張 萌 張海燕 姚宏波 王月靜 孫麗慧▲

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

OPCs移植對EAE大鼠脊髓有髓神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)及MBP表達(dá)的影響

張 萌1，2張海燕2姚宏波2王月靜2孫麗慧2▲

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的觀察少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs）移植對實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）大鼠脊髓有髓神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)的影響。方法選擇30只健康大鼠隨機分為正常組、模型對照組、治療組，每組10只。正常組正常飼養(yǎng)，模型對照組、治療組采用大鼠脊髓勻漿與完全弗氏佐劑混合做抗原單點皮下注射造模，造模后1周治療組由尾靜脈注入OPCs懸液，模型對照組注入同等劑量生理鹽水，連續(xù)測量大鼠體重的改變，將各組大鼠心臟灌注處死，取脊髓制成切片，用髓鞘堿性蛋白（MBP）免疫組化染色并觀察。結(jié)果造模后1周模型對照組與治療組大鼠體重均下降。移植后，治療組大鼠體重下降有所緩解；與正常組比較，模型對照組大鼠運動功能評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，治療組運動評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，治療組MBP免疫組化陽性的髓鞘數(shù)量增多。結(jié)論OPCs移植可促進(jìn)脫髓鞘模型大鼠運動功能和脊髓髓鞘的修復(fù)。

多發(fā)性硬化；少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；細(xì)胞移植；實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種獲得性免疫介導(dǎo)的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病［1］，臨床上常表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損而致畸致殘，給患者的生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重的影響，加重了社會和家庭經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［2］。此疾病的主要病理變化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的脫失和軸索的潰變，并且脫失的髓鞘很難自行修復(fù)，隨著病程的發(fā)展，髓鞘的脫失愈加嚴(yán)重［3］。目前臨床上常用免疫抑制劑、激素等藥物進(jìn)行治療［4］，但藥物治療在疾病進(jìn)展期會影響自身適應(yīng)性炎癥因子，使其修復(fù)固有免疫系統(tǒng)的作用降低，因此治療效果欠佳［5］。根據(jù)MS的病理表現(xiàn)及病因，考慮輸入外源性細(xì)胞進(jìn)行髓鞘的修復(fù)［6］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞是構(gòu)成髓鞘的主要細(xì)胞，其自身不能修復(fù)。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）可定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞［7］，并具有較好的定向遷移能力和增殖能力［8］。在髓鞘損傷時，OPCs可對受損的髓鞘起到修復(fù)的作用，從而改善運動功能［9］。由于實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）模型的病程發(fā)展及組織病理學(xué)改變與MS極為相似［10］，因此本研究建立EAE大鼠模型并進(jìn)行OPCs移植，觀察其中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓神經(jīng)纖維形態(tài)及髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）免疫組化情況，為研究MS公認(rèn)的動物模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康成年雄性SD大鼠30只。隨機分為正常組、模型對照組、治療組，每組10只。正常組為健康大鼠，正常飼養(yǎng)；模型對照組為EAE模型大鼠，造模后1周向側(cè)腦室注射生理鹽水；治療組為造模后1周通過尾靜脈移植少突膠質(zhì)細(xì)胞懸液的大鼠。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

倒置相差顯微鏡（Olympus）；OPCs（上海細(xì)胞庫）；完全弗氏佐劑（Sigma）；百日咳菌素（Calbiochem）；多聚甲醛（天津福晨化學(xué)試劑廠）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（Gibco）；兔抗鼠MBP多克隆抗體（Sigma）；辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（Sigma）；DAB試劑盒（博士德生物工程公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模正常大鼠戊巴比妥鈉麻醉，心臟灌注冰生理鹽水至右心房流出液體清亮。取出大鼠脊髓，去除脊膜和血管，稱重，加等量的完全弗氏佐劑，用注射器反復(fù)抽打至形成油包水狀乳化物，模型對照組和治療組大鼠采用大鼠脊髓勻槳與完全弗氏佐劑混合做抗原單點皮下注射，劑量為0.5 ml/只。免疫后每日稱重并觀察大鼠運動情況［11］。

1.3.2 細(xì)胞移植造模后10 d，消化DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)且90％細(xì)胞貼壁的OPCs，并將其置于無菌離心管內(nèi)，離心機離心5 min，轉(zhuǎn)速為1000 r/min，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×105/μl，取治療組大鼠，向尾靜脈內(nèi)注射2×106OPCs懸液（約13.33 μl），模型對照組給予同劑量生理鹽水，移植后每日稱重觀察［12］。

1.3.3 MBP免疫組化在OPCs移植治療術(shù)后4周，將3組大鼠用過量麻醉劑麻醉并固定于手術(shù)臺上，先用生理鹽水再用4％多聚甲醛溶液快速灌注，取下脊柱剝離脊髓，將大鼠的脊髓節(jié)段放置于4％多聚甲醛溶液內(nèi)固定，常規(guī)石蠟包埋，切片機切片并貼于防脫片上，二甲苯及梯度乙醇脫蠟，常規(guī)免疫組化法染色，脫水透明封片［13］。

