范 維，張咚咚，張 彧，姜鐵民，陳歷俊，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京市乳品工程技術(shù)研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

馬克斯克魯維酵母對(duì)發(fā)酵乳中糖代謝的影響

范 維1，2，張咚咚2，張 彧1，姜鐵民2，陳歷俊1，2，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京市乳品工程技術(shù)研究中心，北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

采用高效液相色譜等方法，對(duì)乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵和向其中添加馬克斯克魯維酵母這兩種發(fā)酵乳中乳糖代謝主要產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活力的變化情況進(jìn)行對(duì)比分析，以確定添加酵母菌對(duì)乳糖無氧代謝產(chǎn)生乳酸途徑的影響。結(jié)果表明：添加酵母菌后乳糖降解速率明顯加快（P＜0.05），貯藏期間馬克斯克魯維酵母可以對(duì)積累的半乳糖進(jìn)行利用；發(fā)酵過程中，由于酵母菌的添加使β-半乳糖苷酶及乳酸脫氫酶活力有顯著提高（P＜0.05），糖酵解途徑關(guān)鍵限速酶--己糖激酶和丙酮酸激酶活力增加（P＜0.05）；含有酵母菌的發(fā)酵乳pH值下降（滴定酸度上升）較乳酸菌單菌發(fā)酵快（P＜0.05），這與添加酵母菌后發(fā)酵乳中乳酸含量顯著增加（P＜0.05）有關(guān)；丙酮酸含量變化不顯著（P＞0.05）。該研究揭示了馬克斯克魯維酵母的添加對(duì)乳糖酵解具有一定促進(jìn)作用。

乳糖代謝；馬克斯克魯維酵母；發(fā)酵乳；酶活力；代謝產(chǎn)物

一直以來，國內(nèi)的乳制品主要以乳酸菌（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）發(fā)酵為主，關(guān)于酵母菌在乳制品中應(yīng)用的研究很有限，尤其是酵母菌作為一種益生菌發(fā)酵劑［1］方面的研究還不夠深入。但東歐、非州、亞洲等很多傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品（如開菲爾乳、非洲自然發(fā)酵乳、馬奶酒等）中，酵母和乳酸菌起著同樣重要的作用［2］。馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）作為一種廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的酵母，不僅可以發(fā)酵乳糖［3］，更能對(duì)半乳糖進(jìn)行利用［4］，它的介入使得混合菌形成了一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，賦予了產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味及營養(yǎng)特性［5-6］。乳糖作為乳粉中唯一的碳源，在微生物發(fā)酵過程中起到至關(guān)重要的作用，故本實(shí)驗(yàn)從糖代謝角度出發(fā)，通過研究添加馬克斯克魯維酵母后乳糖分解代謝過程中主要代謝產(chǎn)物（乳糖、葡萄糖、半乳糖、丙酮酸、乳酸）含量變化以及代謝關(guān)鍵酶（β-半乳糖苷酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、乳糖脫氫酶）活力的變化情況，來反映馬克斯克魯維酵母和乳酸菌混菌發(fā)酵的具體過程，以期為新型乳制品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

保加利亞乳桿菌菌粉（Lactobacillus bulgaricus，簡稱LB）、嗜熱鏈球菌菌粉（Streptococcus thermophilus，簡稱ST）YOMIX-611 丹尼斯克公司；馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus） 北京三元食品股份有限公司實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2試劑

全脂乳粉 新西蘭西部乳粉廠；乳糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、鄰硝基苯酚（o-nitrophenol，ONP）、鄰硝基苯β-D-半乳糖吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）、丙酮酸鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國Sigma公司；乳酸、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉?。ㄖ袊┰噭┕荆籄G501-X8（D）混合床樹脂美國Bio-Rad公司；溶菌酶（2 000 U/mg）、己糖激酶（hexokinase，HK）試劑盒、丙酮酸激酶（pyruvate，PK）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

XT-120A型分析天平 瑞士普利賽斯公司；Sigma 3K-15型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；LC-10Avp型高效液相色譜 日本島津公司；Milli-Q Advantage A10型超純水儀 美國Millipore公司；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲器 昆山市超聲儀器有限公司；PB-10型標(biāo)準(zhǔn)型電化學(xué)pH計(jì) 德國賽多利斯集團(tuán)；Cintra20型雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 澳大利亞GBC公司；Polystat K6-1型循環(huán)式精密恒溫水浴鍋 德國Huber公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集

