王華林 朱作言 孫永華

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

生長激素(Growth hormone, GH)是一種由191個氨基酸組成的肽類激素, 它由垂體前頁分泌, 是調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育的重要因子。朱作言等[1]將含有人生長激素基因的重組質(zhì)粒pMhGH注射到泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)的受精卵內(nèi), 由此發(fā)育的轉(zhuǎn)基因泥鰍顯示出快速生長效應(yīng)。外源生長激素基因在魚類中的這種促生長效應(yīng)在鯉(Cyprinus carpio)和鯽(Carassius auratus)中也得到了驗證[2]。生長激素的這一效應(yīng)由細胞膜上的生長激素受體(Growth hormone receptor, GHR)介導(dǎo), GH在與GHR結(jié)合后導(dǎo)致該受體二聚化, 活化后的GHR會激活詹納斯激酶 2 (Janus kinase 2, JAK2), 使GHR上的酪氨酸(Tyr)位點被磷酸化,該磷酸化位點與被GHR募集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Signal transducer andactivators of transcription, STAT)結(jié)合, STAT分子繼而被JAK2磷酸化并形成二聚體, 活化后的STAT進入到細胞核并激活其下游的c-fos和igf1等靶基因的表達[3,4]。

細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻抑物(Suppressors of cytokine signaling, SOCS), 特別是SOCS2在生長激素信號通路的調(diào)控中具有重要作用。socs2敲除的小鼠比野生型個體長得更快, 其體重增大, 體長增加至野生型的 1.5倍[5,6],呈現(xiàn)出與轉(zhuǎn)生長激素基因小鼠[7]類似的快速生長效應(yīng)。目前, 國內(nèi)外的研究主要探討了socs2與GH信號通路的相互作用和其對小鼠生長的調(diào)控作用, 而它對魚類生長發(fā)育的調(diào)控及其生化機理尚不清楚。本研究以斑馬魚為模型, 利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)敲除了socs2基因, 以探索socs2對魚類GH信號通路的調(diào)控作用。

TALEN技術(shù)是近年發(fā)展起來的一類新型的人工核酸內(nèi)切酶, 它由TALE (Transcription activator-like effector)靶點識別序列和FokⅠ核酸內(nèi)切酶兩個結(jié)構(gòu)域組成, 前者能識別并結(jié)合靶點 DNA序列, 然后由后者將靶點 DNA序列切開, 實現(xiàn)對基因組序列的定點突變。該技術(shù)對基因組 DNA的編輯效率高, 脫靶率較低, 目前已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究[8]。由于FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域通常以二聚體的形式起作用, 所以TALEN靶點也需要成對選擇。本研究利用TALEN技術(shù)研制了socs2缺陷型斑馬魚突變體, 發(fā)現(xiàn)其胚胎早期的生長速率顯著快于對照組野生型斑馬魚, 研究結(jié)果將為魚類分子設(shè)計育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用AB品系斑馬魚由國家斑馬魚資源中心提供。TALE單體質(zhì)粒系列, pCS2-PEAS和pCS2-PERR載體由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授提供。

1.2 TALEN靶點設(shè)計及表達載體構(gòu)建

TALEN靶點的選擇與確認 為盡可能完全地破壞socs2的結(jié)構(gòu)與功能, 靶點選擇在socs2 CDS的5￠端, 靶點選擇遵循的原則參見沈延等[9]提供的方法。為方便后續(xù)篩選過程中用酶切的方法來檢測突變體, 選擇了左右識別位點中間含有單一的 TaqⅠ酶切位點的的靶點, 靶點位置及序列見圖 1。在 Ensembl網(wǎng)站上分別用單側(cè)靶點序列進行BLAST比對[10], 確認該序列在斑馬魚基因組中是單一位點。

圖1 斑馬魚socs2的TALEN靶點示意圖Fig. 1 Structure and sequence of socs2 and the TALEN target site

靶點序列及酶切效率確認 取實驗用 AB品系斑馬魚20枚, 用Genomic DNA Kit(TIANGEN) 提取基因組DNA, PCR擴增靶點及附近序列。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3min; 95℃變性30s, 51.5℃退火30s, 72℃延伸45s,擴增 35個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系: 10íTaq Buffer 5 μL,MgCl22.5 mmol/L, dNTP Mix0.8 mmol/L, 引物TALEN2-F和 TALEN2-R 各 0.4 μmol/L, 基因組 DNA 0.15 μg, Taq DNA聚合酶(Fermentas)1 U, 加ddH2O至50 μL。用PCR Cleanup試劑盒(AXYGEN)回收擴增產(chǎn)物, 取一部分產(chǎn)物用TaqⅠ酶切。另取一部分回收的擴增產(chǎn)物測序確認靶點序列及其中間的的TaqⅠ識別序列中無SNP及其他變異。

