李先佳，任麗平，常陸林

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河462002）

大孔樹脂對馬鞭草總黃酮純化工藝條件優(yōu)化

李先佳，任麗平，常陸林

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河462002）

選擇7種不同型號大孔樹脂，比較其對馬鞭草總黃酮的吸附量和解吸率，篩選出AB-8為最佳吸附劑，其最佳動態(tài)吸附條件：上柱液濃度2.82 mg/mL，上柱流速為2 BV/h，pH為4.6。最佳洗脫條件：4 BV的75%乙醇濃度洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h。結(jié)果表明：AB-8樹脂對馬鞭草總黃酮具有良好的吸附和解吸效果。

大孔樹脂；馬鞭草；黃酮；吸附；解吸

馬鞭草系馬鞭草科（Verbenaceae）植物馬鞭草（Verbena officinalis L）的全草或帶根全草。味苦性涼，入肝、脾、腎經(jīng)，具有清熱解毒、活血散淤及利水消腫的功能［1］，馬鞭草主要成分有黃酮類、三萜類、甾體類、糖類等［2］。近年來關(guān)于馬鞭草總黃酮的提取工藝和黃酮苷元的含量測定等方面報道較多［3］，但對總黃酮的富集純化方面報道較少。本文就大孔樹脂對馬鞭草總黃酮純化工藝進行了研究，為馬鞭草資源的開發(fā)利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鞭草：采自河南魯山，經(jīng)漯河醫(yī)專藥學(xué)系趙喜蘭副教授鑒定為Verbena officinalis L全草，60℃烘干，粉碎后過60目篩，備用。

標準品蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為分析純；D101型大孔樹脂：滄州寶恩化工有限公司；D4020型大孔樹脂：上海試劑一廠；樹脂（AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020）：南開大學(xué)化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步其公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AE240型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：上海一恒實驗儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 大孔樹脂預(yù)處理

樹脂采用95%乙醇充分浸泡24 h，分別用乙醇和去離子水洗滌至不呈白色渾濁為止。再分別用5% HCl和2%NaOH溶液浸洗，去離子水洗至中性，備用。

1.3.2 提取液的制備

取馬鞭草藥材100 g，以料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇1 L，回流提取3次，每次提取2.5 h，提取液濾過，合并，減壓回收乙醇，濃縮至無乙醇味，再用蒸餾水溶解制成不同濃度的溶液濾液，待用。

1.3.3 馬鞭草中總黃酮含量的測定

采用蘆丁為標準樣品，參照文獻［4］的方法繪制標準曲線，計算得回歸方程為C=0.197 8A-0.02 9，r= 0.999 4，其中C為標準溶液濃度，A為蘆丁在510 nm處吸光度值。結(jié)果表明蘆丁濃度0.016 g/L～0.16 g/L范圍與吸光度值線性關(guān)系良好。并根據(jù)該方法測定馬鞭草提取液中總黃酮的含量，以蘆丁的等價物表示。

1.3.4 大孔吸附樹脂對馬鞭草中總黃酮的靜態(tài)吸附實驗

1.3.4.1 大孔吸附樹脂的吸附量測定

量取預(yù)處理的樹脂D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020型大孔樹脂各4 g于100 mL錐形瓶中，精確加入0.63 mg/mL樣品溶液50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）吸附24 h，過濾，測定濾液中剩余的總黃酮含量，計算各種樹脂的靜態(tài)吸附量 ［Q（mg/g），Q=（C0-Cr）×V/M，C0起始濃度，（mg/mL）；Cr吸附后濃度，（mg/mL）；V為樣液體積，mL；W為樹脂質(zhì)量，g］［5］。

1.3.4.2 大孔吸附樹脂的解吸率測定

取1.3.3.1方法得到的飽和樹脂，分別置于100 mL錐形瓶中，加入75%乙醇50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）解吸24 h，過濾，測定平衡液中黃酮類含量，計算靜態(tài)解吸率［A（%），A=（C×V）×100%/（M×Q），式中：C為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，（mg/mL）；V為解吸液體積，mL；M為樹脂質(zhì)量，g；Q為吸附率，（mg/g）］［6］。

1.3.4.3 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

量取預(yù)處理的樹脂各4 g于100 mL錐形瓶中，精確加入1.61 mg/mL樣品溶液50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）吸附12 h，每隔1小時測吸附液總黃酮的含量，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.3.5 樹脂動態(tài)吸附與解吸工藝參數(shù)研究

