程 偉，湯 斌，李 松

重組畢赤酵母產(chǎn)匍枝根霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

程 偉，湯 斌?，李 松

（安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖 241000）

將來(lái)源于匍枝根霉的endoglucanaseⅡ（egⅡ）在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，對(duì)構(gòu)建完成的重組畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵，制備目標(biāo)酶蛋白.發(fā)酵液經(jīng)Ni柱分離純化，得到分子量大小約為38 kDa，比酶活為37.8 IU/mg的蛋白.酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酶最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)p H為4.8；Mn2+、Zn2+、Fe2+對(duì)egⅡ的酶活力有一定的激活作用，Cu2+對(duì)egⅡ酶活有抑制作用，Mg2+、Co2+、Na+和K+等離子對(duì)該酶的催化活力沒(méi)有明顯影響；該酶以CMC-Na為底物時(shí)其反應(yīng)米氏常數(shù)為2.04 mg/ml.

匍枝根霉，內(nèi)切葡聚糖酶，分離純化，酶學(xué)性質(zhì)

作為地球上最豐富的可再生資源，纖維素一直沒(méi)有被有效、合理地利用［1］，其根本原因是當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的纖維素酶普遍具有生產(chǎn)成本高、酶組分結(jié)構(gòu)不合理及催化效率低等特點(diǎn).目前普遍認(rèn)為，降解纖維素時(shí)至少需要3種功能不同且又互補(bǔ)的纖維素酶，包括內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanases，EG）、外切葡聚糖酶（exoglucanases，CBH）及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases，BG）之間的協(xié)同作用［2-3］才能達(dá)到最佳的催化效果.其中eg在纖維素酶催化水解的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)隨機(jī)水解纖維素內(nèi)部的β-1-4糖苷鍵來(lái)達(dá)到快速水解纖維素鏈的目的［4-5］，被廣泛應(yīng)用于紡織、印刷、造紙等領(lǐng)域［6-7］.近年來(lái)，如何提高eg的活力及實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)［8-11］.同時(shí)，篩選新的纖維素酶產(chǎn)生菌株并開發(fā)新型纖維素酶編碼基因亦成為纖維素酶研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題.

實(shí)驗(yàn)室在前期工作中從黃山腐木內(nèi)篩選的匍枝根霉可分泌多種纖維素酶，目前已發(fā)現(xiàn)該菌株至少含有2種CBHs、3種BGs以及7種以上EGs編碼基因.生物信息學(xué)分析表明，該菌株EGs的分子量主要集中在30～40 k Da范圍內(nèi)，這給單一eg蛋白組分的分離純化及功能研究帶來(lái)了極大的困難.因此，研究采用巴斯德畢赤酵母GS115做為表達(dá)宿主，以期建立關(guān)于纖維素的重組酵母高密度發(fā)酵制備方法和分離純化方法，為匍枝根霉纖維素酶基因的異源高效表達(dá)、酶蛋白的快速分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其他新型纖維素酶的相關(guān)研究提供參考.

1　材料與方法

1.1菌株

攜帶目的基因egⅡ表達(dá)原件的巴斯德畢赤酵母GS115重組菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏.

重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵及10 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵培養(yǎng)基分別參照Pichia pastoris expression kit（Invitrogen）和Pichia pastoris Fermentation Process Guidelines（Invitrogen）進(jìn)行.

1.3方法

（1）種子培養(yǎng).將MD平板上生長(zhǎng)的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，在30℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)約18～24 h，使菌體密度OD 600值達(dá)到2～6.

（2）10 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng).將種子液按10%接種量接種至含有7 L發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，用氨水調(diào)節(jié)p H值至5.0，轉(zhuǎn)速設(shè)定為600 r/min并通過(guò)串級(jí)轉(zhuǎn)速控制溶氧不低于20%，培養(yǎng)溫度控制在30℃.當(dāng)發(fā)酵至18～24 h階段，在初始培養(yǎng)基中的甘油被耗盡，溶氧上升至100%時(shí)立即進(jìn)入甘油分批補(bǔ)料階段.當(dāng)菌體濕重達(dá)到220 g/L左右時(shí)開始進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，期間不斷調(diào)整甲醇流速以控制溶氧在20%以上.適時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)，當(dāng)酶活力不再增長(zhǎng)時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束.

（3）重組蛋白的制備.發(fā)酵結(jié)束后取上清，緩慢加入固體硫酸銨至終飽和度為75%，過(guò)夜鹽析后于4℃、10 000 r/min離心10 min，取沉淀并用適量緩沖液A（20 m M Tris-HCl+0.5 M NaCl+20 m M C3H4N2，p H 7.0）溶解后在相同緩沖液中透析24 h，透析結(jié)束后使用0.45μm膜微濾并保存?zhèn)溆?利用?KTA prime plus純化系統(tǒng)將樣品吸附在鎳柱上并平衡，用緩沖液B（20 m M Tris-HCl+0.5 M NaCl+ 200～500 m M C3H4N2，p H 7.0）進(jìn)行線性洗脫，使用Hi Trap Desalting柱脫鹽后上樣于經(jīng)過(guò)緩沖液C（20 m M Tris-HCl，p H 7.0）平衡的Hi Trap DEAE FF親和柱，然后用緩沖液D（20 m M Tris-HCl+0～0.5 M NaCl，p H 7.0）進(jìn)行梯度洗脫.收集的酶蛋白通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白純度.

