王春蕾+劉華良+馬永建+阮麗萍
摘 要 建立了植物油中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的在線固相萃取-高效液相色譜-紫外/熒光(online-SPE-HPLC-UV/FLD)檢測分析方法。食用油樣品經(jīng)異丙醇稀釋定容并過濾,固相萃取柱ChromSpher Pi (80 mm×3 mm)在線凈化,反相C18 PAH專用柱(250 mm×4.6 mm i.d,5 μm)分離,異丙醇、乙腈和水為流動相,梯度洗脫,紫外(220 nm)和熒光檢測器檢測。結(jié)果表明,15+1種多環(huán)芳烴在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度之間線性良好(R2>0.99);檢出限為0.03~12.23 μg/kg;3個水平加標(biāo)回收率為65.3%~110.5%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%~9.8%。
關(guān)鍵詞 在線固相萃??;多環(huán)芳烴;高效液相色譜;食用油
1 引 言
多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是普遍存在的持久性環(huán)境污染物,有機(jī)物的不完全燃燒和熱分解、地質(zhì)化學(xué)過程都可能產(chǎn)生PAHs[1,2]。部分PAHs具有致癌性和遺傳毒性,沒有致癌性的PAHs可以作為促癌劑,對人體健康造成嚴(yán)重危害[3]。 1979年美國環(huán)保署(EPA)列出了16種優(yōu)控PAHs,2008年歐盟食品安全局(EFSA)對食品中PAHs進(jìn)行評估,列出了15+1種優(yōu)控PAHs(15+1 EU- priority PAHs),與EPA優(yōu)控PAHs有8種相同,包含更多毒性較大的重質(zhì)PAHs,目前的檢測方法大多是針對EPA列出的16種PAHs,而對歐盟優(yōu)控PAHs報道較少。
由于PAHs的親脂性,在食用油生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸過程中可能因環(huán)境污染或者加工不當(dāng)而被污染[4~6]。一些機(jī)構(gòu)和組織也制定了相關(guān)的衛(wèi)生限值,GB2762—2012規(guī)定食用油中苯并(a)芘的含量≤10 μg/kg[7,8],歐盟法規(guī)No 835/2011規(guī)定除了可可油和椰子油,其它油脂中苯并(a)芘≤2 μg/kg,4種PAHs(苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽和苯并(a)芘)之和≤10 μg/kg[9,10]。PAHs提取方法主要有離線和在線兩大類,常用的離線方法有液液萃?。↙LE)[10,11]、固相萃?。⊿PE)[12,13]、凝膠滲透色譜(GPC)[14]和供體受體復(fù)合色譜法(DACC)[15,16]等,這些方法大多有復(fù)雜的前處理過程,費(fèi)時費(fèi)力,消耗大量有機(jī)溶劑;也有研究建立了基于DACC的在線凈化方法[17,18],但是并不能同時檢測歐盟優(yōu)控PAHs。
本研究建立了檢測食用油中15+1種歐盟優(yōu)控PAHs的在線分析方法,采用在線固相萃?。╫nline-SPE)凈化,高效液相色譜紫外/熒光檢測器(HPLC-UV/FLD)定量分析。online-SPE的原理是基于DACC,PAHs是π電子供體,與π電子受體的固定相結(jié)合而被保留在固定相中。這種在線分析方法可以減少有機(jī)溶劑的使用,大大縮短分析時間。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo公司),配有3400型紫外檢測器,3100型熒光檢測器;Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司);渦旋振蕩器(德國IKA公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Sartorius公司);分析天平(德國Sartorius公司)。
乙腈(ACN)、異丙醇(IPA)均為色譜純(德國默克股份兩合公司);水為超純水;15
種歐盟優(yōu)控PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(德國Dr. Ehrenstorfer公司):環(huán)戊烯(c,d)芘(cyclopenta(c,d)pyrene,CPP)、苯并(a)蒽(Benzo(a)anthracene,BaA)、GFDA2(Chrysene,Chr)、5-甲基-1,2-苯并菲(5-methylchrysene,SMC)、苯并(b)熒蒽(Benzo(b)fluoranthene,BbF)、苯并(j)熒蒽(Benzo(j)fluoranthene,BjF)、苯并(k)熒蒽(Benzo(k)fluoranthene,BkF)、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,BaP)、二苯并(a, h)蒽(Dibenzo(a,h)anthracene, DaA)、苯并(g,h,i)苝(Benzo(g,hi)perylene,BgP)、茚并(1,2,3-cd)芘(Indeno(1,2,3-cd)pyrene,IcP)、二苯并(a,e)芘(Dibenzo(a,e)pyrene,DeP)、二苯并(a,h)芘(Dibenzo(a,h)pyrene,DhP)、二苯并(a,i)芘(Dibenzo(a,i)pyrene,DiP)、二苯并(a,l)芘(Dibenzo(a,l)pyrene,DlP),苯并(c)芴(benzo(c)fluorene,BcF),每種物質(zhì)為10 μg/mL的ACN溶液。
2.2 實驗方法
2.2.1 空白油樣制備
稱取約40 g食用油,加入5%活性炭,90℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h,離心后上層液過0.45 μm濾膜。 稱取食用油樣品4.0 g(精確至0.01 g), 用IPA溶解并定容至5 mL,混勻過0.45 μm濾膜,待測。
2.2.2 色譜條件
