富鑫，華家才，儲小軍

（貝因美嬰童食品股份有限公司，配方奶粉研發(fā)中心，浙江杭州310000）

一種發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)快速檢測技術(shù)的研究

富鑫，華家才，儲小軍

（貝因美嬰童食品股份有限公司，配方奶粉研發(fā)中心，浙江杭州310000）

以還原法為理論基礎(chǔ)，開發(fā)并建立一種應(yīng)用于發(fā)酵乳飲料成品乳酸菌數(shù)指標的快速檢測方法。本方法應(yīng)用儀器記錄了樣品加入反應(yīng)試劑后的顏色變化（RGB），通過數(shù)理統(tǒng)計分析，采用斜率法，以R值斜率表示樣品顏色的變化速度。本研究對發(fā)酵乳樣品進行了預(yù)處理，以符合刃天青還原法的反應(yīng)條件。以GB 4789.35《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》為標準，建立了R值斜率與乳酸菌菌落總數(shù)之間的標準方程，經(jīng)驗證本方法檢測結(jié)果與GB 4789.35《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》檢測結(jié)果無顯著差異。與現(xiàn)有標準方法相比，在時效性、運營成本等方面具有較大優(yōu)勢。

還原法；發(fā)酵乳；乳酸菌總數(shù)；快速檢測

發(fā)酵乳在GB 19302-2010中的定義為以生牛（羊）乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH降低的產(chǎn)品，涵蓋了發(fā)酵乳、酸乳、風味發(fā)酵乳、風味酸乳等產(chǎn)品。由于食用時發(fā)酵乳及發(fā)酵乳飲料中的活菌數(shù)需達到一定數(shù)量才能起到保健作用［1］，因此GB 19302-2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》中明確規(guī)定了發(fā)酵乳產(chǎn)品的乳酸菌限量：乳酸菌數(shù)≥1×106cfu/g（mL）［2］。由于發(fā)酵乳為全冷鏈運輸和銷售，GB 4789.35-2010《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》方法不但需要專業(yè)人員操作，運行成本較高，而且48 h的檢驗周期，嚴重縮短了發(fā)酵乳產(chǎn)品原本就很短的貨架期。因此一種快速有效的發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)的檢測方法，對縮短出廠檢測時間，延長產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)的貨架擺放時間，進而提高企業(yè)利潤和產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的意義。

本研究以染料還原法為理論基礎(chǔ)。染料還原法是指通過向乳中加入某些氧化還原型染料，根據(jù)染料顏色變化速度來判定乳中細菌總數(shù)的多少，檢測染料褪色時間的方法［3］。原理是氧化還原酶是微生物細胞內(nèi)在代謝過程中由于生理需要產(chǎn)生主要酶類，在細胞內(nèi)催化氧化還原反應(yīng)［4］，能將微生物新陳代謝過程中從能量物質(zhì)上脫下的氫傳遞給染料，使其還原并發(fā)生顏色變化。本研究選用刃天青為反應(yīng)試劑，氧化還原酶與刃天青反應(yīng)使刃天青由藍色變?yōu)樽仙?、粉色直至無色。由于氧化還原酶數(shù)量與乳中存在的細菌數(shù)量存在一定的線性關(guān)系，因此可根據(jù)生乳的顏色變化可以對細菌總數(shù)進行判定與SPC法有很好的相關(guān)性（r=-0.79）［5］。

本研究采用自主研制的顏色信息采集儀器進行實驗，試圖建立一種快速、準確的新的檢測發(fā)酵乳飲料成品乳酸菌數(shù)方法。如圖1所示。

圖1 實驗儀器構(gòu)造Fig.1 Schematic of the experimental instrument

儀器主要由LED發(fā)射器、感應(yīng)器、微處理器等構(gòu)成，采用RGB顏色體系采集信息，記錄檢測樣品顏色變化。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的相關(guān)研究中，對刃天青染料還原法的顏色變化對儀器的RGB顏色體系進行Exraction method：principal component analysis（主成分分析），確定以R值斜率為變量，記錄刃天青顏色變化［6］。