準(zhǔn)備兩份12 g/100 mL的全脂乳培養(yǎng)基，分別命名A、B。A培養(yǎng)基中按106CFU/mL接菌量接種活化好的乳酸菌（LB與ST活菌數(shù)比1∶1），按乳酸菌與酵母菌活菌數(shù)為30∶1的比例接種馬克斯克魯維酵母；B培養(yǎng)基按以上接種量只接入LB和ST。將接種好的兩份培養(yǎng)基于35 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，分別于發(fā)酵3、4、4.5、5、5.5、6 h取一次樣，6 h時(shí)約為凝乳終點(diǎn)。后將兩份培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至4 ℃條件下進(jìn)行貯藏，分別于第1、3、5、7、10、14、21天進(jìn)行取樣。

將馬克斯克魯維酵母按上述接種比例單獨(dú)接入12 g/100 mL全脂乳培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別于6、24 h和48 h進(jìn)行取樣，測(cè)定其β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力。

1.3.2pH值及總酸度的測(cè)定

pH值采用PB-10型酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

總酸度測(cè)定：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》［7］，用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行電位滴定法測(cè)定總酸度值。

1.3.3糖類代謝產(chǎn)物測(cè)定

1.3.3.1高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）條件

色譜柱：Aminex HPX-87C分離柱（300 mm× 7.8 mm，9 μm）；保護(hù)柱：Aminex hydrogen-form（30 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：超純水；流速：0.3 mL/min；柱溫：75 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制5 組混標(biāo)溶液，使乳糖質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL；葡萄糖質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL；半乳糖質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。配好后進(jìn)行色譜測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，mg/mL）繪制工作曲線，獲得回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。

表1　HPLC法檢測(cè)發(fā)酵乳中各種糖的回歸方程和相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Regression equations， correlation coefficients and limits of detection for lactose， glucose and galactose

1.3.3.3樣品前處理［8-9］

準(zhǔn)確稱取3.000 g樣品，加入15 g雙蒸水溶解。加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL。充分混勻，超聲20 min。在4 ℃條件下，10 000 r/min離心10 min。收集的上清液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為6～7，并定容到25 mL。取出5 mL上清液，加入0.25 g的AG501-XB（D）樹脂，振蕩1 h。再用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾。

1.3.4關(guān)鍵酶活力測(cè)定

1.3.4.1酶液提取

采用溶菌酶破壁法，參照Greenberg等［10］的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取3.000 g樣品于50 mL離心管中，向其中加入1 g/100 mL的EDTA 100 μL，于4 ℃條件下，11 000 r/min離心10 min，保留沉淀；將沉淀用pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液洗2 次，離心棄上清后將沉淀懸浮于10 mL磷酸鉀緩沖溶液中；向溶液中加入0.2 g/100 mL的溶菌酶2 mL，于37 ℃水浴1 h后加入4 mol/L NaCl溶液2 mL，充分混勻后得到粗酶液。

1.3.4.2β-半乳糖苷酶活力測(cè)定

參照郭清泉等［11］的方法，以O(shè)NPG為酶的底物，生成黃色產(chǎn)物ONP，通過比色法測(cè)定β-半乳糖苷酶活力。以吸光度（420 nm）作為縱坐標(biāo)，ONP質(zhì)量濃度作為橫坐繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程Y=0.006 5X－0.019，相關(guān)系數(shù)為0.997 9。一個(gè)酶活力單位（U）定義為在37 ℃條件下，每分鐘釋放1 μmol ONP所需的酶量［10］。

1.3.4.3乳酸脫氫酶活力測(cè)定

參考李琦等［12］的方法略作改動(dòng)。將混合反應(yīng)液即0.03 mol/L丙酮酸鈉0.1 mL、0.006 mol/L NADH 0.1 mL、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）2.7 mL在25 ℃條件下預(yù)熱5 min，于340 nm波長處測(cè)定初始吸光度，加入0.1 mL酶液啟動(dòng)反應(yīng)，立即計(jì)時(shí)，每間隔1 min測(cè)定一次吸光度，連續(xù)測(cè)定5 min。根據(jù)每分鐘吸光度降低值（ΔA340nm）可以計(jì)算出酶活力?？瞻讟訛? mL磷酸鉀緩沖溶液。一個(gè)酶活力單位（U）定義為在25 ℃條件下，每分鐘氧化1 μmol NADH所需酶量［13］。酶活力按下式計(jì)算。