在線固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm,Thermo公司),分析柱C18 PAH專用柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Waters公司),柱溫30℃,進(jìn)樣盤溫度40℃~45℃,根據(jù)油的性狀進(jìn)行調(diào)整,進(jìn)樣量40 μL,萃取柱用IPA、ACN和水梯度洗脫:0~5 min,100% IPA,流速為0.5 mL/min;5.2~7.0 min,60% ACN,流速為0.5 mL/min;8~29 min,流速為0;30~69 min,100% ACN,流速為0.5 mL/min; 70 min后回到初始狀態(tài)。分析柱用ACN和水梯度洗脫:0~5 min,60% ACN,流速為0.5 mL/min;6~30 min,60% ACN,流速為1.2 mL/min;30~48 min,60%~100% ACN,流速為1.2 mL/min;48~55 min,100% ACN,流速為1.2 mL/min;55~56 min,100% ACN,流速1.2~2.0 mL/min,維持至80 min; 80 min后回到初始狀態(tài)。0~7 min為萃取階段,7~30 min為轉(zhuǎn)移階段,30~88 min為分析平衡階段,分別在7和30 min處進(jìn)行閥切換,具體切換通路見圖1。endprint
圖1 不同階段閥切換通路
Fig.1 Column switching mechanism in different periods
3 結(jié)果與討論
3.1 在線萃取條件優(yōu)化
在線萃取采用ChromSpher Pi柱,運(yùn)用供體與受體結(jié)合的原理進(jìn)行在線凈化,參考文獻(xiàn)[19]的方法,用IPA上樣。研究表明,用IPA上樣流速不宜過大。國外已有的在線凈化技術(shù)的上樣體積較大,通常大于100 μL,洗脫時間約為10~12 min, 運(yùn)用2個六通閥進(jìn)行切換,兩根色譜柱實現(xiàn)分離[18,19],過程較為復(fù)雜。本研究采用小體積上樣,1個六通閥切換,1根色譜柱分離,可以縮短萃取時間,操作簡單。采用100% IPA上樣,去除油中大分子脂肪酸和色素物質(zhì),上樣結(jié)束后切換六通閥, 用ACN-H2O,去除多余的IPA,過渡到分析柱的洗脫條件。分析柱的初始濃度為60% ACN,為縮小峰寬,改善峰形,同時減少有機(jī)溶劑的使用,采用40%ACN進(jìn)行過渡。
3.2 色譜條件優(yōu)化
在實驗階段,比較Thermo公司和Waters公司的C18 PAH專用柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),前者無法分離出最后兩種物質(zhì)(DiP和DhP),后者可以達(dá)到較好的分離效果。優(yōu)化洗脫梯度和流速,采用ACN和水為流動相,梯度洗脫。為降低食用油的粘性,適當(dāng)提高進(jìn)樣盤的溫度,一般液態(tài)油為40℃,對于半固體油樣可以設(shè)為45℃??疾熘鶞兀?5℃~35℃)對分離效果的影響(圖2,在30℃條件下可以達(dá)到較好的分離效果。Dip和Dhp在色譜柱上保留較強(qiáng),在不影響前14種物質(zhì)分離的條件下,后期加大流速,洗脫最后兩種物質(zhì)。
3.3 檢測波長的選擇
CCP無熒光,用UV檢測,波長為220 nm;歐盟優(yōu)控的15種PAHs的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長不同,研究者一般采用多通道檢測器,本實驗室儀器無法進(jìn)行多通道熒光檢測,采用分時間段切換波長,具體見表1。所得15種熒光PAHs的色譜圖見圖3,CPP無熒光性,用紫外檢測器檢測(見圖4)。
3.4 方法學(xué)驗證
用IPA配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以濃度值為橫坐標(biāo),平均峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測得峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99,在空白油樣中進(jìn)
圖3 15種PAHs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(8 ng/mL)色譜圖
Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)(8 ng/mL)
圖4 CPP(80 ng/mL)紫外檢測色譜圖
Fig.4 Chromatogram of cyclopenta (c,d) pyrene
(CPP) under UV detection(80 ng/mL)
行低、中、高3個水平加標(biāo),每水平重復(fù)測定6次,計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,回收率為65.25%~110.53%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%~9.8%。CPP在UV上響應(yīng)值較低,3個水平回收率均不高; IcP含5個苯環(huán)結(jié)構(gòu),但出峰時間較6環(huán)的BgP晚,空間構(gòu)型比較特殊,可能因其特殊的空間構(gòu)型導(dǎo)致低濃度時在SPE柱上保留減弱造成回收率較低。本方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確性。根據(jù)3倍信噪比(S/N)確定LOD,10倍S/N為LOQ,具體見表2。
3.5 實際樣品測定
采用本方法檢測常用的大豆油、葵花籽油等共10種食用油中歐盟優(yōu)控15+1種PAHs的含量,結(jié)果見表3。根據(jù)我國和歐盟關(guān)于PAHs的限量標(biāo)準(zhǔn),其中葡萄籽油中BaP超標(biāo)(>10 μg/kg),葵花籽油、花生油和紫蘇籽油中Bap超過歐盟限量(>2 μg/kg);葵花籽油、花生油、葡萄籽油和紫蘇籽油中BaA, Chr, BbF和BaP之和>10 μg/kg,不滿足歐盟限量標(biāo)準(zhǔn);這10種油中均未檢出CPP和DhP。
4 結(jié) 論
建立了在線固相萃取技術(shù)檢測植物油中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的分析方法。通過優(yōu)化在線萃取和分析條件,可以實現(xiàn)15+1種物質(zhì)的有效分離。本方法與常規(guī)離線方法相比操作簡單,省時省力,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可以滿足我國和國際上對PAHs定量分析的要求,并且大大減少了分析時間,可用于日常分析。
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