楊智峰　高玉娟　李敬梅

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

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植物藥甘草中晶纖維的顯微定量研究*

楊智峰高玉娟李敬梅△

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

目的：改進(jìn)植物藥甘草中晶纖維顯微定量的方法。方法：在已有顯微定量方法的基礎(chǔ)上，以混懸制樣代替“水飛”制樣，以血球計(jì)數(shù)板代替普通載玻片。利用線性分析方法確定取樣量，用正交實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)化制片用混懸液配比和定量需要觀察制片的數(shù)量，進(jìn)行混懸液穩(wěn)定性考察，確定實(shí)驗(yàn)用時(shí)。結(jié)果：樣品細(xì)度要求100目，樣品定量需制片10張；混懸劑：由60%稀甘油和水合氯醛試液組成，比例19∶1；神木產(chǎn)甘草顯微特征均數(shù)：1498±22個(gè)/mg。結(jié)論：引用血球計(jì)數(shù)板，提高顯微定量的易操作性和準(zhǔn)確性。

藥材顯微定量是利用藥材中某種顯微特征，通過(guò)顯微計(jì)數(shù)，進(jìn)行原藥材含量測(cè)定的方法，如：甘草中的晶纖維、紅花中花粉粒等。這方面的工作，苑冬梅、康廷國(guó)教授研究的較多，應(yīng)用于中成藥(全粉末或部分粉末制劑)組分定量、中藥炮制和調(diào)料質(zhì)量控制，用混懸劑以“水飛”方法制樣，利用傳統(tǒng)載玻片、蓋玻片、微量進(jìn)樣器、網(wǎng)格式測(cè)微尺和顯微鏡進(jìn)行，每個(gè)樣品制片5～10張,理論根據(jù)在于單位藥材樣品顯微特征個(gè)數(shù)是一常數(shù)[1-2]。其缺點(diǎn)在于：“水飛”方法制樣，誤差較大，顯微注樣器的孔徑能否滿足要求，定量溶液制片不易操作，全蓋玻片觀察計(jì)數(shù)困難很大、誤差不易控制，局部計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)體積難以確定，因此，該法需要完善。我們以甘草中晶纖維為對(duì)象，對(duì)以往顯微定量方法進(jìn)行了改進(jìn)。用混懸劑定量混懸的方法制樣，利用血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、定量滴管和顯微鏡進(jìn)行，理論根據(jù)同上，希望以此提高顯微定量法的精度，便于應(yīng)用。

1　儀器和試藥

BS210S分析天平，Olmypus雙目顯微鏡(日本)，LeicaMD750雙目顯微鏡(德國(guó))，烘箱，血球計(jì)數(shù)板。甘油(化學(xué)純)、水合氯醛(分析純)和蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1試驗(yàn)參數(shù)和計(jì)算樣品細(xì)度：由于血球計(jì)數(shù)板空間高度為0.1mm，即100μm，故樣品粉碎細(xì)度應(yīng)為100目。血球計(jì)數(shù)板樣品池充液量：經(jīng)測(cè)量和計(jì)算一個(gè)樣品池需混懸液約0.02mL。滴管液滴大小考察：取滴管，吸取1mL混懸液，10次，記錄1mL混懸液滴出液滴的數(shù)量，并記錄之，經(jīng)計(jì)算1滴約4.6×10-3mL，能滿足樣品池充液要求。樣品計(jì)數(shù)顯微特征的確定：計(jì)數(shù)顯微特征在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，形態(tài)上沒(méi)有變化，如：部分溶解，同時(shí)，要易于觀察。顯微特征常數(shù)的計(jì)算：由于血球計(jì)數(shù)板一個(gè)樣品池中大方格體積為0.4mm3，計(jì)數(shù)僅計(jì)大方格中顯微特征個(gè)數(shù)，若以n張片子中顯微特征個(gè)數(shù)(X)為基數(shù)，則10mL樣品液中顯微特征個(gè)數(shù)(Y)的計(jì)算公式：Y=1.25×104x/n。若10mL樣品混懸液中有藥材質(zhì)量(M)mg，則該藥材顯微特征常數(shù)(K)：K=Y/M(個(gè)/mg)。

