朱作藝+張玉+王君虹+李雪+王偉

摘 要 建立了一種離子色譜分離，抑制電導(dǎo)直接檢測(cè)肌苷酸的新方法。采用高交換容量陰離子交換柱Ionpac AS11-HC，以30 mmol/L KOH在線等度淋洗，可在短時(shí)間內(nèi)完成肌苷酸的檢測(cè)，且7種常規(guī)陰離子對(duì)其測(cè)定不存在干擾。采用本方法測(cè)定肌苷酸的線性范圍為1.0～200 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999，線性關(guān)系良好。肌苷酸保留時(shí)間、峰高和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.16%， 0.94%和0.86%，方法具有較好的重現(xiàn)性。本方法可應(yīng)用于肉類產(chǎn)品中肌苷酸含量的測(cè)定，樣品實(shí)際加標(biāo)回收率范圍在86.0%～110.0%之間。該方法簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確、可靠，為肉類鮮味成分研究提供了一種快速及有效的分析方法。

關(guān)鍵詞 離子色譜； 抑制電導(dǎo)； 肌苷酸； 肉類產(chǎn)品

1 引 言

肌苷酸（Inosine monophosphate， IMP）又稱為次黃嘌呤核苷酸，最早于1847年由德國(guó)化學(xué)家Liebig在牛肉組織中發(fā)現(xiàn)。1913年，Kodama和Kuninuka發(fā)現(xiàn)肌苷酸的鮮味特征，其增加鮮味的能力較谷氨酸鈉強(qiáng)40倍。肌苷酸廣泛存在于動(dòng)物肌肉組織中，其含量是衡量肉質(zhì)鮮味的重要指標(biāo)[1～3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展及生活水平的提高，人們對(duì)肉類食品的需求日益增加，對(duì)肉品質(zhì)的要求也越來(lái)越高，肌苷酸含量已成為于各種肉類產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)定的指標(biāo)。因此測(cè)定肉類食品中肌苷酸的含量，對(duì)研究肉類食品風(fēng)味及呈味物質(zhì)之間的相互關(guān)系具有非常重要的意義。

肌苷酸主要測(cè)定方法有分光光度法[4]、高效液相色譜法[5～9]、反相離子對(duì)色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11，12]，目前采用最多的是高效液相色譜法，然而由于肌苷酸疏水性相對(duì)較弱，高效液相色譜法對(duì)肌苷酸保留較弱，保留時(shí)間接近死時(shí)間，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品容易存在干擾，因此有研究者采用反相離子對(duì)色譜法[10]。離子色譜法（Ion chromatography， IC）是一種分析無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、有機(jī)陰陽(yáng)離子的高效分離檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)[13]。肌苷酸易溶于水，在中性和堿性溶液中穩(wěn)定，在pH<4的條件下穩(wěn)定性較差，容易降解為次黃嘌呤和D-核糖[14]，由于肌苷酸帶有磷酸基團(tuán)，在堿性水溶液中可離解為離子態(tài)，因此可以直接采用IC進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立了一種陰離子色譜交換分離-抑制電導(dǎo)直接檢測(cè)肌苷酸含量的方法，并應(yīng)用于雞肉、魚(yú)肉、豬肉、牛肉等實(shí)際樣品的測(cè)定。本方法簡(jiǎn)單、方便、高效、選擇性好。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Dionex ICS-3000離子色譜儀（美國(guó)戴安公司），配自動(dòng)EG淋洗液發(fā)生器和DS6電導(dǎo)檢測(cè)器、Chromeleon 6.80色譜工作站、Dionex IonPac AG11-HC （50 mm×4 mm） 保護(hù)柱+Dionex IonPac AS11-HC （250 mm×4 mm） 分離柱、Dionex ASRS 300-4 mm電化學(xué)自再生抑制器；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；超聲波儀（上海生析超聲儀器有限公司）；0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾頭。

標(biāo)準(zhǔn)品5-肌苷酸二鈉（Sigma公司），實(shí)驗(yàn)室用水均為18.2 MΩ·cm去離子水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制1000 mg/L 5′-肌苷酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃保存；將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成1.0， 2.0， 5.0， 10， 20， 50， 100和 200 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.3 樣品制備

目前肉類產(chǎn)品中的肌苷酸含量普遍采用H3ClO4作提取液，由于H3ClO4提取液的pH值較低，容易造成肌苷酸降解，因此采用純水提取肌苷酸[5]。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，肌苷酸純水提取法比普通H3ClO4提取法的提取率高37%。分別稱取雞肉、魚(yú)肉、豬肉、牛肉樣品各5.0 g，放入200 mL燒杯中，加入90 mL 95℃的去離子水，將燒杯放入恒溫水浴中，保持水溫95℃ 5 min，超聲波提取30 min，冷卻至室溫后定容至100 mL，濾紙過(guò)濾后，取濾液1.0 mL，分別加入2.0 mL去離子水和2.0 mL乙腈，渦旋振蕩1.0 min， 以4000 r/min離心10 min后，取上清液，經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾，供離子色譜測(cè)定。