式中：V總為反應(yīng)體系總體積/mL；V樣為樣品體積/mL。

1.3.4.4糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑限速酶活力測(cè)定

己糖激酶和丙酮酸激酶活力測(cè)定方法遵照試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取平均值。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5丙酮酸含量的測(cè)定

1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用2，4-二硝基苯肼比色法［14］對(duì)發(fā)酵乳中丙酮酸含量進(jìn)行測(cè)定。以吸光度（520 nm）為縱坐標(biāo)，丙酮酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程Y=0.022 3X－0.032 3，相關(guān)系數(shù)為0.998 6。

1.3.5.2樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品3.000 g，加入10 g/100 mL三氯乙酸2 mL，超聲15 min，10 000 r/min離心10 min，獲得上清液定容到10 mL，從中取出1 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法操作，記錄吸光度，測(cè)定3 次取平均值，計(jì)算丙酮酸含量。1.3.6 乳酸含量的測(cè)定

1.3.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法［15］對(duì)發(fā)酵乳中乳酸含量進(jìn)行測(cè)定。以吸光度（565 nm）作為縱坐標(biāo)，乳酸質(zhì)量濃度（μg/mL）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為Y=0.011 5X+0.118 3，相關(guān)系數(shù)為0.998 3。

1.3.6.2樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品1.000 g，用15 mL雙蒸水進(jìn)行稀釋，再加入10 g/100 mL三氯乙酸2 mL，超聲15 min后10 000 r/min離心10 min，獲得上清液定容到100 mL，從中取出1 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法操作，記錄吸光度，測(cè)定3 次取平均值，計(jì)算乳酸含量。

1.4數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1pH值及總酸度測(cè)定結(jié)果

按規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，分別測(cè)定添加酵母菌和不添加酵母菌兩種發(fā)酵乳的pH值和總酸度隨時(shí)間的變化。結(jié)果如圖1所示，兩種發(fā)酵乳pH值均呈下降趨勢(shì)，而滴定酸度呈上升趨勢(shì)，這符合發(fā)酵乳應(yīng)有的特性。從圖中還能看出，含有酵母菌的發(fā)酵乳酸度較高（P＜0.05），存在兩種可能的原因，其一是酵母菌促進(jìn)乳酸菌生長，加速了乳酸菌產(chǎn)酸［6］，其二是酵母菌本身發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)CO2所致。

圖1　不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵乳中酸度及pH值變化Fig.1 Changes in acidity and pH in fermented milk at different fermentation times

2.2糖類代謝產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）糖類的HPLLCC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed sugar standards （a） and sugars in fermented milk （b）

按1.3.3節(jié)方法對(duì)糖類代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品HPLC圖見圖2。由圖2a可知，乳糖、葡萄糖、半乳糖的出峰時(shí)間分別為17.528、20.636、23.008 min。由圖2b可以看出樣品分離效果較好。

2.2.1發(fā)酵期間各糖含量變化

圖3　發(fā)酵期間乳糖（A）和半乳糖（B）含量變化Fig.3 Changes in lactose （A） and galactose （B） contents during fermentation

按樣品前處理方法對(duì)各采樣點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行處理，通過HPLC法對(duì)樣品中乳糖、葡萄糖、半乳糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。如圖3A所示，接種后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長乳糖含量呈不斷下降趨勢(shì)（P＜0.05），含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳糖從42.081 mg/mL下降到28.549 mg/mL，下降了32.4%，而乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵乳糖下降25.8%，說明含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳糖代謝速率明顯快于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵（P＜0.05），這是由于酵母菌自身可以利用乳糖所致［16］。

由圖3B可知，半乳糖含量在發(fā)酵期間呈不斷上升趨勢(shì)（P＜0.05）。單獨(dú)乳酸菌發(fā)酵不會(huì)對(duì)半乳糖進(jìn)行利用，因?yàn)樵谌樗峋w內(nèi)半乳糖激酶含量極低，不足以使半乳糖通過Leloir途徑發(fā)生代謝，半乳糖最終在乳糖透膜酶的作用下排放到胞外［17］。而混菌發(fā)酵中，雖然馬克斯克魯維酵母可以利用半乳糖，但其含量并沒有減少，可能是由于葡萄糖的生成量足以滿足酵母菌的生長，半乳糖沒有被利用或半乳糖的合成代謝大于分解代謝，這與Gonzalez-Andrada等［17］的研究相似。

