孟海濤,汪 鶴,查學強,潘利華,羅建平*
(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009)
霍山石斛不同提取物抗小鼠亞急性酒精性肝損傷活性的比較研究
孟海濤,汪鶴,查學強,潘利華,羅建平*
(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009)
目的:比較霍山石斛不同提取物抗小鼠亞急性酒精性肝損傷的活性。方法:制備霍山石斛冷凍干燥物、水提物、水提醇溶物、水提醇沉物、水提粗多糖5 種提取物;以連續(xù)灌胃30%乙醇的小鼠為亞急性酒精性肝損傷模型,以霍山石斛不同提取物連續(xù)灌胃30 d后,稱量小鼠體質量及肝質量,測定血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,以及總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量,同時測定肝臟中乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,并檢查肝組織損傷病理變化。結果:霍山石斛水提醇溶物抗亞急性酒精性肝損傷的活性最差,醇沉物、水提物、冷凍干燥物具有一定的肝損傷保護活性,水提粗多糖各個劑量組均可顯著改善肝臟組織損傷和脂肪變性(P<0.05),降低血清ALT、AST、ALP活性和LDL-C、TC、TG水平,提高血清HDL-C含量,增強肝組織ADH、ALDH、SOD、GSH-Px活性,減少肝組織GSH損耗并抑制肝組織MDA含量增加。結論:多糖是霍山石斛抗小鼠亞急性酒精性肝損傷的功能因子。
霍山石斛;提取物;亞急性酒精性肝損傷
隨著人們生活水平的提高,酒精消耗量逐年攀升,酒精性肝損傷已成為僅次于肝炎病毒導致肝損傷的第二大病因[1-2],對酒精性肝損傷的防治直接關系到人類和社會的健康安全[3]。霍山石斛(Dendrobium huoshanense)作為一種可食用的滋補植物[4],近年來已被證明具有抗CCl4致小鼠肝損傷以及亞硒酸鈉致大鼠肝損傷的作用[5-6],但霍山石斛對酒精性肝損傷是否也具有保護作用還沒有報道。本實驗依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《對化學性肝損傷有輔助保護功能評價方法(修訂稿)》[7],以亞急性酒精性肝損傷小鼠為實驗動物模型,對霍山石斛不同提取物抗亞急性酒精性肝損傷的作用進行對比研究,以期明確霍山石斛干預酒精性肝損傷的功能因子,為以霍山石斛為原料開發(fā)抗酒精性肝損傷的功能食品提供理論基礎。
1.1動物、材料與試劑
SPF級昆明種小鼠,體質量(20±2) g,購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。
霍山石斛鮮品由本實驗室提供。
谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒 南京建成生物工程研究所;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、二乙氨基乙基纖維素(diethylaminoethyl cellulose,DEAE) 美國Sigma公司;水飛薊素膠囊 德國馬博士公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+) 合肥Bios harp公司;魚藤酮 北京Solarbio公司;其他試劑均為分析純。
1.2儀器與設備
Hei-VAP Advantage旋轉蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司;7072自動生化分析儀 日本日立高新技術公司;CT15RT高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司;LBJ-18S原位真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;XSZ-3G普通光學顯微鏡 重慶廣電儀器有限公司;Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo Fisher公司。
1.3方法
1.3.1霍山石斛不同提取物制備
取新鮮霍山石斛真空冷凍干燥48 h得干燥物(樣品A)。取樣品A干粉按1∶60(m/V)料液比加入蒸餾水,75 ℃攪拌浸提4 h,8 000 r/min離心10 min,得到上清液和沉淀,將上清液減壓濃縮、真空冷凍干燥得水提物(樣品B)。取樣品B用蒸餾水溶解,經終體積分數(shù)80%乙醇沉淀24 h,8 000 r/min離心10 min,得上清液和沉淀,上清液減壓濃縮、真空冷凍干燥得到水提醇溶物(樣品C),沉淀經真空冷凍干燥得水提醇沉物(樣品D)。取樣品D用蒸餾水溶解,經Sevag法[8]脫蛋白、截留分子質量為3 500 D透析袋透析48 h、真空冷凍干燥得水提粗多糖(樣品E)。各個組分的得率以占霍山石斛干質量的百分比表示,各個組分的多糖含量用苯酚-硫酸法[9]測得,以多糖總量占各組分干質量的百分比表示(表1)。
1.3.2動物分組及給藥