構(gòu)建 TALEN表達載體 根據(jù)選擇的靶點序列,首先以TALE單體質(zhì)粒系列為基礎(chǔ), 采用“單元組裝法”通過酶切連接把單體質(zhì)粒串聯(lián)起來, 分別構(gòu)建成識別左右靶點的TALE重復(fù)序列并測序鑒定。將組裝好的TALE重復(fù)序列酶切后連接到含有 FokⅠ編碼序列的載體pCS2-PEAS和pCS2-PERR上, 用引物GFor與+63dnPCR鑒定TALE片段(左)連入方向, 用引物CFor與+63dnPCR鑒定TALE片段(右)連入方向, 挑選連入方向正確的單克隆測序鑒定, 構(gòu)建成TALEN終載體pCS2-TALEN。具體構(gòu)建步驟與方法參見沈延等[9]提供的方法。

1.3 TALEN活性檢測與斑馬魚突變體篩選

TALEN mRNA體外轉(zhuǎn)錄及其顯微注射 通過NotⅠ酶切線性化 pCS2-TALEN載體對, 線性化完全后用mMessagemMachine?SP6試劑盒(Ambion)體外轉(zhuǎn)錄得到左、右兩側(cè)半位點的一對TALEN mRNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCR Cleanup試劑盒(AXYGEN)回收, 溶于DEPC H2O中。用分光光度計測定 mRNA濃度, 將左、右兩側(cè)半位點的一對TALEN mRNA混和, 加入DEPC H2O和1/10體積的酚紅, 配制成 200 ng/μL 的 TALEN mRNA。將配制好的TALEN mRNA顯微注射到單細胞期斑馬魚受精卵中(注射量: 50—150 pg/半位點), 得到 F0胚胎。同時留一些未注射的同批胚胎作為對照。

TALEN體內(nèi)活性檢測 受精后 2天(2 dpf, day post-fertilization), 取注射的胚胎 20個, 同批的對照組也取20個胚胎, 分別提取基因組DNA, PCR擴增靶點周圍的序列(用“1.2”中鑒定過的引物)。擴增產(chǎn)物用 PCR Cleanup試劑盒(AXYGEN)回收后用 TaqⅠ酶切, 酶切完全后用瓊脂糖凝膠電泳檢測。如果有未切開的PCR條帶且對照組胚胎的 PCR 產(chǎn)物能夠全部被切開, 說明靶點DNA序列可能發(fā)生突變; 將未切開的條帶用Gel Extraction Kit (Fermentas)切膠回收, 連入 T載體 pMD18-T(TAKARA), 測序鑒定靶點的突變情況。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used for all the experiments

斑馬魚 TALEN突變體篩選 將檢測到突變的 F0胚胎飼養(yǎng)至性成熟, 與野生型(WT)成魚測交, 取所產(chǎn) F1胚胎20個提取基因組DNA, PCR擴增靶點周圍的序列并用TaqⅠ酶切鑒定。選取 F1胚胎發(fā)生突變的F0魚測交, 大量飼養(yǎng)F1至性成熟。取F1成魚剪尾鰭提取基因組 DNA,逐條進行基因型分析(依次通過PCR、酶切、測序檢測靶位點序列)。篩選到基因型完全一致的雌雄成對的F1雜合子突變體, 通過自交獲得含有1/4純合子突變體的F2胚胎,飼養(yǎng)至性成熟并進行基因型分析(圖2)。

1.4 斑馬魚胚胎生長速率測定與統(tǒng)計分析

將篩選得到的socs2缺失的斑馬魚純合子分別與同批的純合子和野生型雜交, 得到socs2缺失的純合子胚胎和雜合子胚胎。再將同批的野生型成魚自交, 得到野生型胚胎。這3組胚胎分別用胰蛋白酶脫膜, 各取31枚胚胎飼養(yǎng)至同樣大小的培養(yǎng)皿中, 置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取24、48、72和96hpf的胚胎用Tricaine麻醉, 然后拍照并用 SPOT5.0軟件測量體長, 記錄體長數(shù)據(jù)并分析三組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計學(xué)差異。