發(fā)酵過程中葡萄糖未被檢出是由于葡萄糖在乳糖代謝產(chǎn)生時(shí)通過EMP途徑瞬間轉(zhuǎn)化而不會(huì)排放到胞外，因此含量極低未達(dá)到HPLC檢出限，這與Samona等［18］的研究結(jié)果相似。

2.2.2貯藏期間各糖含量變化

對(duì)貯藏期間各糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示，貯藏過程中乳糖的含量隨貯藏天數(shù)的增加仍在減少（P＜0.05），但趨 勢(shì)逐漸變緩，21 d內(nèi)含有酵母菌和不含酵母菌的發(fā)酵乳中乳糖分別下降了36.8%和22.2%。如圖4B所示，兩種發(fā)酵乳中半乳糖含量變化趨勢(shì)有明顯不同，由于乳酸菌不能利用半乳糖，因此乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵乳中半乳糖含量在逐漸升高；而混菌發(fā)酵中半乳糖的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，這是由于貯藏期間，各微生物對(duì)乳糖的代謝逐漸減慢，導(dǎo)致生成的葡萄糖不足以維持酵母菌的生存，因此酵母菌開始對(duì)之前積累的半乳糖進(jìn)行利用。在貯藏過程中仍然未檢測(cè)出有葡萄糖的存在，Richmond等［19］研究表明發(fā)酵貯藏直到第50天才可檢測(cè)到葡萄糖且是痕量。

圖4　貯藏期間乳糖（A）和半乳糖（B）含量變化Fig.4 Changes in lactose （A） and galactose （B） contents during storage

2.3β-半乳糖苷酶活力測(cè)定結(jié)果

采用ONPG比色法測(cè)定乳糖酶活力。通過單獨(dú)測(cè)定馬克斯克魯維酵母發(fā)酵乳中酶活力可知：馬克斯克魯維酵母自身可以產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，隨培養(yǎng)時(shí)間從6 h延長至48 h，β-半乳糖苷酶活力從0.249 U/mL上升到0.543 U/mL，說明其可以自身利用乳糖，進(jìn)一步驗(yàn)證了2.2.1節(jié)中的結(jié)論。由圖5可知，兩種發(fā)酵乳中β-半乳糖苷酶活力隨發(fā)酵時(shí)間延長均呈上升趨勢(shì)，凝乳時(shí)兩種發(fā)酵乳中酶活力分別達(dá)到0.966 U/mL和1.677 U/mL，這是由于微生物不斷生長繁殖，活菌數(shù)的增多導(dǎo)致其產(chǎn)酶量的增加，而酵母菌參與的發(fā)酵乳從發(fā)酵4 h開始，其β-半乳糖苷酶酶活力高于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵（P＜0.05），分析可能原因有兩方面：一是酵母菌本身可以產(chǎn)生β-半乳糖苷酶；二是酵母菌促進(jìn)乳酸菌生長代謝產(chǎn)酶［6］。

圖5　不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵乳中β-半乳糖苷酶酶活力的變化Fig.5 Change in β-galactosidase activity in fermented milk at different fermentation times

2.4EMP途徑限速酶活力測(cè)定結(jié)果

2.4.1HK活力測(cè)定結(jié)果

HK在糖代謝途徑中，起著十分重要的作用，是糖代謝開始的啟動(dòng)因子，它催化葡萄糖磷酸化成為6-磷酸葡萄糖，它是整個(gè)糖代謝的限速酶，因此分析了酵母菌的加入對(duì)HK的影響，結(jié)果如圖6所示。隨發(fā)酵時(shí)間延長，兩種發(fā)酵乳中HK活力都隨之升高（P＜0.05），是微生物不斷生長產(chǎn)酶所致。當(dāng)發(fā)酵4 h后，含有酵母菌的發(fā)酵乳中HK活力顯著高于單獨(dú)乳酸菌發(fā)酵（P＜0.05），由于HK是EMP途徑限速酶，因此說明酵母菌的加入對(duì)糖酵解進(jìn)程有一定的促進(jìn)作用。

圖6　發(fā)酵期間己糖激酶活力變化Fig.6 Change in hexokinase activity in fermented milk at different fermentation times

2.4.2PK活力測(cè)定結(jié)果

PK是糖酵解途徑中第三個(gè)限速酶，它的作用是催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，同時(shí)生成一個(gè)ATP。PK活性的提高有利于糖酵解途徑的順利進(jìn)行。它在細(xì)胞內(nèi)含量的多少直接反映了細(xì)胞內(nèi)流經(jīng)糖酵解過程的通量的大小。因此分析酵母菌加入對(duì)PK活力的影響，結(jié)果如圖7所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，兩種發(fā)酵乳中PK活力大體呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵4.5 h后含有酵母菌的發(fā)酵乳中PK活力明顯高于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵（P＜0.05），說明酵母菌的加入對(duì)PK活性有一定促進(jìn)作用，也側(cè)面反映了馬克思克魯維酵母可以加快EMP進(jìn)程。

