朱明珍 徐海燕 朱志霞 蔣 華

目前，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占整個(gè)肺癌的80% ～85%，是國內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［1］，晚期NSCLC的主要治療手段是化療，其中鉑類(順鉑、卡鉑)是必不可少的一線治療藥物。近年來發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1 alph)在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、放化療抵抗及預(yù)后等密切相關(guān)［2］。近期研究表明，交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing group 1，ERCC1)表達(dá)水平的高低與多種腫瘤的鉑類耐藥相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)其118位密碼子上存在C→T的多態(tài)性，此突變最終導(dǎo)致不同基因型的患者呈現(xiàn)鉑類化療療效的差異［3］。本文通過研究上述2種基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與鉑類化療近期療效的相關(guān)性，旨在探討指導(dǎo)肺癌患者個(gè)體化用藥的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2012年1月－2014年6月連云港市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的晚期NSCLC初治患者68例為研究對象，年齡≤80歲，均為連云港本市人，漢族，將研究對象的性別、年齡、吸煙情況、病理組織學(xué)類型及臨床分期等基本特征總結(jié)成表1所示。

表1 晚期NSCLC患者的臨床病理特征

所有患者均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診，有經(jīng)CT或MRI等掃描可測量的實(shí)體病灶?；熐把Ｒ?guī)和肝腎功能在正常范圍內(nèi)，心電圖正常，Karnofsky功能狀態(tài)(karnofsky performance status，KPS)評分均≥70分。化療前與患者簽署知情同意書，并抽取靜脈血標(biāo)本2 ml裝入抗凝試管內(nèi)，提取外周血基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 化療方案

患者均采用鉑類聯(lián)合方案:鉑類藥物有順鉑(cisplatin，DDP，25 mg/m2，d 2 ～ 5)、卡鉑(Carboplatin，CBP，AUC=5，第2天);其它聯(lián)合藥物可選擇吉西他濱(Gemcitabine，Gem，1 000 ～ 1 250 mg/m2，第 1、8 d;)、多西紫杉醇(Docetaxel，DOC，60 ～75 mg/m2，第 1 d，維持 1 h)、培美曲塞(Pemetrexed，500 mg/m2，第 1 d，維持10 min)，接受多西紫杉醇和培美曲塞化療患者常規(guī)服藥預(yù)處理。上述各方案每3～4周重復(fù)1次，2個(gè)周期后按實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)進(jìn)行療效評價(jià)。

1.3 療效評價(jià)

按RECIST進(jìn)行療效評價(jià):完全緩解(complete response，CR)，所有目標(biāo)灶消失且至少維持4周;部分緩解(partial response，PR)，腫瘤最大徑之和至少縮小30%，并至少維持4周;疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)，病灶縮小未達(dá)PR或增加未到PD;疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)，病灶最大徑之和增大≥20% 或出現(xiàn)新病灶。參考國內(nèi)外同類研究，設(shè)定(CR+PR)為有效，(SD+PD)為無效。

1.4 聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法

1.4.1 基因組DNA的提取 用無菌抗凝真空管(乙二胺乙酸鈉抗凝負(fù)壓管)收集患者化療前一天清晨外周靜脈血2 ml，2 h內(nèi)采用DNA試劑盒(購自生工生物工程上海股份有限公司)。按試劑盒上的步驟提取血液基因組DNA，所提取的DNA在紫外分光光度儀上測量OD 260/OD 280值，用以計(jì)算DNA純度與濃度。－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考 NCBI人類 HIF-1αDNA 序列，應(yīng)用 Primer Desig ner 3.0.0.1 版軟件輔助設(shè)計(jì)引物HI F-1α C1772T基因序列:rs11549465-F，5 ＇GGACACAGATTTAGACTTGGAGAT 3 ＇;rs11549465-R，5＇GGTGGCATTAGCAGTAGGTTC 3＇;產(chǎn)物大小為187 bp。選擇文獻(xiàn)提供的 ERCC1基因(codon 118 Asn118Asn)引物序列:rs11615-F，5＇TCCCTATTGATGGCTTCTGC 3＇;rs11615-R，5＇TTCCTGAAGTCTGGGGTGG 3＇;產(chǎn)物大小為175 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 50 μL PCR反應(yīng)體系(均由生工生物工程股份有限公司提供):模板DNA 1 μL、上下引物各 1 μL、dNTP 10 mM 1 μL、Taq buffer 5 μL、25 mM MgCl25 μL、Taq 酶 5 U/μl 0.5 μL、水35.5 μL。反應(yīng)在 Gene Amp 2700 PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃ ～60℃退火35 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃修復(fù)延伸5 min。

