曹師鋒，謝寧，宋鑫，趙振國，倪明，焦鯤，尹偉忠

基礎(chǔ)研究

富血小板血漿對老齡犬纖維多孔鈦頸椎椎間融合器沉降的影響

曹師鋒，謝寧，宋鑫，趙振國，倪明，焦鯤，尹偉忠

目的觀察富血小板血漿（PRP）對老齡比格犬頸椎前路椎間融合術(shù)纖維多孔鈦椎間融合器（FPT Cage）沉降的影響。方法選取6只7～9歲、12.5～15.0 kg的健康比格犬（雌雄各3只）作為實驗動物。取比格犬前肢外周靜脈血，采用二次離心法制備PRP，同時對外周靜脈血及PRP進(jìn)行血小板計數(shù)。行頸椎前路C4/5、C5/6椎間盤切除、FPT Cage椎間融合術(shù)，單純使用未浸泡PRP的FPT Cage行C4/5椎間融合，采用浸泡激活后的PRP復(fù)合FPT Cage融合C5/6，術(shù)后4個月處死實驗犬后行X線片及Micro-CT檢查，觀察C4/5、C5/6椎間融合器的沉降情況。結(jié)果C4/5節(jié)段有4例出現(xiàn)不同程度的椎間融合器沉降，另2例出現(xiàn)Cage向前移位；C5/6節(jié)段未有椎間融合器發(fā)生沉降，僅1例出現(xiàn)Cage向前移位。結(jié)論復(fù)合PRP可減少老齡比格犬頸椎椎間融合術(shù)FPT Cage的沉降。

富血小板血漿；血小板活化；骨質(zhì)疏松；頸椎；脊柱融合術(shù)；椎間融合器；鈦；沉降；顯微CT；狗

伴隨著人口的老齡化進(jìn)程，骨質(zhì)疏松頸椎病患者的手術(shù)治療成為目前的研究焦點。目前公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式是1955年Robinson和Smith［1］提出的頸椎前路椎間隙減壓椎間融合術(shù)式，自體髂骨融合效果最為確切，但因存在供區(qū)相關(guān)并發(fā)癥，臨床應(yīng)用受到限制。椎間融合器的應(yīng)用為頸椎融合術(shù)提供了新的選擇，不少研究顯示，單純應(yīng)用椎間融合器即可獲得確切療效，同時還減少了鈦板植入帶來的相關(guān)并發(fā)癥及應(yīng)力遮擋，減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［2］。

隨著椎間融合器的迅速發(fā)展和廣為應(yīng)用，融合器移位、沉降、鄰近部位骨吸收等相關(guān)并發(fā)癥的報道也逐漸增多。如何針對患者自身情況選擇合適的椎間融合器，將對融合效果及手術(shù)結(jié)局產(chǎn)生重要影響［2］。目前適用于骨質(zhì)疏松老年患者的椎間融合器研究較少。纖維多孔鈦（fiber porous titanium，F(xiàn)PT）是近年來出現(xiàn)的一種孔隙率均勻的多孔金屬支架材料，其相互連通的三維多孔結(jié)構(gòu)使融合器具有骨傳導(dǎo)性，彈性模量及生物力學(xué)特性亦適用于老年骨質(zhì)疏松患者。但是，多孔鈦支架存在生物活性欠佳、骨長入較慢等缺陷，骨質(zhì)疏松患者使用時仍存在椎間融合器沉降的可能［3-6］，需要通過椎間融合器表面生物改性，即復(fù)合生物活性成分或固定生物活性分子，來增強其骨誘導(dǎo)性能，促進(jìn)椎間融合，進(jìn)而達(dá)到減少椎間融合器沉降的目的［5-6］。本實驗旨在通過觀察復(fù)合富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）對老齡犬頸椎前路椎間融合術(shù)FPT椎間融合器（FPT Cage）沉降的影響，為骨質(zhì)疏松患者椎間融合器的改良提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

健康實驗用比格犬6只，雌雄各3只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供［實驗動物許可證編號：SCXK（滬）2012-0005］，年齡7～9歲，平均年齡為8.1歲；體質(zhì)量12.5～15.0 kg，平均體質(zhì)量為13.8 kg。