將實驗小鼠隨機分為18 組,每組10 只。18 組分別為(酒精性肝損傷)模型對照組,正常對照組,陽性對照組(水飛薊素20 mg/kg),以及各提取物樣品A、B、C、D、E的高、中、低劑量組。高、中、低劑量組的確定以《中華人民共和國藥典(一部)》[10]中石斛干品的人體(60 kg)推薦攝入量(6~12 g/d)的中間量10 g/d的5、10、30 倍為依據(jù),結合各種提取物得率,計算出每組的給藥劑量,見表1。不同提取物樣品和陽性對照物水飛薊素均用0.1% DMSO溶液溶解,按10 mL/(kg·d)劑量(以體質量計,下同)灌胃小鼠,正常對照組和酒精性肝損傷模型組灌胃給予相應體積的0.1% DMSO溶液,連續(xù)灌胃30 d。從第16天后,除正常對照組外,其他各組每天給藥結束后4 h灌胃給予30%乙醇(10 mL/kg)[7]。第30天灌胃結束后,禁食12 h,采用戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)麻醉后,腹主動脈取血,并解剖取出肝臟,記錄質量后用液氮速凍,存于-80 ℃冰箱。
表1 霍山石斛不同提取物的給藥劑量Table1 Administration dosages of different extraction fractions from Dendrobium huoshanense
1.3.3小鼠體質量和肝臟指數(shù)的測定
按照式(1)、(2)分別計算小鼠體質量增量和肝臟指數(shù)。
1.3.4小鼠肝組織病理學檢查
取小鼠肝臟左葉處小塊組織,10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色,制成切片后普通光學顯微鏡觀察肝細胞變性程度、壞死及炎癥改變等。
1.3.5血清生化指標測定
腹主動脈取血,血液靜置過夜后,4 000 r/min離心20 min,分離得到血清,采用全自動生化分析儀測定血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活力以及甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量。
1.3.6肝組織生化指標測定
1.3.6.1抗氧化應激指標測定
取出超低溫凍存的肝臟,組織研磨后,加入0.9%生理鹽水稀釋成質量分數(shù)為10%的組織勻漿液,4 ℃、10 000 r/min離心15 min,分離上清液,按照試劑盒說明書方法檢測GSH-Px、SOD活力以及MDA、GSH含量。
1.3.6.2乙醇代謝酶活性測定
乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)活性根據(jù)Koivisto等[11]的方法測定。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析
圖1 霍山石斛不同提取物對小鼠體質量增量(a)及肝臟指數(shù)(b)的影響Fig.1 Effects of different extract fractions on weight gain (a) and liver index (b) of mice
2.1霍山石斛不同提取物對小鼠體質量增量及肝臟指數(shù)的影響如圖1a所示,與正常對照組比較,模型對照組的小鼠體質量增量明顯減少;與模型對照組相比,霍山石斛的冷凍干燥物及高劑量水提物、高劑量水提醇沉物和高、中劑量水提粗多糖均能不同程度地恢復酒精所抑制的小鼠體質量增量,而水提醇溶物對小鼠的體質量增量無顯著性效果。其中,霍山石斛冷凍干燥物各劑量組均能顯著增加小鼠體質量的現(xiàn)象可能與其能調節(jié)小鼠的飲食口味,促進攝食有關。進一步的小鼠肝質量與體質量變化分析表明,小鼠因酒精而升高的肝臟指數(shù)可被霍山石斛的高劑量冷凍干燥物及中、高劑量水提物、水提醇沉物和水提粗多糖抑制(圖1b)。以上結果提示,在霍山石斛不同提取物中,多糖在緩解酒精性肝損傷小鼠的體質量降低和肝臟指數(shù)增加中發(fā)揮作用。
2.2霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織形態(tài)的影響
圖2 霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織形態(tài)的影響(HE,20×)Fig.2 Effects of different extract fractions on hepatic tissue morphology of mice (HE staining, 20 ×)
由圖2可知,酒精可致小鼠肝細胞腫脹,部分肝細胞核固縮、溶解,肝細胞索排列混亂,肝小葉界限模糊,而霍山石斛的冷凍干燥物及水提物、水提粗多糖、水提醇沉物能不同程度地改善酒精引起的小鼠肝組織病理損傷,其中水提粗多糖(圖2h)和水提醇沉物(圖2g)的效果明顯,但水提醇溶物組(圖2f)小鼠肝損傷程度嚴重,接近模型對照組。
2.3霍山石斛不同提取物對小鼠肝功能的影響
長期或過量飲酒會造成肝細胞膜發(fā)生損傷[12],通透性增加,導致ALT、AST、ALP等酶類物質釋放進入血液,因此,檢測血清中ALT、AST、ALP的活性能準確反映早期酒精性肝損傷的程度[13-14]。如圖3所示,與正常對照組相比,模型對照組小鼠血清ALT、AST、ALP活性均極顯著升高(P<0.01),霍山石斛不同提取物對酒精致肝損傷小鼠血清中ALT、AST、ALP活性表現(xiàn)出不同的影響,霍山石斛的高劑量水提物以及低、中、高劑量水提醇沉物和水提粗多糖均能明顯抑制血清ALT、AST、ALP活性的升高,且以水提粗多糖的效果最好,而水提醇溶物與模型對照組相比無顯著性差異。以上結果表明,多糖在抑制酒精性肝損傷,降低酒精致血清ALT、AST、ALP活性升高中發(fā)揮重要作用。
