）

結(jié)果表明該法莫替丁血樣測定方法準確度高，精密度好，適用于臨床研究中法莫替丁血樣的分離分析。

樣品穩(wěn)定性考察

樣品冰凍穩(wěn)定性 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、60．0、300．0ng／mL，放置在－20℃冰箱中，分別于冷凍后的0、30及45天后取出測定，計算RSD，結(jié)果見表3。

樣品凍融穩(wěn)定性 取健康人空白血漿190μL數(shù)份，分別加法莫替丁對照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、60．0、300．0ng／mL，放置在－20℃冰箱中，然后分別凍融3次測定其峰面積比值，計算RSD，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

復(fù)溶溶液穩(wěn)定性 取5．0、60．0、300．0ng／mL 3種濃度的復(fù)溶溶液數(shù)份，室溫放置，并分別于0、8、24 h測定其峰面積比值，計算RSD，結(jié)果見表3。

表3 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 3 Stability of samples （RSD%）

結(jié)果表明法莫替丁血樣冰凍穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性良好，復(fù)溶溶液在24 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。

基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿直接經(jīng)甲醇蛋白沉淀前處理，取上清液，即得空白基質(zhì)溶液。在50%甲醇溶液和經(jīng)過處理的空白基質(zhì)溶液中精確加入一定量的混合標準溶液，配制成低、中、高3種濃度測試溶液，取10μL進樣，按上述色譜條件進行分析，比較甲醇溶液和空白基質(zhì)溶液中被測組分的峰面積，計算基質(zhì)效應(yīng)。

各被測組分的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表4，可知各濃度血樣基質(zhì)效應(yīng)為89．01%～95．73%，基質(zhì)效應(yīng)較小。

表4 各濃度樣品的基質(zhì)效應(yīng)Tab 4 Matrix effect of samples （n＝5）

測定方法的質(zhì)量控制 取健康人空白血漿190 μL數(shù)份，分別加法莫替丁對照品溶液，使血漿中法莫替丁的濃度分別為5．0、50．0、250．0ng／mL，其余同血樣的預(yù)處理項下步驟操作，作為質(zhì)控樣品。每天志愿者血樣測定時，隨行進行質(zhì)控樣品測定，以考察方法可靠性。

藥動學(xué)參數(shù)及生物等效性評價

藥－時曲線 23名受試者分別口服法莫替丁的參比膠囊和試驗?zāi)z囊后，血漿中法莫替丁的平均血藥濃度－時間曲線見圖4。

圖4 23名健康受試者口服法莫替丁參比膠囊或試驗?zāi)z囊的藥－時曲線Fig 4 Plasma concentrations－time curve of Famotidine after oral administration of Famotidine reference capsules and tested capsules in 23healthy subjects

藥動學(xué)參數(shù) 本實驗采用DAS 2．1．1軟件進行數(shù)據(jù)處理，23名受試者口服法莫替丁參比膠囊或試驗?zāi)z囊后的藥動學(xué)參數(shù)見表5。

表5 23名健康受試者口服法莫替丁參比膠囊和試驗?zāi)z囊后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 5 Pharmacokinetic parameters of Famotidine after oral administration of Famotidine reference capsules and tested capsules in 23healthy subjects

生物等效性分析 經(jīng)方差分析，兩種膠囊cmax、AUC0－t、AUC0－∞藥劑間、周期間的F 值均小于相應(yīng)的F臨界值，說明兩者在藥劑間與周期間無顯著性差異；雙向單側(cè)t檢驗和（1－2α）置信區(qū)間法計算所得結(jié)果表明，兩種膠囊cmax、AUC0－t、AUC0－∞的tL≥t（1－0．05）與tH≥t（1－0．05）同時成立，并且試驗?zāi)z囊和參比膠囊 AUC0－t幾何均值比的90%CI（80．7%～97．4%）以 及 AUC0－∞的 90%CI（80．0% ～96．5%）均落在等效標準范圍內(nèi)（80%～125%），cmax幾何均值比的90%CI（80．4%～100．6%）也落在等效標準范圍內(nèi)（75%～133%），試驗?zāi)z囊與參比膠囊的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。因此，生物等效性分析結(jié)果表明兩種膠囊間主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即兩者具有生物等效性。

討 論

法莫替丁分子結(jié)構(gòu)中含有一強極性胍基，水溶性較大，文獻中即使采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定樣品，前處理亦大多采用有機溶劑提取或固相萃取法［7］，前處理所需時間較長且操作繁瑣。本文采用甲醇以水相與有機相1∶4沉淀蛋白，方法簡便快速，可在約10 min時同時處理多達12份血樣。同時在進樣前用純水1∶1稀釋上清液，與同樣采用蛋白沉淀液質(zhì)聯(lián)用的測定方法［8］相比大大降低了試驗的基質(zhì)效應(yīng)，低、中、高3個濃度的基質(zhì)效應(yīng)可達到89．01%～95．73%，而且也能得到令人滿意的提取回收率，平均可達85%以上，提取效果優(yōu)于已有的文獻報道［8］。本試驗操作簡單快速，樣品的分析時間較短，可滿足臨床研究中大量樣品的快速分析。

另外，本文選擇結(jié)構(gòu)與法莫替丁比較相似的雷尼替丁作為內(nèi)標，在樣品的前處理過程中具有相近的提取回收率，可以為定量方法提供更好的準確度和精密度。

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