主要實驗試劑：4%枸櫞酸鈉抗凝劑（四川南格爾生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（西安沃爾森生物技術(shù)有限公司），無水CaCl2（西隴化工股份有限公司），凝血酶凍干粉（上海第一生化藥業(yè)有限公司），0.85%生理鹽水（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），頭孢拉定膠囊（上海福達(dá)制藥有限公司），0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司），10%多聚甲醛溶液（蘇州市第二化工研究所有限責(zé)任公司）。主要實驗器材：真空采血管（成都瑞琦科技實業(yè)有限公司），一次性使用無菌注射器（上海凱樂輸液器廠），電子臺秤（上海興澄衡器有限公司），電子天平（美國Strtorius公司），TDL-80-2B低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），YB-DX23D電動吸引器（上海醫(yī)療器械工業(yè)集團公司醫(yī)用吸引器廠），－80°低溫冰箱（日本Sanyo公司），XE2100全自動血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex公司），Skycan 1076顯微CT掃描機（比利時Skycan制造公司）。

1.2 FPT Cage

圖1 纖維多孔鈦棒與纖維多孔鈦椎間融合器1A大尺寸纖維多孔鈦棒大體照片1B纖維多孔鈦椎間融合器1C具有良好韌彈性的高強韌性纖維多孔鈦材料

本課題組前期與上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院合作制備出圓柱形FPT Cage（圖1），截面直徑5 mm、高度1 cm。樣品FPT Cage孔隙率58%～95%、孔徑100～400 μm；抗壓強度190.7 MPa、抗彎強度159 MPa、彈性模量4.15 GPa。樣品FTP Cage的孔隙度明顯高于天然珊瑚人工骨（孔徑200 μm、孔隙率53%），彈性模量介乎于人體皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨之間（皮質(zhì)骨拉伸模量17 GPa、松質(zhì)骨100 MPa）［7-8］，特別是其韌性遠(yuǎn)超粉末發(fā)泡燒結(jié)制備的多孔鈦。

1.3 富血小板血漿制作及血小板計數(shù)

手術(shù)前20 min采用Landesberg等［9］的方法制備PRP，制作全過程無菌操作。用預(yù)先含有1 mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的20 mL注射器，于頸椎術(shù)前取實驗犬前肢靜脈血20 mL，搖勻后提取1 mL行外周靜脈血血小板計數(shù)；余20 mL置入離心管中，分2次離心。第一次1 500轉(zhuǎn)/分，離心10 min，吸取全部上清及交界面以下3 mL的紅細(xì)胞至另一離心管，平衡后再次離心，3 000轉(zhuǎn)/分，離心15 min。離心管中血小板分成2層，上層上清液為貧血小板血漿，下層為血小板濃縮物。棄上清液上3/4部分，剩余液體約2.5～3 mL，搖勻，即為富血小板血漿。全自動血細(xì)胞分析儀測定外周靜脈血和PRP中的血小板數(shù)量。

1.4 PRP與FTP Cage的復(fù)合

FPT Cage融合術(shù)前5 min，將含有1 000 U/mL凝血酶的100 g/L CaCl2溶液按體積比1∶10加入PRP離心管中，混合搖勻。將FPT Cage置入直徑4 mm的橡皮軟管中，用5 mL注射器抽吸激活的PRP以浸泡橡皮管中的FPT Cage 1 min。

1.5 手術(shù)方法及術(shù)后處理

實驗犬給予3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉（1 mL/kg），術(shù)前30 min靜脈滴注頭孢拉定預(yù)防性抗感染。麻醉成功后，頸前路手術(shù)區(qū)域備皮并消毒鋪巾，頸前右側(cè)縱形切口，頸動脈鞘肌間隙入路顯露至頸前正中區(qū)域，必要時切斷頸長肌，充分顯露C4/5、C5/6椎間隙，助手手法牽引適度牽開椎間隙，刮匙清除椎間盤，牽引狀態(tài)下于C4/5椎間放置無PRP浸泡的FPT Cage，C5/6椎間放置PRP浸泡的FPT Cage，徹底止血并逐層關(guān)閉切口。麻醉蘇醒后觀察實驗犬四肢肌力變化及呼吸情況，并在術(shù)后24 h內(nèi)嚴(yán)密觀察實驗動物的生命體征，口服頭孢拉定膠囊粉末預(yù)防傷口感染。

實驗犬術(shù)后4個月在靜脈麻醉下快速失血方式致死，經(jīng)左心室先以100～150 mL、0.85%的生理鹽水灌注，再以300 mL、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配置的4%多聚甲醛（pH值7.4）灌流固定，灌注時間約持續(xù)30 min。頸椎標(biāo)本切取范圍從枕頸結(jié)合部至第一胸椎椎體，剔除周圍肌肉、韌帶，確認(rèn)C4/5、C5/6椎間隙后，完整切取C4～C6椎體和椎間隙并進(jìn)行影像學(xué)檢查。