圖3 霍山石斛不同提取物對小鼠血清ALT、AST及ALP活性的影響Fig.3 Effects of different extract fractions on the activities of serum ALT, AST and ALP in mice
2.4霍山石斛不同提取物對小鼠血清中脂質代謝水平的調節(jié)
酒精性肝損傷的另一個并發(fā)癥狀是脂質代謝異常,酒精代謝過程中代謝產物會導致甘油三酯合成量增加,脂蛋白的合成和分泌受阻,脂肪運出功能下降,致使血液中TC、TG和LDL-C含量增加,HDL-C含量降低,進而出現(xiàn)高脂血癥和脂肪肝[15],因此,TC、TG、LDL-C、 HDL-C的水平可以反映脂質代謝情況。同正常對照組相比,模型對照組小鼠血清中HDL-C含量明顯降低,LDL-C、TC、TG水平極顯著升高(P<0.01),表明長期酒精攝入引起小鼠脂質代謝出現(xiàn)紊亂[16]。同模型對照組相比,高劑量水提醇沉物、水提粗多糖可顯著恢復酒精引起的HDL-C水平降低,且水提粗多糖效果優(yōu)于陽性對照組,接近于正常對照組水平(圖4a)。進一步對LDL-C、TC、TG水平進行測定發(fā)現(xiàn),除水提醇溶物外,中、高劑量冷凍干燥物、水提物以及不同劑量水提醇沉物和水提粗多糖均能不同程度抑制酒精致小鼠血清中LDL-C、TC、TG水平的升高(圖4b~4d),以上結果說明多糖是霍山石斛中調節(jié)TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,恢復脂質代謝異常的重要組分。
圖4 霍山石斛不同提取物對小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC、TTGG水平的影響Fig.4 Effects of different extract fractions on the levels of serum TC,TG, HDL-C and LDL-C in mice
2.5霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織抗氧化能力的影響
圖5 霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織抗氧化系統(tǒng)中GSH-Px、SSOODD活力及GSH、MDA含量的影響Fig.5 Effects of different extract fractions on antioxidant parameters such as GSH-Px, SOD, GSH and MDA in mice liver
肝組織中GSH-Px、SOD活力以及GSH、MDA水平的高低反映了肝組織抗氧化能力的強弱[17],長期攝入酒精會在肝臟內產生大量自由基[18-19],導致肝組織SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低,GSH等非酶類抗氧化物質被大量消耗,膜脂質過氧化產物MDA含量增加,造成肝組織的氧化應激損傷[20-21]。如圖5所示,高劑量冷凍干燥物以及中、高劑量的水提物、水提醇沉物、水提粗多糖均可明顯恢復小鼠肝組織GSH-Px和SOD活性,并且高劑量水提醇沉物和水提粗多糖可明顯提高肝組織GSH水平,高劑量冷凍干燥物和水提物以及中、高劑量水提醇沉物和水提粗多糖可明顯抑制肝組織MDA的產生。以上結果與水提醇溶物缺乏改善作用相比,說明霍山石斛中主要是多糖組分參與了酒精致小鼠肝組織抗氧化損傷的修復。
2.6霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織乙醇代謝酶活性的影響
圖6 霍山石斛不同提取物對小鼠肝組織中ADH、ALDH酶活性的影響Fig.6 Effects of different extract fractions on the levels of ADH and ALDH in mice liver
肝臟ADH、ALDH是機體分解乙醇、減輕乙醇損傷肝臟的重要代謝酶,它們活性的提高可減輕酒精對肝組織的損傷作用[22-23]。如圖6所示,由于代謝的需要,酒精可刺激小鼠肝組織ADH、ALDH活性升高,而高劑量水提醇沉物和不同劑量水提粗多糖能進一步提高ADH活性(圖6a),且高劑量冷凍干燥物和水提物,中、高劑量水提醇沉物以及不同劑量水提粗多糖能進一步提升ALDH活性(圖6b)。結果表明,霍山石斛多糖可以大幅度升高ADH和ALDH活性以適應肝組織快速代謝酒精、減輕酒精毒性的需求。
酒精性肝損傷的發(fā)生與酒精在肝臟中產生的代謝毒性物質、氧化應激、脂質代謝紊亂等多種因素有關,血清轉氨酶、脂質代謝水平和肝組織抗氧化指標可以反映酒精肝損傷程度[24]。本實驗在進行病理學分析的同時,從對血清中AST、ALT、ALP 3 種轉氨酶水平和TC、TG、HDL-C、LDL-C含量,肝組織中GSH-Px、SOD活性及GSH、MDA水平以及ADH、ALDH兩種酒精代謝酶活性的比較研究中發(fā)現(xiàn),霍山石斛及其不同提取物在抗亞急性酒精性肝損傷活性方面存在較大差異,其中水提粗多糖活性最好、水提醇沉物次之,水提物以及冷凍干燥物一般,而水提醇溶物無顯著保護作用。由于從水提物依次純化得到水提醇沉物和水提粗多糖,不同提取物中多糖含量呈梯度增加,表明霍山石斛及其不同提取物中發(fā)揮抗酒精性肝損傷作用的功能因子是多糖組分,其發(fā)揮作用的機制與抗氧化損傷和脂質代謝調節(jié)有關。進一步的研究需要從霍山石斛中分離出活性均一的多糖,并闡明其抗酒精性肝損傷的精細結構基礎和分子作用機理。