1.4 指標(biāo)評價

①記錄3組大鼠不同時期體重變化。②運用BBB評分法進(jìn)行運動功能評分，0分：無可見后肢運動，21分：持續(xù)性掌面移動，持續(xù)性協(xié)調(diào)步態(tài)，足趾持續(xù)抓地，活動過程中主動爪位置始終與身體平行，軀干持續(xù)穩(wěn)定，尾巴持續(xù)翹起，可視為正常健康大鼠［14］。③觀察各組大鼠MBP免疫組化情況。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

正常組大鼠隨著時間的增加體重逐漸上升，模型對照組大鼠造模后出現(xiàn)體重下降或不增長，治療組大鼠造模后體重下降，細(xì)胞移植后出現(xiàn)短暫體重下降，后有所上升。

2.2 各組大鼠運動功能變化

正常組大鼠運動功能始終處于正常水平，模型對照組大鼠造模后出現(xiàn)運動功能下降，治療組大鼠造模后運動功能下降，但細(xì)胞移植后運動功能有所恢復(fù)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠運動功能評分結(jié)果（分，x±s）

2.3 各組大鼠MBP免疫組化情況

正常組大鼠脊髓有髓神經(jīng)纖維髓鞘完整。模型對照組大鼠脊髓有髓神經(jīng)纖維髓鞘脫失，周圍可見軸索明顯腫脹，MBP陽性的髓鞘數(shù)量較少。與模型對照組比較，治療組髓鞘缺失有所減輕，脊髓和軸索腫脹情況緩解，MBP陽性的髓鞘數(shù)量增多。見圖1。

圖1 各組大鼠髓鞘和軸索MBP免疫組化光鏡圖（縱切面，×100）A.正常組；B.模型對照組；C.治療組

3 討論

MS是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的自身免疫性疾病，通過對MS患者病理改變的研究發(fā)現(xiàn)，病變主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病灶主要分布在腦和脊髓的白質(zhì)中。病變初期髓鞘會發(fā)生腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂［15］，隨著病程發(fā)展，病變逐漸加重，且不能自行恢復(fù)［16］，常常會導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列下肢運動功能障礙的癥狀［17］。MBP主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，在脫髓鞘疾病中可用作反映髓鞘脫失情況的特異性指標(biāo)［18］。本研究將OPCs移植到EAE大鼠中來觀察其對缺失髓鞘的修復(fù)情況，通過對各組大鼠體重、運動功能評分及MBP免疫組化結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠脊髓髓鞘染成棕黃色，顏色較深，縱切面上髓鞘大小均一，排列整齊，MBP陽性髓鞘數(shù)量較多。模型對照組大鼠脊髓髓鞘染色較淺，MBP陽性髓鞘數(shù)量較少，提示髓鞘結(jié)構(gòu)被破壞。與模型對照組比較，治療組髓鞘顏色有所加深，髓鞘結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，MBP陽性髓鞘數(shù)量增多，脫髓鞘情況有所緩解。正常組與模型對照組比較，差異顯著，提示造模效果較好。模型對照組與治療組比較，差異顯著，提示治療效果較好。由此可見，OPCs對EAE大鼠有髓神經(jīng)纖維髓鞘的修復(fù)及MBP的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用。

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Influence of oligodendrocyte precursor cells transplantation to the structure of myelinated nerve fibers in spinal cord and the expression of MBP

ZHANG Meng1，2ZHANG Hai-yan2YAO Hong-bo2WANG Yue-jing2SUN Li-hui2▲
1.Human Anatomy，Histology and Embryology Teaching and Research Section，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang Province，Harbin150040，China；2.Histology and Embryology Teaching and Research Section，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To observe the influence of oligodendrocyte precursor cells transplantation to motor function and myelinated nerve fiber morphology of experimental allergic encephalomyelitis rats.Methods 30 healthy rats were randomly divided into normal group，model control group，treatment group.Normal group was given normal breeding，spinal cord homogenate and complete Freund′s adjuvant were mixed and injected into rats in the model control group and treatment group.About 1 week later，the treatment group rats were given intravenous injection of oligodendrocyte precursor cells，model control group was injected equal dose of normal saline，the change of weight in rats were measured continuously.Rats in each group were killed by cardiac perfusion，spinal cord was made into slices，MBP immunohistochemical staining was given and observed.Results Compared with the normal group，the weight of model control group decreased after one week for making model.After transplantation，compared with the model control group，the weight of treatment group increased.Compared with the normal group，clinical score of model control group decreased，the difference had statistically significance（P＜0.05）.Comparing with the control group，clinical score of treatment group increased，the difference had statistically significance（P＜0.05）.Comparing with the control group，the number of myelin which was positive in MBP immunohistochemistry test in model control group increased.Conclusion The oligodendrocyte precursor cells transplantation has certain effect on repairing the motor function and myelin sheath of the myelinated nerve fibers in spinal cord.

Multiple sclerosis；Oligodendrocyte precursor cells；Cellular transplantation；Experimental allergic encephalomyelitis

R651.21

A

1674-4721（2015）05（b）-0004-03

2015-03-01本文編輯：衛(wèi)軻）

黑龍江省齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計劃項目（SF-08001）

張萌（1983-），女，黑龍江齊齊哈爾人，2012級在讀碩士研究生，講師，主要研究脫髓鞘疾病的治療

▲通訊作者