姚璐曄，李　想，邢　鋆，高　杏，曹葉萍，顧佳佳

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

紫外誘變選育高效降解甲醛菌株及其降解特性

姚璐曄1，李想2，邢鋆1，高杏1，曹葉萍1，顧佳佳1

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

以甲醛降解菌——擬青霉菌（Paecilomyces variotii）CSLG1為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，并考察突變株對(duì)甲醛的降解特性。選用功率15 W的紫外燈、照射距離30 cm、照射時(shí)間30 s、致死率為88%的誘變強(qiáng)度對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變；通過(guò)初篩、復(fù)篩選育出一株甲醛抗性及其降解能力明顯提高的誘變菌株F1-23。結(jié)果表明：F1-23臨界甲醛抗性質(zhì)量濃度為7.88 g/L，比誘變前提高22.2%；甲醛脫氫酶酶活力為83.6 U/mg，提高了23.8%。連續(xù)傳代5 代，誘變菌株F1-23的甲醛抗性和降解力基本不變，證實(shí)其具有良好的遺傳穩(wěn)定性。誘變菌株F1-23對(duì)甲醛的抗性及降解能力均較出發(fā)菌株高。

甲醛降解；擬青霉菌；紫外誘變；甲醛脫氫酶；降解率

甲醛是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物，其特點(diǎn)為毒性大，毒性作用多樣［1-2］。常見(jiàn)的去除方法有活性炭去除、光催化去除、臭氧分解、甲醛去除劑、植物分解、微生物降解法［3-4］、高負(fù)荷生物濾池、吸附再生曝氣池等［5］。微生物法則相對(duì)以生態(tài)環(huán)境中的有益菌為材料，成本低，效率好，且無(wú)二次污染。因此，甲醛的生物降解已成為研究的熱點(diǎn)。

已有研究報(bào)道［6］，在自然界中分離得到的甲醛降解菌大部分為細(xì)菌和少部分的真菌。目前，甲醛降解細(xì)菌的種類大致有惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、假產(chǎn)堿假單胞菌、睪丸酮假單胞菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌等，它們能以甲醛為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，具有一定的甲醛降解能力。雖然生物法可以將甲醛完全去除，但生物法所能降解的質(zhì)量濃度較低，一般為0.1～0.8 g/L甚至更低，而化工廢水中的甲醛含量高達(dá)10 g/L，這就需要選育耐受濃度更高、降解能力更強(qiáng)的菌株。

傳統(tǒng)的微生物人工育種方法有：誘變育種、雜交育種（包括原生質(zhì)體融合）和基因工程育種［7］。其中誘變育種最為廣泛，是采用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體，促使其中少數(shù)細(xì)胞中的遺傳物（主要是DNA）結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起微生物遺傳性狀發(fā)生改變，然后從群體中篩選出優(yōu)良突變菌株的過(guò)程［8］。物理誘變法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、價(jià)格低廉，目前廣泛應(yīng)用于微生物；而紫外線是常用的物理誘變因子。本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的甲醛降解菌擬青霉菌（Paecilomyces variotii）CSLG1為研究對(duì)象，通過(guò)紫外誘變篩選降解能力高、綜合性狀優(yōu)良且遺傳穩(wěn)定的菌株，以期為進(jìn)一步理論研究及應(yīng)用提供良好的菌種資源。

1　材料與方法

1.1菌種

甲醛降解菌——擬青霉菌CSLG1，保藏于常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院生物示范中心實(shí)驗(yàn)室［6］。

1.2試劑及其配制

葡萄糖、NaNO3、MgSO4、FeSO4、牛肉浸膏、KCl、乙酸銨、冰乙酸、乙酰丙酮均為分析純 江蘇省強(qiáng)盛化工有限公司；甲醛溶液（37%～40%） 蘇州市振興化工廠。