1.4.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析及鑒定基因型 限制性酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系 10 μL:去離子水3.5 μL，10 ×Buffer B 1 μL，HphⅠ內(nèi)切酶 5U，PCR 產(chǎn)物 5 μL。離心機(jī)瞬時(shí)離心混勻，37.0℃水浴12～16 h。酶切條件及步驟主要參考說明書。鑒定基因型(應(yīng)用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，生工SK1141):分別取5 μL PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，以溴化乙錠(EB)為染色劑，在1%瓊脂糖凝膠150 V、100 mA條件下，電泳20 min后，凝膠成像儀下觀察帶型，分出基因型，加以分析整理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Logistic回歸模型分析各基因位點(diǎn)多態(tài)性與鉑類藥物療效的關(guān)聯(lián)性，不同基因型之間化療療效的差異采用χ2檢驗(yàn)，采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118基因型頻率

68例晚期NSCLC患者中，HIF-1α C1772T存在3種等位基因型(圖1A):C/C型占83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)、T/T型占 0(0/68);ERCC1 codon 118也存在3種基因型(圖1B)，分別為:C/C型占 61.76%(42/68)、C/T 型占 32.35%(22/68)、T/T型占5.88%(4/68)。

圖1 PCR-RFLP法檢測HIF-1α和ERCC1基因型多態(tài)位點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 HIF-1α和ERCC1基因的平衡檢測

對檢測的基因型分布情況應(yīng)用Hardy-Weinberg定律進(jìn)行遺傳平衡，HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118的位點(diǎn)檢測結(jié)果顯示，P均＞0.05，故該樣本來自同一孟德爾群體，達(dá)到了遺傳平衡，見表2。

2.3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP與鉑類化療療效的相關(guān)性

分析患者的性別、年齡、病理組織學(xué)類型及臨床分期等多項(xiàng)因素對晚期NSCLC患者化療療效的影響，結(jié)果顯示，以上所有因素對晚期NSCLC患者含鉑化療療效無顯著影響(P均＞0.05)。68例患者均完成2個(gè)周期化療，CR 1例，PR 21例，SD 30例，PD 16例，總有效率為32.35%(22/68)。

因兩基因攜帶T/T基因型例數(shù)均較少，故將其與C/T合并，均分組為 C/C型和 C/T+T/T型。患者HIF-1α C1772T有效組分別為:C/C型 19/57(33.33%)、C/T+T/T 型 3/11(27.27%)，化療有效率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.694)，攜帶C/C等位基因者對化療的敏感性是T基因型的1.333倍(95%可信區(qū)間為 0.317～5.609);無效組分別為 38/57(66.67%)、8/11(72.73%)。ERCC1codon118有效組分別為:C/C型18/42(42.86%)、C/T+T/T型4/26(15.38%)，化療有效率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，攜帶C/C等位基因者對化療的敏感性是T基因型的4.125倍(95%可信區(qū)間為1.208～14.097);無效組的分別為 24/42(57.14%)、22/26(84.62%)。

表2 影響晚期NSCLC患者化療療效的臨床因素/例

進(jìn)一步分析HIF-1α C1772T與ERCC1 codon 118各基因型聯(lián)合與化療療效的關(guān)系，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶HIF-1α C1772T C/C型及ERCC1 codon 118 C/C基因型患者化療有效組中有13例，無效組中有9例，有效率為59.09%(13/22)，與其他基因型的聯(lián)合化療總有效率［19.57%(9/46)］相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見表 3。

表3 HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118 SNP與晚期NSCLC含鉑化療近期療效的關(guān)系/例