乳酸菌并不是微生物學(xué)的分類，是一類能使可發(fā)酵性碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸的細菌的總稱［7］。發(fā)酵乳由滅菌后的牛乳接種發(fā)酵劑經(jīng)發(fā)酵制得［8］，因此發(fā)酵乳中的細菌總數(shù)即為乳酸菌數(shù)。而采用刃天青還原法測定發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)還需要對樣品進行一些處理。這是由于發(fā)酵乳飲料的pH過低，不符合刃天青染料還原法的反應(yīng)條件。pH對刃天青還原法的影響主要有兩個方面：首先，pH是影響細菌生命代謝活動的主要因素，直接影響微生物代謝中的酶反應(yīng)，動物酶的適宜反應(yīng)pH在6.5～8.0之間［9］。另一方面，刃天青為氧化還原染料，本身可作為pH指示劑，酸性條件下呈紅色，堿性條件下呈藍色。當氫離子濃度高時，粉色的試鹵靈濃度增加，溶液顏色將出現(xiàn)明顯變化。當氫離子濃度很低，甚至是在堿性條件時，藍色的刃天青難以得到氫離子生成試鹵靈，從而變色反應(yīng)收到明顯的限制。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的相關(guān)研究結(jié)果證明，應(yīng)用刃天青染料還原法檢測細菌總數(shù)，經(jīng)多重比較大致在pH 6.5～7.0范圍內(nèi)檢測結(jié)果無顯著差異［10］。目前市售的合格發(fā)酵乳pH在4.0～4.5范圍內(nèi)，因此需要將發(fā)酵乳樣品經(jīng)處理后使其pH在6.5～7.0范圍內(nèi)，才能應(yīng)用刃天青染料還原法對其乳酸菌總數(shù)進行快速檢測。

以UHT乳對樣品進行稀釋的方法對發(fā)酵乳進行預(yù)處理，使其pH符合刃天青染料還原法的反應(yīng)條件。以儀器記錄結(jié)果及GB 4789.35檢測結(jié)果建立標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生乳：黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司提供；發(fā)酵乳：市售；UHT乳：市售；刃天青：Sigma公司；MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；梅特勒-托利多delta320 pH計：瑞士梅特勒-托利多有限公司；顏色信息采集儀器（自制）：可內(nèi)置20個比色皿，測量溫度37℃，CCD傳感器采集樣品顏色信息，每1 min采集一次，連續(xù)10 min，傳輸?shù)接嬎銠C，檢測結(jié)果以樣品的三原色值（RGB值）顯示，以Excel表格形式存儲于計算機中。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理方法

隨機抽取市售發(fā)酵乳樣品10個，與UHT乳1∶9混合，pH計室溫（15℃～20℃條件下）檢測發(fā)酵乳樣品pH和稀釋后混合液pH。

1.2.2 標準曲線的建立與驗證

本研究隨機抽取市售樣品17個，按照1.2.2方法對其進行預(yù)處理。將預(yù)處理后樣品1 800 μL，加入0.005%（w/v）刃天青溶液200 μL于比色杯中混勻；將比色杯放入自制顏色信息采集儀器中進行檢測，連續(xù)10 min采集樣品RGB顏色信息，以R值斜率表示樣品顏色的變化速度。以乳酸菌數(shù)為縱坐標，自制顏色信息采集儀器檢測結(jié)果（R值斜率）為橫坐標，繪制R值斜率與乳酸菌數(shù)之間的關(guān)系曲線，乳酸菌數(shù)為采用GB 4789.35對未經(jīng)預(yù)處理的樣品中的乳酸菌數(shù)的檢測結(jié)果。應(yīng)用Excel數(shù)據(jù)分析工具進行回歸分析，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)，分析其相關(guān)性，繪制標準曲線。另隨機抽取12個市售發(fā)酵乳飲料樣品進行標準曲線的驗證，每組做3個平行。以X±x形式記錄數(shù)據(jù)，進行相關(guān)性分析與t檢驗（雙尾）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方法結(jié)果

樣品預(yù)處理方法結(jié)果見表1。

表1 樣品預(yù)處理后的pHTable 1 pH after sample pretreatment

由表1可以看出，發(fā)酵乳經(jīng)UHT乳10倍稀釋后，pH在6.5～6.9范圍內(nèi)，符合還原法反映條件，因此基于還原法建立發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)的快速方法具有可行性。