2.2實(shí)驗(yàn)要求樣品粉碎:取樣品藥材，悶潤(rùn)，切片，65℃烘干，沖筒粉碎，不留殘?jiān)^(guò)100目篩，細(xì)粉備用。制樣:取樣品粉末適量(多在100mg以下)，加水合氯醛液適量，再加一定濃度的稀甘油適量，振搖混懸，定容于10mL容量瓶中，振搖混勻，備用。制片:用驗(yàn)證過(guò)的滴管(1mL溶液，滴20滴左右)，滴1滴，注入蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板樣品池中，兩個(gè)樣品池各1滴，注滿，1次做夠所需片數(shù)。顯微觀察:每個(gè)樣品制片，觀察、記錄每個(gè)樣品池大方格中顯微特征個(gè)數(shù)，20個(gè)數(shù)據(jù)，因每個(gè)計(jì)數(shù)板有兩個(gè)樣品池。要求2h內(nèi)完成，此由計(jì)數(shù)顯微特征在混懸液中的穩(wěn)定性決定。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1混懸液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取樣品適量(陜西神木甘草，批號(hào)：20120826，51.5mg)，加混懸液(由60%稀甘油和水合氯醛試液組成，比例19︰1)，定容于10mL容量瓶中，搖勻，每隔20min，制片1次，每次10張，比較前后計(jì)數(shù)情況(76250、76250、76250、76250、77500、7500)，變異系數(shù)：0.95%，確定溶液穩(wěn)定的時(shí)間為2h。

2.3.2線性范圍考察:取樣品(陜西神木甘草，批號(hào)：20120826，下同)42.3、51.9、60.9、71.9、82.6、91.1、102.6mg，用60%稀甘油和水合氯醛試液，定容于10mL容量中，配比19︰1，各樣品制片10張，記錄顯微特征個(gè)數(shù)，進(jìn)行單位質(zhì)量與顯微特征個(gè)數(shù)關(guān)系的回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)：r=0.9967，與相關(guān)系數(shù)臨界值相比，高度相關(guān)，回歸方程：Y=423.43X+1.22×105，線性范圍應(yīng)在40mg～100mg。

2.3.3制片影響因素的考察和結(jié)論：從預(yù)實(shí)驗(yàn)情況看，影響顯微特征計(jì)數(shù)的因素有稀甘油濃度、稀甘油與水合氯醛試液配比和觀察片子的數(shù)量。故進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，樣品細(xì)度100目，取樣量50mg～60mg，實(shí)驗(yàn)因素和水平安排見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和極差分析見(jiàn)表2。正交實(shí)驗(yàn)取樣量：1#，52.1mg；2#，50.3mg；3#，59.1mg；4#，54.8mg；5#，52.4mg；6#，52.4mg；7#，57.0mg；8#，54.9mg；9#，56.1mg。從方差分析情況可知：實(shí)驗(yàn)用甘油溶液濃度，對(duì)顯微特征常數(shù)確定影響非常顯著，觀察片數(shù)對(duì)其影響顯著，綜合極差和用時(shí)情況，最終確定顯微定量方法：取樣，稱量，用60%甘油溶液和水合氯醛試液(19∶1)混懸，用血球計(jì)數(shù)板制片10張；觀察，計(jì)算即可。

表1　　實(shí)驗(yàn)因素和水平安排

表2　　正交實(shí)驗(yàn)安排

2.3.4重復(fù)性考察：稱樣6份，每份約50mg，用60%甘油液和水合氯醛試液，19∶1混懸，定容于10mL容量瓶中，每份制片10張，記錄并計(jì)算顯微特征常數(shù),均數(shù)1490.5個(gè)/mg，RSD1.47%，重復(fù)性好。

2.3.5樣品顯微特征常數(shù)均數(shù)的確定和不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的比較:取神木產(chǎn)甘草、甘肅產(chǎn)甘草和隴西產(chǎn)甘草，約50mg，各5份，以確定方法制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄顯微特征個(gè)數(shù)，計(jì)算樣品顯微特征常數(shù)均數(shù)，分析不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，用SPSS17軟件進(jìn)行成對(duì)資料統(tǒng)計(jì)分析，神木樣與甘肅樣之間顯微特征均數(shù)有顯著性差異，置信系數(shù)為0.01；神木樣與隴西樣之間顯微特征的均數(shù)也有顯著差異，置信系數(shù)為0.01。