3 討論

晚期NSCLC的治療主要采用鉑類聯(lián)合三代新藥作為常用的一線化疔方案。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，即使臨床分期及一般狀況相同、藥物使用劑量相同、不同個(gè)體對化療的敏感性仍存在很大差異，且這種差異不能用年齡及用藥等因素加以解釋，依靠傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行治療面臨極大挑戰(zhàn)，因此迫切需要一種或幾種能夠預(yù)測鉑類藥物化療療效的方法，為晚期肺癌的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

SNPs是指在個(gè)體基因組DNA序列中內(nèi)頻率大于1%的單個(gè)核苷酸變異，這種變異有時(shí)導(dǎo)致其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而影響其生物學(xué)功能，在腫瘤治療領(lǐng)域主要表現(xiàn)為不同SNPs基因組患者對治療發(fā)生不同的反應(yīng)。當(dāng)前對于DNA修復(fù)基因ERCC1的研究較為深入并達(dá)成了共識:ERCC1陽性表達(dá)可作為鉑類耐藥的預(yù)測因子，但還不足以將其推薦作為臨床常規(guī)檢測，比如ERCC1低表達(dá)的患者接受鉑類化療后，僅有1/2左右的患者從中獲益，而相當(dāng)一部分患者無法獲益，怎樣選擇能夠更受益的患者進(jìn)行化療是近年來研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［4］。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的增殖及凋亡有關(guān)，腫瘤的缺氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤物理環(huán)境的基本特征之一，研究表明腫瘤乏氧不僅與放射治療抵抗有關(guān)，也與藥物抵抗、惡性侵襲的生物學(xué)行為及不良預(yù)后有關(guān)。實(shí)體瘤中腫瘤細(xì)胞缺氧是一種相對普遍的現(xiàn)象［5］，目前已知直接受HIF-1調(diào)控的基因有60余種，涉及到血管發(fā)生、紅細(xì)胞生成、能量代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及腫瘤放化療抵抗性等多個(gè)方面［6］，其中HIF-1α起重要作用，是一個(gè)新近較受關(guān)注的因子，在大多數(shù)人類腫瘤中存在HIF-1α的過表達(dá)，現(xiàn)已證實(shí)該基因在多種腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［2］。關(guān)于HIF-1α在患者個(gè)體之間是否存在變異，以及其自身的特點(diǎn)是否導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對DNA相關(guān)細(xì)胞毒性藥物敏感性的差異，都值得深入研究。

本研究觀察68例晚期NSCLC患者的HIF-1α C1772T位點(diǎn)和ERCC1 codon 118位點(diǎn)SNP與接受鉑類藥物為主的聯(lián)合方案療效的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)68例晚期NSCLC患者HIF-1α C1772T位點(diǎn)的3種基因型頻率分別為 C/C型占 83.82%(57/68)、C/T型占16.17%(11/68)，無 T/T 型。C/C 基因型 19/57(33.33%)的患者對含鉑化療的近期療效高于C/T+T/T基因型3/11(27.27%)患者，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.694)。ERCC1 118位點(diǎn)與鉑類藥物療效與國內(nèi)外研究結(jié)果［7］基本相一致:ERCC1 codon 118 C/C基因型18/42(42.86%)的患者對含鉑化療的近期療效優(yōu)于C/T+T/T型4/26(15.38%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。研究并發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶HIF-1α C1772T C/C基因型和ERCC1 118 C/C基因型的化療療效與其他組合基因型相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，值得進(jìn)一步研究。

本研究顯示聯(lián)合檢測HIF-1α C1772T和ERCC1 codon 118多態(tài)性對晚期NSCLC鉑類近期療效有一定的預(yù)測意義。對于晚期患者來說，組織標(biāo)本往往很難獲得，本實(shí)驗(yàn)是從外周血中提取DNA，較為便捷，避免了從許多未接受手術(shù)的患者處獲取組織的困難，臨床具有一定的可行性［8］。下一步我們將全組患者進(jìn)行隨訪，并在今后對HIF-1α和ERCC1基因多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌患者生存的關(guān)系方面作出評價(jià)，以便更好地指導(dǎo)臨床分析與治療。

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