圖7　發(fā)酵期間丙酮酸激酶活力變化Fig.7 Change in pyruvate kinase activity in fermented milk at different fermentation times

2.5丙酮酸含量的變化

對(duì)丙酮酸含量變化進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比兩種發(fā)酵乳中丙酮酸含量，結(jié)果如圖8所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩種發(fā)酵乳中丙酮酸含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榘l(fā)酵前5.5 h丙酮酸的合成代謝大于其分解代謝，之后由于快接近發(fā)酵終點(diǎn)，較多的丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸，導(dǎo)致其含量降低。含有酵母菌的發(fā)酵乳其丙酮酸含量較高（P＞0.05），可能是由于含有酵母菌的發(fā)酵乳中PK活力較高或酵母菌自身可以通過EMP途徑產(chǎn)生丙酮酸，導(dǎo)致較多的丙酮酸生成。

圖8　發(fā)酵期間丙酮酸含量變化Fig.8 Change in pyruvic acid content during fermentation

2.6乳酸脫氫酶活力測(cè)定結(jié)果

乳酸脫氫酶可以在無氧條件下催化丙酮酸生成乳酸，因此研究酵母菌對(duì)乳酸脫氫酶活力的影響有助于進(jìn)一步分析其對(duì)乳酸生成的作用。結(jié)果如圖9所示，由于乳酸菌的不斷生長繁殖，導(dǎo)致兩種發(fā)酵乳中乳酸脫氫酶活力均隨發(fā)酵的進(jìn)行而增加（P＜0.05），凝乳時(shí)兩種發(fā)酵乳中乳酸脫氫酶活力分別達(dá)到1.031 U/mL和0.707 U/mL；含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳酸脫氫酶活力高于單獨(dú)乳酸菌發(fā)酵，從4.5 h后差異具有顯著性（P＜0.05），由于馬克斯克魯維酵母自身無法產(chǎn)生乳酸脫氫酶或酶的生成量沒有達(dá)到方法檢出限，因此產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能有兩點(diǎn)：一是酵母菌可以促進(jìn)乳酸菌生長，加速乳酸菌產(chǎn)酶；二是果糖-1，6-二磷酸為別構(gòu)激活劑，可大幅度提高乳酸脫氫酶活力，酵母菌的加入可以促進(jìn)EMP途徑的進(jìn)行，導(dǎo)致其中果糖-1，6-二磷酸產(chǎn)物的增多，進(jìn)而提高乳酸脫氫酶活力［20］。

圖9　發(fā)酵期間乳酸脫氫酶活力變化Fig.9 Change in lactate dehydrogenase activity in fermented milk at different fermentation times

2.7乳酸含量測(cè)定結(jié)果

乳酸作為乳糖發(fā)酵終產(chǎn)物不僅可以改善酸乳風(fēng)味，還決定了乳品保藏過程中后酸化的程度，對(duì)發(fā)酵乳中乳酸含量的測(cè)定可以有利的監(jiān)控乳品質(zhì)量，因此對(duì)樣品中乳酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖10所示，含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳酸含量從1.16 mg/mL上升到6.48 mg/mL，乳酸菌單菌發(fā)酵乳中乳酸則從1.17 mg/mL上升到5.76 mg/mL，兩種發(fā)酵乳中乳酸含量均隨發(fā)酵的進(jìn)行而增加；從發(fā)酵3 h開始，含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳酸含量顯著高于乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵（P＜0.05），這對(duì)之前兩組發(fā)酵乳pH值測(cè)定具有差異性進(jìn)行了說明，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：含有酵母菌的發(fā)酵乳中乳酸脫氫酶活力較高，導(dǎo)致產(chǎn)生了較多的乳酸。