2.4 色譜條件

色譜柱為Dionex IonPac AG11-HC保護(hù)柱+Dionex IonPac AS11-HC分離柱；柱溫為30℃；采用30 mmol/L KOH在線等度淋洗；流速為1.0 mL/min；自再生電化學(xué)抑制模式，抑制電流為75 mA；電導(dǎo)檢測(cè)；進(jìn)樣體積為25 μL；外標(biāo)法峰面積定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

從肌苷酸結(jié)構(gòu)（圖1）可知，肌苷酸帶有磷酸基團(tuán)，因此在堿性條件下可解離成陰離子，可以采用陰離子交換色譜對(duì)其進(jìn)行分離。同時(shí)，由于肌苷酸仍具有一定的疏水性，為了保證其在色譜柱上的快速洗脫，不宜采用疏水性較強(qiáng)的陰離子交換柱。本實(shí)驗(yàn)選用疏水性較弱的Ionpac AS11-HC高交換容量色譜柱分離肌苷酸，采用KOH溶液作為淋洗液。由于KOH溶液容易吸收空氣中的CO2而改變淋洗液組成，因此采用自動(dòng)淋洗液發(fā)生器在線產(chǎn)生KOH溶液，等度洗脫方式。為了得到較好的分離效果及合理的分析時(shí)間，對(duì)KOH淋洗液條件進(jìn)行了優(yōu)化（圖2），

當(dāng)采用50 mmol/L KOH在線淋洗時(shí)，肌苷酸保留時(shí)間短，接近系統(tǒng)時(shí)間，在此條件下，樣品基質(zhì)易對(duì)肌苷酸測(cè)定造成干擾；采用30 mmol/L KOH在線淋洗時(shí)，肌苷酸保留時(shí)間為6.0 min，保留時(shí)間適中，峰型對(duì)稱；采用15 mmol/L KOH在線淋洗時(shí)，肌苷酸保留時(shí)間為9.0 min，峰型效果較差，存在拖尾。為保證較好的分離效果和效率，最后采用30 mmol/L KOH作為最佳淋洗液。 圖2 不同淋洗液條件下肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Chromatogram of IMP standard with different eluentsendprint

a. 50 mmol/L KOH； b. 30 mmol/L KOH； c. 15 mmol/L KOH.

由于實(shí)際肉類樣品成分復(fù)雜，通常含有Cl、NO3、SO24等常規(guī)陰離子，為驗(yàn)證在選擇的色譜條件下常規(guī)陰離子對(duì)目標(biāo)分析離子的干擾性，配制了含F(xiàn)（2.0 mg/L）、Cl（15 mg/L）、NO2（2.0 mg/L）、Br2.0 mg/L）、NO3（10 mg/L）、SO24（10 mg/L）、PO34（5.0 mg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于上述最佳淋洗液條件下直接進(jìn)樣測(cè)定。由于淋洗液濃度相對(duì)較高，7種常規(guī)陰離子均在5 min內(nèi)出峰（圖3），同時(shí)未實(shí)現(xiàn)完全分離，但從出峰順序可知，7種常規(guī)陰離子對(duì)肌苷酸的測(cè)定不存在干擾。

3.2 線性關(guān)系、重現(xiàn)性及方法的檢出限

采用上述優(yōu)化后的色譜條件，分別對(duì)肌苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以相應(yīng)的色譜峰面積（y）對(duì)其質(zhì)量濃度（x，mg/L）進(jìn)行線性回歸（圖4）。肌苷酸濃度1.0～200 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.0153x+0.002，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999。在優(yōu)化后的色譜條件下，分析50 mg/L肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，其保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.16%，色譜峰高RSD為0.94%，色譜峰面積RSD為0.86%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。將肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成相應(yīng)濃度，當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，得到肌苷酸儀器檢出限為0.2 mg/L。采用2.3節(jié)中樣品前處理方法，并將樣品稀釋了100倍，因此肌苷酸的樣品檢出限為20 mg/kg。

3.3 樣品測(cè)定及加標(biāo)回收試驗(yàn)

按2.2節(jié)分別對(duì)雞肉、小黃魚(yú)、豬肉和牛肉樣品進(jìn)行前處理，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，其中小黃魚(yú)和牛肉樣品色譜圖見(jiàn)圖5A和5B。從圖5可見(jiàn)，采用本方法，樣品基質(zhì)對(duì)肌苷酸測(cè)定不存在干擾。通過(guò)外標(biāo)法定量，雞肉、魚(yú)肉、豬肉和牛肉樣品中肌苷酸含量分別為1.71、2.70、3.05和2.38 g/kg。為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性， 分別選取4種肉類樣品，添加3個(gè)不同水平肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率測(cè)定。由表1可見(jiàn)，回收率范圍為86.0%～110.0%，RSD范圍為0.1%～2.3%。

本研究建立的離子色譜-抑制電導(dǎo)檢測(cè)肌苷酸的方法操作簡(jiǎn)單、高效快速，具有較好的的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度，適用于肉類樣品中肌苷酸含量的測(cè)定，為肉類鮮味成分研究的提供了一種新型、簡(jiǎn)便、高效的分離分析方法。

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