1.6 影像學(xué)檢查

①頸椎標(biāo)本置于標(biāo)本床上，拍攝正側(cè)位X線片。②頸椎標(biāo)本安裝至合適樣品床，置于SkyScan 1076顯微CT掃描機的中心位置，預(yù)掃后設(shè)定電壓、電流、過濾器、分辨率，進(jìn)行平場矯正，設(shè)定掃描步長后掃描標(biāo)本。由兩位有經(jīng)驗的脊柱外科醫(yī)師采用雙盲法對X線片檢查和顯微CT檢查結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

2.1 PRP制備、激活和血小板計數(shù)

犬外周靜脈血中血小板計數(shù)為（154±52）× 109/L，PRP中血小板計數(shù)為（728±194）×109/L，約為外周靜脈血的4.71倍。PRP激活后約15 min形成肉眼可見的凝膠樣物質(zhì)，PRP激活后5 min內(nèi)，采用5 mL注射器反復(fù)抽吸浸泡的方法，以確保FTP Cage孔隙內(nèi)充滿激活中的PRP。

2.2 一般情況

手術(shù)順利，手術(shù)時間1.0～1.5 h，失血量50～80 mL，術(shù)后無神經(jīng)功能障礙，均成活至處死前，無傷口感染等手術(shù)并發(fā)癥。處死過程中肉眼觀察FPT Cage周圍無炎性組織，但有增生疤痕組織，所有椎間融合器肉眼未見明顯移位。

2.3 影像學(xué)檢查結(jié)果

結(jié)合X線片和顯微CT檢查結(jié)果，6例標(biāo)本中4例出現(xiàn)不同程度的C4/5節(jié)段Cage沉降，2例未出現(xiàn)沉降，但可以觀察到Cage部分向前移位；C5/6節(jié)段僅1例Cage向前移位，未發(fā)現(xiàn)Cage沉降。見圖2～4。

3 討論

3.1 融合器沉降對老年患者頸椎椎間融合的影響

椎間融合器沉降是融合器進(jìn)入鄰近椎體終板的一種影像學(xué)表現(xiàn)，沉降后椎間高度丟失，椎管狹窄，生理曲度改變，存在導(dǎo)致鄰近節(jié)段退變的潛在風(fēng)險。但其臨床重要性尚未得到證實，有研究認(rèn)為沉降與手術(shù)效果并無明顯相關(guān)性［10-11］。但我們認(rèn)為椎間器沉降所導(dǎo)致的局部生理曲度改變，不利于維持頸椎椎間生理高度和椎間孔高度，對患者遠(yuǎn)期療效可能造成不良影響。尤其是對于老年患者，由于同時存在骨質(zhì)疏松，其成骨能力較青壯年差，更易導(dǎo)致椎間融合器沉降的發(fā)生；其椎體與椎間融合器的彈性模量常不能匹配，這也是加劇融合器沉降的重要因素；而一旦椎間融合器發(fā)生沉降，沉降本身會反過來引起其與骨界面的力學(xué)狀態(tài)改變，成骨更為困難，更容易導(dǎo)致脊柱不融合或延遲融合等問題的發(fā)生。

圖2 Cage移位頸椎顯微CT檢查結(jié)果C4/5、C5/6椎間隙高度均得到維持，但C4/5、C5/6融合器均向前輕度移位圖3 C4/5Cage沉降、C5/6Cage未沉降頸椎正側(cè)位X線片3A C4/5椎間隙高度丟失，椎間融合部分進(jìn)入C4椎體內(nèi)3B C5/6間隙高度得到維持，融合器位置位于上下終板之間圖4 C4/5Cage沉降、C5/6Cage未沉降顯微CT檢查結(jié)果4A C4/5椎間隙高度丟失，椎間融合部分進(jìn)入C4椎體內(nèi)4B C5/6間隙高度得到維持，融合器位置位于椎間隙內(nèi)

至于椎間融合術(shù)式對頸椎手術(shù)融合器沉降的影響，多數(shù)術(shù)者會采取聯(lián)合前路鈦板固定來避免椎間融合器發(fā)生沉降，單獨應(yīng)用椎間融合器并不多見。Dai和Jiang［10］應(yīng)用碳纖維或聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）椎間融合器聯(lián)合前路鈦板固定，短期內(nèi)可起到減少椎間融合器沉降、增加植骨融合的效果，但長期隨訪結(jié)果并無明顯優(yōu)勢。Wu等［11］對單純應(yīng)用鈦椎間融合器的隨訪結(jié)果表明，隨訪期間椎間融合器沉降率和融合率均較高（分別為19.1%和100%），而沉降后患者的臨床療效并未受到影響，作者推測可能與沉降病例椎間孔高度并未明顯丟失有關(guān)。Kast等［12］的隨機對照研究結(jié)果顯示，PEEK椎間融合器的沉降率為29%，往往需要聯(lián)合前路鈦板才能減少沉降，提高骨融合率；但前路鈦板植入會產(chǎn)生應(yīng)力遮擋，且存在一定的操作風(fēng)險及并發(fā)癥，增加患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此仍傾向于單純應(yīng)用椎間融合器手術(shù)治療頸椎病，可取得確切的臨床療效，本實驗研究采取的就是單純椎間融合器手術(shù)，但其仍存在骨長入慢、需要長期輔助頸托等外固定的缺點。