（4）酶學(xué)性質(zhì)研究.①溫度對(duì)酶活力及其穩(wěn)定性能的影響.p H 4.8條件下，分別在不同溫度（25～70℃）下測(cè)定酶活力，以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以此確定酶的最適反應(yīng)溫度；分別將稀釋的酶液在50℃、60℃、70℃下保溫0～100 min，以未經(jīng)熱處理的酶液測(cè)得的活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，研究酶的熱穩(wěn)定性.

②p H對(duì)酶活力及其穩(wěn)定性能的影響.在55℃下，分別在p H 3.0～8.0下測(cè)定酶活力，以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，以此確定酶的最適反應(yīng)p H；將酶液分別放在p H 2～9下保溫一段時(shí)間后測(cè)定相對(duì)酶活力，以此來(lái)研究酶的p H穩(wěn)定性.

③金屬離子對(duì)酶的影響.在標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系中加入不同質(zhì)量濃度的金屬離子，至終濃度分別為1 m M和5 m M.以不加任何金屬離子作為對(duì)照，測(cè)得的酶活力為100%來(lái)計(jì)算相對(duì)酶活力，以此來(lái)研究金屬離子對(duì)酶活力的影響.

這張截圖傳得到處都是，火得不行。按說(shuō)這家長(zhǎng)語(yǔ)氣還算客氣，可網(wǎng)友們還是將她和“嚴(yán)夫人”相提并論?！皣?yán)夫人”是四川廣安市原市委副書記嚴(yán)春風(fēng)的前妻。今年4月，因?yàn)橛變簣@老師責(zé)罰她女兒，“嚴(yán)夫人”在微信群里威脅老師，口氣霸道，后來(lái)甚至聲稱老師因此被辭退。一時(shí)間，“你對(duì)嚴(yán)書記的女兒說(shuō)這話是什么意思”成了熱門“金句”。

④米氏常數(shù)Km的測(cè)定.分別使用不同質(zhì)量濃度（2～10 mg/m L）的CMC-Na作為底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法測(cè)得酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km.

（5）內(nèi)切葡聚糖酶酶活測(cè)定.還原糖的測(cè)定采用DNS方法［12］進(jìn)行.酶活力定義：在酶的最適催化條件下，每分鐘水解CMC-Na生成1μmol的葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（IU）.

2　結(jié)果與分析

2.1重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

畢赤酵母上罐發(fā)酵一般分為兩個(gè)階段，即菌體生長(zhǎng)階段及外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段.當(dāng)菌體濕重達(dá)到220 g/L，利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，如圖1所示.由圖1可知，誘導(dǎo)108 h后，酶活達(dá)到15.89 IU/ml.

2.2重組蛋白的制備

由于目的基因的C末端含有6-His標(biāo)簽，其表達(dá)的蛋白可以和金屬Ni發(fā)生特異性結(jié)合，采用?KTA prime plus上的鎳柱純化系統(tǒng)純化目的蛋白，純化部分步驟中egⅡ酶活得率如表1所示.

發(fā)酵罐水平表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析如圖2所示.由圖2可知，egⅡ蛋白經(jīng)Ni柱純化后在SDSPAGE中表現(xiàn)出單一條帶，分子量約為38 k Da，其比酶活約為37.8 IU/mg.

表1　重組匍枝根霉內(nèi)切葡聚糖酶的純化

2.3重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）溫度對(duì)酶活力及穩(wěn)定性能的影響.溫度對(duì)酶活力的影響如圖3a所示.由圖3a可知，在不同溫度下測(cè)定egⅡ的相對(duì)酶活力，最適作用溫度為55℃，且在45～60℃之間，egⅡ均表現(xiàn)出較高的酶活性.egⅡ在50℃下相對(duì)較穩(wěn)定，保溫100 min后殘余酶活約為90%，溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響如圖3b所示.由圖3b可知，當(dāng)在70℃下保溫100 min后殘余酶活約為18%.來(lái)源于枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶在70℃保溫30 min后殘余酶活約為40%［10］；來(lái)源于米曲霉的內(nèi)切葡聚糖酶在70℃保溫30 min后殘余酶活約為8%［13］；與之相比，本實(shí)驗(yàn)分離出的egⅡ耐熱范圍較廣.