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Comparison of Hepatoprotective Effects of Different Extracts from Dendrobium huoshanense against Alcohol-Induced Subacute Liver Injury in Mice
MENG Haitao, WANG He, ZHA Xueqiang, PAN Lihua, LUO Jianping*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Objective: To compare the protective effects of different extracts from Dendrobium huoshanense against alcoholinduced subacute liver injury in mice. Methods: Freeze-dried Dendrobium huoshanense and its different extracts including water extract, alcohol-soluble extract, alcohol-insoluble extract and crude polysaccharides were prepared. Mouse liver injury was induced by oral administration of 30% alcohol and different extracts were employed to intervene in the liver injury. After continuous treatment for 30 days, mouse body weight and liver weight were measured, liver pathological changes were examined, the contents of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase(ALP), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were determined, and the levels of hepatic alcohol dehydrogenase (ADH), acetaldehyde dehydrogenase(ALDH), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), malonaldehyde (MDA), and glutathione (GSH)were determined. Results: The protective effects of freeze-dried Dendrobium huoshanense, and its water extract and alcoholinsoluble extract against alcohol-induced subacute liver injury were better than that of alcohol-soluble extract, but lower than that of crude polysaccharides. Liver tissue damage and steatosis in mice subjected to 30% alcohol were ameliorated by oral administration with crude polysaccharides, the levels of ALT, AST, ALP, LDL-C, TC and TG in serum were reduced,the level of HDL-C in serum and the activities of ADH, ALDH, SOD and GSH-Px in liver were enhanced, and the loss of GSH and the increase of MDA in liver were suppressed. Conclusion: Polysaccharides are the major functional factors in Dendrobium huoshanense protecting liver tissue from alcohol-induced injury.
Dendrobium huoshanense; extract fractions; subacute alcoholic liver injury
Q946.3
A
1002-6630(2015)13-0229-06
10.7506/spkx1002-6630-201513042
2014-07-29
安徽省科技攻關計劃項目(12010402088)
孟海濤(1990—),男,碩士,研究方向為中草藥與功能食品。E-mail:haitaomeng2013@163.com
羅建平(1966—),男,教授,博士,研究方向為食品化學與分子營養(yǎng)。E-mail:jianpingluo@hfut.edu.cn