3.2 FPT材料在骨質(zhì)疏松椎體椎間融合中的應(yīng)用

如前所述，F(xiàn)PT具有良好的骨傳導(dǎo)性和生物相容性，彈性模量更接近于人體頸椎，尤其是對于合并骨質(zhì)疏松的老年人，能夠滿足骨與關(guān)節(jié)復(fù)雜的生物力學(xué)要求，并可根據(jù)具體要求制備成不同形狀。本實驗采用的FPT材料孔隙直徑介于100～400 μm之間，孔隙率為58%～95%，與文獻(xiàn)報道的促進(jìn)骨長入的最佳多孔材料（孔隙直徑150～600 μm、孔隙率60%以上）相一致［7-8］。也就是說，由FPT制成的椎間融合器既可保持其在生物體內(nèi)的力學(xué)強度，又可減少金屬材料所產(chǎn)生的應(yīng)力遮擋，降低了因植入材料不當(dāng)而導(dǎo)致的手術(shù)失敗發(fā)生率。本實驗6例標(biāo)本中，未復(fù)合PRP的C4/5節(jié)段椎間融合器有4例出現(xiàn)不同程度的沉降，另2例雖未出現(xiàn)沉降，但亦可觀察到Cage的向前移位，這可能與比格犬頸椎不是垂直負(fù)重的生物力學(xué)特性有關(guān)，但也可能與FPT材料融合器骨長入過程緩慢、骨性融合時間較長有關(guān)。

3.3 復(fù)合PRP在阻止FPT椎間融合器沉降中的作用

為解決FPT材料骨長入緩慢、骨性融合時間長的缺點，學(xué)者們進(jìn)行了大量有益的嘗試。作為一種公認(rèn)的骨誘導(dǎo)因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）已廣泛應(yīng)用于骨科及口腔科組織修復(fù)中，但其來源有限，價格偏高，部分患者無法接受，應(yīng)用因此受到限制。對FPT進(jìn)行鈣磷涂層改性可達(dá)到促進(jìn)骨融合的目的。Vehof等［13］指出，鈣磷涂層的FPT材料復(fù)合大鼠骨髓細(xì)胞有更好的骨融合表現(xiàn)；但隨后該研究小組發(fā)現(xiàn)，鈣磷涂層的FPT材料填充轉(zhuǎn)移生長因子與未涂層組比較并未有明顯促進(jìn)骨融合的作用［14-15］，同樣的結(jié)果也被Kamoda等［16］的研究所證實。本研究考慮到PRP與鈣磷離子之間可能存在相互促進(jìn)或抑制的作用，因此未采用鈣磷涂層活化的FPT材料，而是通過無涂層處理的FPT頸椎椎間融合器復(fù)合PRP來達(dá)到促進(jìn)骨長入的目的。