（2）p H對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響.p H對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響如圖4所示.由圖4可知，egⅡ的最適作用p H為4.8，當(dāng)p H小于4.4或高于5.8時(shí)，其催化活力急劇下降（見(jiàn)圖4a）；將egⅡ分別在不同p H下保溫一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)該酶在p H 4.5～6.5間較為穩(wěn)定，在低于p H 4.5或高于p H 6.5條件下穩(wěn)定性價(jià)差（見(jiàn)圖4b）.與管明斌［14］等報(bào)道的來(lái)源于毛霉中內(nèi)切葡聚糖酶的p H穩(wěn)定性范圍相差不大.

（3）金屬離子對(duì)酶活的影響.在反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的金屬離子，保溫一段時(shí)間后測(cè)定其對(duì)酶活力的影響，如表2所示.由表2可知，Mn2+、Zn2+、Fe2+對(duì)egⅡ的酶活力有一定的激活作用，高濃度的Cu2+對(duì)egⅡ酶活有明顯的抑制作用，而其他一些離子如Mg2+、Co2+、Na+和K+等對(duì)該酶的催化活力沒(méi)有明顯影響.

表2　金屬離子對(duì)酶活的影響

（4）米氏常數(shù)的測(cè)定.測(cè)定不同濃度的CMC-Na做為底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，如圖5所示.經(jīng)計(jì)算得到egⅡ的Km值為2.04 mg/m L.同樣以CMC-Na為底物，陶毅明［15］等對(duì)來(lái)源于灰綠曲霉的eg研究表明，其Km為5.0 mg/m L；朱年青［16］等對(duì)里氏木霉中的纖維素酶分離純化，得到egⅠ、egⅡ的Km值分別為2.20 mg/m L、3.38 mg/m L.Km值可近似的反應(yīng)酶與底物的親和力大小，Km越小表明親和力越大.與之相比，本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的egⅡ?qū)Φ孜锏挠H和力較高.

3　結(jié)論

纖維素酶廣泛存在于自然界中多種微生物體中，利用基因工程手段克隆纖維素酶基因從而構(gòu)建高效表達(dá)工程菌可有效提高纖維素酶的表達(dá)量［17］.目前，真菌纖維素酶的研究主要集中在木霉屬及曲霉屬微生物，以瑞氏木霉、黑曲霉等菌株報(bào)道較多，且該類纖維素酶基因及其編碼產(chǎn)物的性質(zhì)功能研究相對(duì)較為透徹，而對(duì)根霉屬微生物之中纖維素酶基因及其編碼產(chǎn)物的研究相對(duì)較少.從研究纖維素酶基因的多樣性和開發(fā)具有新型催化特性纖維素酶的角度出發(fā)，本實(shí)驗(yàn)室首次成功地從匍枝根霉中克隆出多個(gè)eg基因并進(jìn)行了初步分析.

以egⅡ?yàn)檠芯磕繕?biāo)，以重組畢赤酵母為出發(fā)菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了egⅡ基因的異源過(guò)量表達(dá)、純化和性質(zhì)研究.研究結(jié)果表明，通過(guò)10 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵108 h后，內(nèi)切葡聚糖酶活達(dá)到15.89 IU/m L，比搖瓶發(fā)酵表達(dá)量提高了近10倍.酶學(xué)性質(zhì)研究表明，egⅡ的最適反應(yīng)溫度為55℃，在70℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性；該酶最適反應(yīng)p H為4.8，在p H 4.5～6.5間較為穩(wěn)定；金屬離子中，Mn2+、Zn2+、Fe2+對(duì)egⅡ的酶活力有一定促進(jìn)作用，Cu2+對(duì)egⅡ酶活有不同程度的抑制作用，而其他一些離子如Mg2+、Co2+、Na+、K+幾乎對(duì)酶的活性沒(méi)有影響；反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax分別為2.04 mg/m L、2.17μmol/min.

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Separation purification and enzymatic properties of endoglucanaseⅡin pichia pastoris from rhizopus stolonifer

CHENG Wei，TANG Bin?，LI Song
（Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

The endoglucanaseⅡ（egⅡ）of Rhizopus stolonifer has been expressed in Pichia pastoris.The high-level expression of recombinant endoglucanaseⅡwas achieved through high-density fermentation of recombinant Pichia pastoris.Ni column was used to purify the expressed product，the specific activitiy of purified egⅡhas been determined，and its molecular mass was 38 k Da.The results of enzyme characterization showed that the purified egⅡhas a optimum catalytic activity at 55℃and p H 5.0.The catalytic activity of egⅡcould be enhanced by metal ion Mn2+，Zn2+and Fe2+，but strongly inhibited by Cu2+at a high concentration（5 m M），while it has no effects by Mg2+，Co2+，Na+and K+.The determined Kmvalue of egⅡwas 2.04 mg/ml by using sodium carboxymethyl cellulose（CMC-Na）as the substrate.

rhizopus stolonifer；endoglucanase；separation and purification；enzyme characterization

Q93

A

1672-2477（2015）02-0001-05

2015-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270135）

程 偉（1989-），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生.

湯 斌（1954-），男，安徽桐城人，教授，碩導(dǎo).