圖10　發(fā)酵期間乳酸含量變化Fig.10 Change in lactate content during fermentation

3　結(jié) 論

發(fā)酵乳中的糖代謝主要是指微生物代謝乳糖生成乳酸的過程。在乳糖作為唯一碳源的12 g/100 mL全脂乳培養(yǎng)基中，乳糖首先被β-半乳糖苷酶分解為葡萄糖和半乳糖；葡萄糖直接進(jìn)入EMP途徑生成丙酮酸，EMP途徑的關(guān)鍵限速酶有己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激等；由于乳酸菌體內(nèi)沒有足夠的半乳糖激酶，使得半乳糖不能被利用，但馬克斯克魯維酵母可以彌補(bǔ)這一不足，將半乳糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以6-磷酸葡萄糖的形式進(jìn)入EMP途徑，生成丙酮酸；生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下最終生成乳酸，完成發(fā)酵。

本實(shí)驗(yàn)確定了馬克斯克魯維酵母加入后，整個(gè)微生物代謝糖過程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物及酶活力變化規(guī)律。1）糖類代謝產(chǎn)物變化規(guī)律：發(fā)酵期間，酵母菌的加入促進(jìn)乳糖的分解代謝（P＜0.05），由于葡萄糖進(jìn)入EMP途徑被快速轉(zhuǎn)化，因此未檢測(cè)出其含量，而兩種發(fā)酵乳中半乳糖均處于積累狀態(tài)。貯藏期間，兩種發(fā)酵乳中乳糖降解緩慢，生成的葡萄糖量不足以維持微生物生長，因此酵母菌開始利用積累的半乳糖。2）關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律：含有馬克斯克魯維酵母的發(fā)酵乳中β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸激酶活性均增強(qiáng)（P＜0.05），導(dǎo)致乳糖利用率增加，糖酵解進(jìn)程加快，發(fā)酵乳產(chǎn)酸較多。3）有機(jī)酸類代謝產(chǎn)物變化規(guī)律：馬克斯克魯維酵母的加入可使發(fā)酵乳中乳酸含量升高（P＜0.05），提前達(dá)到凝乳點(diǎn)，縮短工業(yè)生產(chǎn)時(shí)間。而丙酮酸含量的增加，說明馬克斯克魯維酵母增加糖耗量可能還有其他途徑。綜上所述，馬克斯克魯維酵母的加入對(duì)發(fā)酵乳中乳糖代謝起到促進(jìn)作用。對(duì)于酵母菌促進(jìn)糖代謝的機(jī)理還需要更深入的研究，隨著各種研究方法的相互借鑒和新的研究手段的出現(xiàn)，有望在不遠(yuǎn)的將來能更加明確酵母參與糖代謝的整個(gè)機(jī)理。

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Effect of Kluyveromyces marxianus on Lactose Metabolism in Traditional Fermented Milk

FAN Wei1，2， ZHANG Dongdong2， ZHANG Yu1， JIANG Tiemin2， CHEN Lijun1，2，*
（1. School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China；2. Beijing Dairy Engineering Technology Research Center， Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd.， Beijing 100076， China）

In order to ascertain the effect of co-fermentation with Kluyveromyces marxianus on the biosynthesis pathway of lactic acid by anaerobic metabolism of lactose， the contents of main lactose metabolites in fermented milks with lactic acid bacteria alone and in combination with Kluyveromyces marxianus were analyzed and compared by HPLC， accompanied by comparative measurement of related key enzymes activities. The results showed that lactose was degraded at a markedly accelerated rate during co-fermentation with Kluyveromyces marxianus and lactic acid bacteria （P ＜ 0.05）. Kluyveromyces marxianus could utilize the produced galactose during subsequent storage. Moreover， the presence of the yeast resulted in significantly enhanced activities of β-galactosidase， lactate dehydrogenase， pyruvate kinase and hexokinase during the fermentation process （P ＜ 0.05）. As a result， hexokinase and pyruvate kinase， the key rate-limiting enzymes in the Embden-Meyerhof-Parnas （EMP） pathway， were significantly activated （P ＜ 0.05）. pH declined faster （P ＜ 0.05） during co-fermentation with Kluyveromyces marxianus than fermentation with single starter culture， which was associated with significantly enhanced production of lactic acid （P ＜ 0.05）. However， no significant difference in pyruvic acid content was found between the two fermented milks （P ＞ 0.05）. This study reveals that Kluyveromyces marxianus plays an important role in promoting lactose glycolysis.

lactose metabolism； Kluyveromyces marxianus； fermented milk； enzymatic activity； metabolites

TS252.1

A

1002-6630（2015）15-0128-07

10.7506/spkx1002-6630-201515024

2014-09-24

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD18B04）；2012年度國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2012GA600001）

范維（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：fw837093515@163.com

陳歷?。?967—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槿槠芳庸?。E-mail：chlj@263.net