PRP是一種源自自身周圍靜脈血、通過離心提取制作的含高濃度血小板的血漿，其利用鈣離子及凝血酶的激活、脫顆粒作用，釋放出大量的生長因子，刺激骨誘導(dǎo)及有絲分裂，加強骨愈合［17］。Marx等［18］提出，PRP中的血小板濃度必須是全血血小板濃度的4倍以上，否則只能稱之為貧血小板血漿，生長因子含量極低，無法達(dá)到促進(jìn)組織再生的作用。本實驗制備的PRP中血小板計數(shù)均為全血的4倍以上，具備產(chǎn)生大量生長因子（血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、類胰島素生長因子等）和促進(jìn)骨生長的作用。國外學(xué)者Kamoda等［16］將PRP復(fù)合羥基磷灰石應(yīng)用于大鼠腰椎椎間融合，影像學(xué)及組織學(xué)均證實其可獲得更高的椎間骨融合率；Scholz等［19］的研究結(jié)果表明，復(fù)合PRP可促進(jìn)填充自體骨的腰椎PEEK椎間融合器內(nèi)的骨融合。但也有不同的觀點，Cinotti等［20］認(rèn)為，PRP并未促進(jìn)兔腰椎后外側(cè)自體植骨融合過程；Sys等［21］的臨床研究亦表明，腰椎后路單節(jié)段椎間融合過程中復(fù)合PRP的自體植骨無明顯促進(jìn)骨融合的作用。本實驗影像學(xué)檢查結(jié)果支持前一種觀點，在C5/6節(jié)段活動范圍比C4/5節(jié)段更大、椎間融合時更容易發(fā)生沉降的情況下，復(fù)合PRP的C5/6節(jié)段椎間融合器未觀察到沉降，僅有1例Cage向前移位；而未復(fù)合有PRP的C4/5節(jié)段椎間融合器有4例出現(xiàn)不同程度的沉降，另2例雖未出現(xiàn)沉降，但亦發(fā)生Cage的向前移位。這有力地證明復(fù)合PRP能夠促進(jìn)FPT頸椎椎間融合器的骨長入，對減少融合器沉降起到重要作用。其他需要考慮的因素還包括，PRP對C5/6節(jié)段FPT椎間融合器內(nèi)骨長入和植骨融合過程的促進(jìn)作用，使鄰近節(jié)段的活動范圍增加，由此導(dǎo)致未復(fù)合PRP的C4/5節(jié)段椎間融合器更易發(fā)生沉降。

3.4 不足之處

不同種類的動物對于生長因子及椎間融合器的反應(yīng)有可能不同，這使得該實驗結(jié)果不能完全適用于人類。生理狀態(tài)下，無法直立行走的比格犬并不能完全模擬人類正常狀況下的頸椎生物力學(xué)環(huán)境，即比格犬椎間骨融合過程中缺乏應(yīng)力刺激促進(jìn)骨細(xì)胞生長的因素。但是目前還無法在動物實驗中找到方法來完全模擬人類正常狀態(tài)下的生物力學(xué)狀態(tài)，本研究采用的自身對照方法能部分規(guī)避非人類生理狀態(tài)的因素。此外，本研究樣本量較小，隨訪時間較短，需要將來通過大樣本長期隨訪來動態(tài)觀察復(fù)合PRP的FPT椎間融合器是否可以持續(xù)保持椎間高度，避免椎間融合器沉降；本實驗亦未測定植入動物體內(nèi)PRP中的生長因子濃度，能夠起到促進(jìn)骨愈合的生長因子最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of platelet-rich plasma on subsidence of fiber porous titanium Cage for old dogs with anterior cervical interbody fusion

CAO Shifeng*，XIE Ning，SONG Xin，ZHAO Zhenguo，NI Ming，JIAO Kun，YIN Weizhong.*Department of Orthopaedics，Pudong New Area People's Hospital，Shanghai 201200，China.

Objective To observe the effects of platelet-rich plasma（PRP）on subsidence of fiber porous titanium（FPT）Cage for old beagle dogs with anterior cervical interbody fusion.Methods Six old healthy beagle dogs（3 male and 3 female，weighing 12.5-15.0 kg，aged 7-9 years）were selected in this study.Peripheral venous blood from dog's forelimb was collected，PRP was prepared by double centrifugal methods，and blood platelet counts of peripheral venous blood and PRP were recorded.Then the dogs underwent anterior C4/5 and C5/6 discectomy and FPT Cage interbody fusion.FPT Cage was used alone at C4/5 segment，and at C5/6 segment，F(xiàn)PT Cage was augmented with PRP.The animals were sacrificed in 4 months after the surgery，and the subsidence of FPT Cage was evaluated byray and Micro-CT examinations.Results Subsidence of FPT Cagewas found at four C4/5 segments，other two FPT Cages at C4/5 segment showed anterior migration；No subsidence of FPT Cage was observed at six C5/6 segments，only one FPT Cage with anterior dislocation was found.Conclusion Compound PRP could reduce the subsidence of FPT Cage in old aged Beagle dogs with anterior cervical interbody fusion.

Platelet-rich plasma；Platelet activation；Osteoporosis；Cervical vertebrae；Spinal fusion；Interbody fusion cage；Titanium；Subsidence；Micro-CT；Dogs

R687.3，R681.4，R977.8

A

1674-666X（2015）04-214-07

2015-06-07；

2015-07-15）

（本文編輯：白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2015.04.004

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新基金（PKJ2012-Y57）

201200上海，浦東新區(qū)人民醫(yī)院骨科（曹師鋒，宋鑫，倪明，焦鯤，尹偉忠），放射科（趙振國）；200003上海，長征醫(yī)院骨科（謝寧）

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