通過靜態(tài)吸附實驗，將篩選出的理想樹脂濕法裝入層析柱中，考察上柱液濃度、上樣流速、上樣液的pH、樣液的pH對吸附效果的影響以及洗脫劑的洗脫劑乙醇濃度、洗脫劑體積、流速對洗脫效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 不同樹脂對馬鞭草總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸實驗

本實驗測定D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7種樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附率和解吸率，結(jié)果見表1。

一般而言，樹脂的吸附效果與樹脂極性、孔徑、比表面積存在一定的關(guān)系。由表1顯示，比表面積比較大的D101，D4020，AB-8的吸附率都超過81%，在這3種樹脂中，D101和AB-8兩種弱極性的樹脂吸附效果最好，這與黃酮類化合物極性較弱，有利于弱極性或非極性樹脂的吸附有關(guān)。AB-8樹脂不僅吸附效果較好，而且解吸率最佳，為87.2%。綜合分析，選擇AB-8為最佳樹脂。

表1 7種樹脂靜態(tài)吸附及解吸結(jié)果Table 1 Results of static adsorption and desorption of seven types of resin

2.1.2 靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7種樹脂的吸附動力學(xué)曲線如圖1所示。

圖1 樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Kinetic curves of the static adsorption of resin

圖1顯示，樹脂吸附3 h后，樹脂基本達到吸附平衡，顯示這幾種樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附屬于快速平衡型，3 h達到平衡，尤其AB-8樹脂的吸附液中總黃酮濃度下降的速度比其他樹脂快，說明AB-8樹脂吸附效果更佳。因此，本實驗選擇AB-8為最佳樹脂。

2.2 AB-8樹脂對馬鞭草總黃酮的動態(tài)吸附實驗

2.2.1 上樣液濃度的影響

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，將濃度為5.65 mg/mL蒸餾水稀釋配置成5.65、4.34、3.77、2.82、1.88、1.61、1.25、0.86、0.71、0.63、0.57 mg/mL等不同濃度的溶液，控制吸附流速為2 BV/h，進行動態(tài)吸附試驗，結(jié)果如圖2所示。

圖2 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption capacity

由圖2可知，AB-8樹脂吸附量隨濃度的增大而加大，但達到2.82 mg/mL濃度后，吸附量變化幅度不大。綜合考慮選擇2.82 mg/mL樣品液上樣。

2.2.2 上樣速率的考察

將濃度為2.82 mg/mL的樣液分別以1、2、3、4、5 BV/h流速進行動態(tài)吸附，考察不同流速對樹脂的動態(tài)吸附效果，見圖3。

圖3 流速對吸附量的影響Fig.3 Effect of flow rate on adsorption capacity

由圖3可以看出，伴隨流速的增加，樹脂的吸附量在減少，流速過慢時，吸附量增加，但循環(huán)周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h較理想。

2.2.3 樣液的pH的確定

用稀氨水和稀鹽酸調(diào)節(jié)樣液（2.82 mg/mL）pH為2.7、3.5、4.6、5.4、6.7上柱，流速2 BV/h，考察不同pH對樹脂的動態(tài)吸附效果，見圖4。

由圖4可見，pH 4.6樹脂吸附量最大，這可能是由于黃酮類化合物多為多羥基酚類化合物，呈弱酸性，因此酸性條件下吸附量最好。但如果pH過低，容易形成烊鹽，不易被吸附。

2.2.4 上樣液體積的考察

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，將濃度為2.82 mg/mL樣液以2 BV/h流速上樣，每一個柱體收集1份，檢測流出液中總黃酮的濃度，考察樹脂動態(tài)吸附效果，見圖5。

圖4 pH對吸附量的影響Fig.4 Effect of pH on adsorption capacity

圖5 馬鞭草總黃酮泄露曲線Fig.5 Leak curve of total flavonoids From Verbena officinalis

由圖5結(jié)果顯示，上樣體積＜5 BV時泄漏較少，＞5 BV時樣液泄漏明顯，體積達11 BV時，流出液的總黃酮濃度與上樣液接近，此時樹脂已基本吸附飽和。

2.3 動態(tài)洗脫實驗

2.3.1 洗脫劑乙醇濃度的確定

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，2.82 mg/mL的上樣藥液調(diào)pH為4.6上樣流速為2 BV/h，上樣液后，依次采用2BV的去離子水，35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2 BV/h，考察不同濃度的乙醇的解吸率，洗脫液和上樣液同時蒸干，得各部分洗脫液浸膏和上樣液浸膏，見圖6。