1.5 GH信號通路活性分析

取 2dpf的socs2敲除的純合子、雜合子和野生型胚胎各50枚, 用Trizol (Invitrogen)提取總RNA, 用分光光度計測定濃度并電泳檢測RNA質(zhì)量。用DNaseⅠ(Promega)處理以去除其中可能含有的 DNA, 用 RevertAidTMcDNA synthesis Kit (Fermentas)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA[11]。所得cDNA用ddH2O稀釋5倍后作為模板, real-time PCR分析GH信號通路下游靶基因c-fos(基因ID: 190339985)和igf1(基因ID: 90017461)的表達變化[12]。Real-time PCR體系:2×SYBR Green supermix(BioRad) 10 μL, 上下游引物各0.2 μmo/L, cDNA 模板 150 ng, 加 ddH2O 補至 20 μL。每一個樣品平行做 3個重復(fù), 每個基因的表達量以 β-actin為參照用 2–??Ct法[13]分析和處理實驗數(shù)據(jù)。

圖2 socs2缺失的斑馬魚純合子突變體篩選流程Fig. 2 Crossing schemes to breed socs2–/– homozygous mutant zebrafish

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚socs2缺陷型突變體的獲得

注射了socs2 TALEN mRNA的胚胎, 其socs2基因經(jīng)測序鑒定檢測到了1—11個堿基不等的缺失突變, 也有堿基缺失后插入了1—8個堿基不等的插入突變(圖3)。除去3堿基缺失、6堿基缺失和9堿基缺失外, 其余均為有效突變。F1代成魚中篩到了13個堿基(CACGGAAAGCATC)缺失的雜合子突變體雄魚和雌魚, 自交后得到 F2代, F2代成魚逐尾進行基因型分析得到了13個堿基(CACGGAA AGCATC)缺失的純合子突變體, 自交得到 F3代胚胎, 基因型鑒定證明其全部為socs2(-13)純合子突變體(圖4A)。在該突變體中堿基缺失造成移碼突變, 導(dǎo)致翻譯提前終止。突變的SOCS2蛋白只保留了野生型SOCS2氮末端的8個氨基酸, 又因移碼產(chǎn)生了23個新的氨基酸(RMKGDR NPKPKSPTPSRVALPLP), 缺乏 SOCS2行使其生物學(xué)功能所需的Src同源結(jié)構(gòu)域(Src-homology 2, SH2)和SOCS盒(SOCS box)結(jié)構(gòu)域(圖 4B)。

2.2 socs2敲除對斑馬魚胚胎生長速率的影響

斑馬魚 socs2(-13)突變體胚胎在 1dpf和 2dpf的體長均大于同批的野生型。1dpf的體長: 雜合子突變體>純合子突變體>野生型, 雜合子突變體體長比野生型增加了3.5%, 在統(tǒng)計學(xué)上存在極顯著的差異(P<0.005)。2dpf的體長: 雜合子突變體>純合子突變體>野生型, 雜合子突變體體長比野生型增加了 3.1%, 純合子突變體體長比野生型增加了 2.2%, 兩組數(shù)據(jù)與野生型對比都有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。當胚胎發(fā)育至3dpf和4dpf, 雜合子突變體的這一生長優(yōu)勢逐漸減弱, 3種基因型胚胎的體長數(shù)據(jù)無顯著性差異(圖5)。

2.3 socs2敲除對GH信號通路活性的影響

由于2dpf的socs2(-13)突變體胚胎的體長顯著大于同時期的野生型胚胎, 我們采用實時熒光定量 PCR分析了這一時期的突變體和野生型中 GH信號通路下游靶基因c-fos和igf1的表達量(圖 6)。結(jié)果顯示c-fos的表達量在socs2(-13)雜合子胚胎中上調(diào)了 1.4倍, 在 socs2(-13)純合子胚胎中上調(diào)了 2.6倍。igf1的表達量在 socs2(-13)純合子胚胎中上調(diào)了3.9倍。

3 討論

圖3 F0代斑馬魚胚胎中socs2 TALEN位點突變檢測結(jié)果Fig. 3 Sequences of socs2 mutations induced by TALEN in founder zebrafish embryos

圖4 F3代純合子胚胎中socs2突變檢測結(jié)果Fig. 4 Sequences of socs2 mutations in homozygous embryos

圖5 野生型、socs2 (-13)雜合子和socs2(-13)純合子的體長Fig. 5 Body length in the wildtype (WT), socs2+/–, socs2–/–groups