表3　不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果:血球計(jì)數(shù)板用于藥材顯微定量是可行的，具體方法：取過(guò)100目篩樣品適量，加入水合氯醛試液1份，然后加入60%甘油19份，混懸定容于10mL容量瓶中，用確定過(guò)液滴大小的滴管，吸取一滴，滴于已蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板上，充滿樣品池，制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄四個(gè)大方格內(nèi)的顯微特征個(gè)數(shù)，計(jì)算即可。從重復(fù)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)看：實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng)。血球計(jì)數(shù)板樣品池高度一定，樣品池計(jì)數(shù)面積一定，故可提高樣品的觀察精度。

3　討　論

實(shí)驗(yàn)用神木甘草，經(jīng)鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根，甘肅甘草和隴西甘草原植物來(lái)源不詳。不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)的均數(shù)差異，是由于植物種間差異引起，還是由于產(chǎn)地差異引起，沒(méi)有定論，可以肯定的是，神木甘草與甘肅或隴西甘草不同。實(shí)驗(yàn)中將甘草的“晶纖維”作為計(jì)數(shù)顯微特征，是因?yàn)榫Юw維不僅特征性強(qiáng)、有代表性、易于觀察，而且在混懸液中穩(wěn)定，如在不同處方中選山藥淀粉粒或針晶、茯苓中選用菌絲一樣[3-4]。從本研究看，顯微特征常數(shù)是一個(gè)區(qū)間，這個(gè)區(qū)間受物種、生長(zhǎng)年限和產(chǎn)地影響，但在一定范圍之內(nèi)，具體情況將在后續(xù)研究報(bào)道中給予詳述。本研究與以往研究不同的是，在顯微觀察時(shí)采用了血球計(jì)數(shù)板，制樣時(shí)直接混懸，提高了實(shí)驗(yàn)精度。該研究的意義在于可用于中藥制藥和食品調(diào)料的投料監(jiān)控，也可用于粉末藥材的純度(摻偽)檢測(cè)。

[1]陳聰慧，康廷國(guó).金銀花顯微特征常數(shù)與化學(xué)成分相關(guān)性研究[J].中藥材，2011,34(9)：1373-1376.

[2]劉歆韻，康廷國(guó).逍遙丸中白芍、茯苓的顯微定量研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.

[3]吳楠，康廷國(guó).杞菊地黃丸中菊花、八珍益母丸中益母草顯微定量研究[D].沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[4]楊靜，萬(wàn)峰峰，蔡慧俠,等.血復(fù)生膠囊質(zhì)量控制[J].陜西中醫(yī)，2013,34(2)：234-236.

(收稿2015-05-03；修回2015-06-01)

A study of micro-quantitative methods for crystal fiber in herbs from glycyrrhiza uralensis

Shaanxi Institution of Traditional Chinese Medicine(Xi’an 710077)

Yang ZhifengGao YujuanLi Jingmei

Objective:Improve the micro-quantitative methods for crystal fiber in herbs fromglycyrrhiza uralensis . Methods: Based on existing micro-quantitative methods, they replace “Shuifei” sample-making method (the process of which solid powder and liquid are grinded together in order to make suspension or remove contaminants) with Suspending sample-making method, and substitute blood-counting plates for common microscope slides. Besides，we determine sample quantity by linear analysis and optimize the proportion of suspension which is used for plates making as well as the number of sample plates for micro-quantity with orthogonal experiment method. Through inspecting the suspension stability，they could confirm the precise time period of the experiment. Results: The sample fineness should be 100 mesh. We need 10 slides to determine the sample quantity. Suspension: The mix of 60% glycerol and choral hydrate in the ratio of 19∶1. The average number of micro-characteristics of 1mg glycyrrhiza uralensis come from Shenmu is (1498±22)/mg. Conclusion: It is a practical way to use blood-counting plates to increase the ease of operation and accuracy of micro-quantitative method.

Glycyrrhiza uralensis@Crystalline fiber@ Quantitative

R286

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.09.079

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012K19-03-08)

△西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(西安 710077)

主題詞 甘草@晶纖維@定量