2.2 標準曲線的建立

對17個市售發(fā)酵乳樣品按照1.2.1方式處理后進行檢測，同時通過標準平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)。以生乳細菌菌落總數(shù)為縱坐標，生乳細菌總數(shù)檢測儀檢測結(jié)果（R值斜率）為橫坐標，繪制R值斜率與菌落總數(shù)之間的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 R值斜率與乳酸菌數(shù)的關(guān)系曲線Fig.2 Relation between R slope andtotal lactic acid bacteria

本研究最終得到得到回歸方程：y=1.463 7x-4.959 2（R2=0.897 9），式中：y為乳酸菌數(shù)，x為R值斜率。經(jīng)F檢驗F=131.950＞F0.05（1.15）=4.54，即本研究方法獲得的R值斜率檢與GB 4789.35方法檢測結(jié)果相關(guān)關(guān)系極顯著。本研究以此方程作為標準方程，后續(xù)的測定中將本研究方法得出的R值斜率代入此方程，即可得到乳酸菌數(shù)。

2.3 驗證試驗結(jié)果

為了驗證標準曲線建立的合理性，采集市售發(fā)酵乳樣品，應(yīng)用本研究建立方法檢測，計算R值斜率，根據(jù)回歸方程計算出樣品中的乳酸菌數(shù)，與GB 4789.35方法比較，結(jié)果見表2。

表2 刃天青還原法與GB 4789.35檢測結(jié)果Table 2 Results of Reduction Reaction Method and GB 4789.35

將表2中刃天青還原法與GB 4789.35方法測定結(jié)果進行t-檢驗，結(jié)果見表3。

表3 t-檢驗結(jié)果Table 3 Result of t-test

由表3 t-檢驗結(jié)果可知，t Stat＜t（雙尾臨界），說明應(yīng)用本研究所建立標準曲線計算的乳酸菌數(shù)與GB 4789.35方法檢測結(jié)果差異不顯著，所以本試驗制作標準曲線較為準確。

3 討論

1）本研究分析加入試劑后生乳顏色變化，通過斜率法計算R值斜率，建立了標準方程，實際測定中只需將檢測結(jié)果R值斜率代入此方程，即可得到發(fā)酵乳中的乳酸菌數(shù)。

2）本方法的建立主要依據(jù)GB 19302-2010對發(fā)酵乳的定義，所以GB 19302-2010涉及的發(fā)酵乳、酸乳、風味發(fā)酵乳、風味酸乳等產(chǎn)品乳酸菌指標均可應(yīng)用本研究方法判定。

3）由于不同發(fā)酵乳中菌種及其配比不盡相同而導(dǎo)致還原酶含量、活力的差異［11］，引起刃天青還原速度的差異，進而影響R值斜率，影響最終檢測結(jié)果。

4）本研究所采集樣本數(shù)量有限，但證明了建立的標準曲線樣品顏色變化與發(fā)酵乳中乳酸菌數(shù)的正向相關(guān)趨勢。更為準確的，可用于換算R值與乳酸菌數(shù)的數(shù)學(xué)模型，將通過在進一步的研究中擴大樣本空間以及增大樣本量來得以實現(xiàn)。

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Research on a Rapid Detection Technology of Total Lactic Acid Bacteria in Fermented Milk

FU Xin，HUA Jia-cai，CHU Xiao-jun
（BeingmateBaby&Child Food Co.，Ltd.，F(xiàn)ormula R&D Center，Hangzhou 310000，Zhejiang，China）

Based on the theory of REDOX reaction，develop and building a measure which applies to rapid test the total lactic acid bacteria in fermented milk.The method was testing continuously the color（RGB）of the milk samples which had been added reagents by instrument，and the rate of color change was showed as R slope by statistical analysis.This research suggested a method of sample pretreatment in order to fit for reduction reaction conditions As against The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria），a standard curve was established to show the relation between R slope and total plate count.It was no significant difference between the two results of total bacteria measure apparatus and The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria）.Comparing with The Standard Method，this method has some advantages in aspect of lower operating cost and timeliness.

reduction test；fermented milk；total lactic acid bacteria；rapid detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.036

2013-04-10

富鑫（1984—），男（漢），中級工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品快速檢測技術(shù)。