本研究表明 socs2的缺失可輕微地促進斑馬魚胚胎的生長, 而這種促生長效應(yīng)并不是在胚胎發(fā)育過程中一直持續(xù)下去, 其在1dpf和2dpf有顯著的促生長效應(yīng), 但是對3dpf和4dpf的胚胎并沒有顯著的促生長效應(yīng)。這可能是因為機體對socs2的缺失造成的影響做出應(yīng)答后迅速上調(diào)了其他GH信號通路抑制因子的表達, 使得機體生長速度趨于正常生理水平。蛋白酪氨酸磷酸酶(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase,SHP)可能是這一過程中被上調(diào)的重要因子, 其被證明能抑制生長激素所介導(dǎo)的JAK2/STAT信號傳導(dǎo)途徑[14]。SHP能與 GHR的 Tyr595結(jié)合, 這一相互作用被證明與GH信號通路的下調(diào)有關(guān), 把這一位點的 Tyr突變?yōu)镻he后, GH信號通路活性被上調(diào)[15]。后來的研究發(fā)現(xiàn)SOCS2也能與GHR的Tyr595結(jié)合[16], 這說明該位點同時也是SOCS2在GH信號通路中行使其負反饋抑制功能的作用位點, SHP可能會競爭性抑制SOCS2與Tyr595的結(jié)合。在本研究中3dpf和4dpf時突變體胚胎的體長與野生型逐漸趨于同一水平, 可能就是因為 SOCS2與GHR上磷酸化位點的親和力降低間接誘導(dǎo)和增強了SHP與GHR上Tyr595位點的結(jié)合。

本研究還發(fā)現(xiàn)在 1dpf和 2dpf時, 生長最快的不是socs2(-13)的純合子胚胎, 反而是雜合子突變體的體長與野生型胚胎的差異更為顯著。這說明并不是 socs2的表達水平越低, 斑馬魚的生長就越快, socs2對GH信號通路的調(diào)控可能是一個雙向作用的過程。Adams等就發(fā)現(xiàn)在CHO細胞系中高表達socs2反而會增強GH信號通路的活性[17]。進一步的研究也證實了socs2對GH信號通路的調(diào)控是雙向的, 當逐漸增加 socs2的表達量時,其對293T細胞中GH信號通路的抑制效應(yīng)逐漸減弱, 反而逐漸增強信號通路下游與STAT5結(jié)合的啟動子活性[18]。轉(zhuǎn)入外源socs2的轉(zhuǎn)基因小鼠其生長速率也并沒有降低,反而從3周開始顯著大于同齡的野生型小鼠[16]。這些報道與我們的結(jié)果是一致的, 進一步說明 socs2在體內(nèi)的抑制生長或是促生長效應(yīng)可能是雙向的, 而這種雙向作用可能與SHP等其他GH信號通路抑制因子的競爭性作用是相關(guān)的。

本研究證明 socs2(-13)的雜合子和純合子突變體中GH信號通路下游的靶基因 c-fos的表達量顯著高于野生型, 另一個靶基因igf1在純合子突變體中也顯著增加。這說明socs2的缺失減弱了其對GH信號通路的抑制, 導(dǎo)致GH信號通路活性的上調(diào)。但是c-fos和igf1的表達量不是在體長最長的雜合子突變體中最高, 而是在體長介于中間的純合子突變體中最高。我們推測這可能是雜合子突變體中表達的部分SOCS2對STAT5的磷酸化起到了一定的抑制作用, SOCS2的這種抑制作用在體外實驗中有過詳細的驗證[19]。純合子突變體中STAT5的磷酸化則不會受到 SOCS2的抑制, 同時整個 GH信號通路也不被SOCS2抑制, 所以下游靶基因在純合子突變體中的表達量上調(diào)得更為顯著。

圖6 socs2突變體胚胎中c-fos和igf1 mRNA的表達Fig. 6 Expression levels of the c-fos and igf1 genes in zebrafish embryos

總之, 本研究證明socs2的缺失會對斑馬魚胚胎發(fā)育早期的生長速率產(chǎn)生影響, 這種效應(yīng)與缺失突變體中GH信號通路活性的上調(diào)有關(guān)。針對突變體中 STAT5磷酸化水平和GH表達量的進一步研究將有助于深入理解socs2在斑馬魚體內(nèi)調(diào)控GH信號通路的機理。