圖6 乙醇濃度對解吸率和浸膏得率的影響Fig.6 Influence of ethanol concentration on desorption rate and extractum rate

從圖6可以看出，當乙醇濃度達到75%時，解吸率和浸膏得率最高。這可能與解吸劑的極性相關(guān)，濃度小極性過大，濃度大則極性偏小，并影響解吸效果。

2.3.2 洗脫劑用量的確定

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，pH為 4.6上樣液（2.82 mg/mL）流速為2 BV/h上樣，充分吸附，2 BV去離子水沖洗，75%乙醇以2 BV/h流速洗脫，洗脫劑用量以1 BV為收集單位，分段收集流出液，見圖7。

圖7 黃酮動態(tài)洗脫曲線Fig.7 The dynamic desorption curve of flavonoids

從圖7可以看出，當洗脫量為4 BV時，樹脂上的黃酮基本完全洗脫。故洗脫劑用量的確定為4 BV。

2.3.3 洗脫劑流速的確定

將濃度為2.82 mg/mL樣液以2 BV/h流速通過樹脂后，充分吸附，2 BV去離子水沖洗，4 BV的75%乙醇以1、2、3、4、5 BV/h的流速洗脫，考察洗脫劑流速對解吸的影響，見圖8。

圖8 洗脫劑流速對解吸率的影響Fig.8 Effect of eluant velocity on desorption rate

從圖8可以看出，伴隨流速的增加，黃酮的解吸率在減少，但流速過慢，循環(huán)周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h較理想。

2.4 工藝驗證

按上述優(yōu)選工藝進行純化試驗，純化后解吸液中總黃酮為232.14 mg，洗脫液和上樣液同時蒸干稱重分別為343.30 mg和1 327.84 mg，結(jié)果純化前黃酮為282 mg，純度為21.24%，純化后黃酮的純度為67.62%，精制倍數(shù)為67.62%/21.24%=3.18。

3 結(jié)論

7種樹脂中，AB-8大孔樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附量和解吸率較高，為快速平衡型，是純化馬鞭草總黃酮理想的樹脂。

AB-8大孔樹脂吸附馬鞭草總黃酮的最佳工藝參數(shù)：上樣藥液濃度2.82 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，pH為4.6。解吸工藝參數(shù)：4 BV的75%乙醇濃度洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h。

馬鞭草提取液經(jīng)過AB-8大孔樹脂分離純化后，馬鞭草總黃酮的精制倍數(shù)為3.18。

［1］金偉軍，張志東.馬鞭草的研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：693-694

［2］陳改敏，張建業(yè)，洪廣峰.馬鞭草中總黃酮的含量測定［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23（8）：798-799

［3］黃鎖義，羅建華，劉嬌，等.超聲波提取馬鞭草總黃酮及鑒別［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（6）：1464-1465

［4］劉江波，傅婷婷，呂秀陽.大孔樹脂分離純化三葉青總黃酮的工藝研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2011，46（4）：287-292

［5］裴詠萍，李維林，張涵慶.大孔樹脂對紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）：8-9

［6］孟兆青，丁崗，柳于介，等.異長春花苷內(nèi)酰胺大孔樹脂純化研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（8）：1007-1010

Process Conditions of Purification of Total Flavonoids from Verbena Officinalis by Macroporous Resin

LI Xian-jia，REN Li-ping，CHANG Lu-lin
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Seven types of macroporous resin were selected to compare their performances in absorbing and desorbing flavonoids in Verbena officinalis.The macroporous resin AB-8 was chosen to be the best．The results indicated that the optimum condition：the extract concentration was 2.82 mg/mL，adsorption velocity was 2 BV/h，the pH was 4.6，the eluting reagent was 75%ethanol，the desorption rate was 4 BV/h．The dose of the reagent was 4 times as much as the column volume．The results showed that AB-8 resin could be used in separation an purification for total flavonoids of Verbena officinalis.

macroporous resin；Verbena officinalis；flavonoids；adsorption；desorption

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.019

2014-09-26

李先佳（1977—），男（漢），副教授，碩士，從事生物活性成分的分離與鑒定。