乙酰丙酮溶液［9］：50 g乙酸銨、6 mL冰乙酸及0.5 mL乙酰丙酮試劑溶于100 mL水中。此溶液4 ℃冷藏。

鄰甲苯胺試劑：稱取硫脲2.5 g，用750 mL冰醋酸溶解，加鄰甲苯胺150 mL和2.4%硼酸100 mL，用冰醋酸定容至1 000 mL。

pH 7.5、0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液：0.34 g K2HPO4溶于50 mL去離子水中，用1 mol/L KOH 在37 ℃調(diào)節(jié)pH值為7.5。

1.3儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EL-20臺(tái)式pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外誘變臺(tái) 濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠。

1.4培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖4、牛肉膏 0.4、KCl 0.05、MgSO4·7H2O 0.1、FeSO4·3H2O 0.01，pH 7.5。添加1 070 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.25%甲醛至90 mL的液體培養(yǎng)基中，配制甲醛質(zhì)量濃度為8 g/L。

固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、NaNO32、K2HPO4·3H2O 1、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·3H2O 0.01、瓊脂20、甲醛0.3，pH 6.7。

甲醛梯度雙層瓊脂培養(yǎng)基：在無(wú)菌平皿中倒入固體培養(yǎng)基，墊起平皿一側(cè)，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)三角狀，待培養(yǎng)基凝固后，將平皿放平，倒入含有8 g/L的甲醛固體培養(yǎng)基，冷凝。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1誘變

1.5.1.1制備孢子液

利用無(wú)菌脫脂棉，過(guò)濾從斜面上洗脫的孢子，并將孢子用玻璃珠充分打散，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，控制濃度在107個(gè)/mL左右，并確保無(wú)菌絲。

1.5.1.2涂布孢子液

將孢子液適當(dāng)稀釋，涂布平板計(jì)數(shù)，作為計(jì)算紫外誘變致死率和正突變率的基礎(chǔ)。

1.5.1.3紫外誘變

采用15 W紫外燈，確定照射距離為30 cm，在照射時(shí)間為15、30、60、120、180 s和240 s的誘變強(qiáng)度下誘變。誘變結(jié)束后，將孢子液接入不含甲醛的液體培養(yǎng)基，避光、25 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 h，稀釋涂布，避光25 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察計(jì)數(shù)。

1.5.1.4確定最佳誘變強(qiáng)度

根據(jù)誘變后各平板上成活菌種個(gè)數(shù)計(jì)算在每一誘變強(qiáng)度下的死亡率，以確定最佳誘變強(qiáng)度。

式中：a為誘變前涂布平板菌落數(shù)/（CFU/mL）；b為誘變后涂布平板菌落數(shù)/（CFU/mL）。

紫外誘變的致死率在90%左右的誘變強(qiáng)度最佳［10］，因此選擇在此誘變強(qiáng)度下誘變。

1.5.1.5初篩［11］

誘變后采用梯度平板法篩選，吸取0.2 mL菌懸液涂布于甲醛梯度雙層瓊脂培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)10 d，挑選耐受濃度高的單菌落。

1.5.1.6復(fù)篩

將初篩得到的菌株置于含有一定甲醛濃度的液體培養(yǎng)基中， 25 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，測(cè)定生物量。

1.5.1.7遺傳穩(wěn)定性

將篩選得到的菌株在其最高耐受甲醛質(zhì)量濃度下連續(xù)接種5 代，檢測(cè)生物量；在其最高甲醛質(zhì)量濃度下連續(xù)接種5 代，測(cè)定其降解能力，確定遺傳穩(wěn)定性。

1.5.2檢測(cè)方法

1.5.2.1甲醛質(zhì)量濃度測(cè)定［12］

參照修訂后的HJ601—2011《水質(zhì) 甲醛的測(cè)定 乙酰丙酮分光光度法》，試樣稀釋100 倍后取0.05 mL，加入1 mL乙酰丙酮溶液、4.95 mL蒸餾水，沸水浴煮沸10 min，室溫冷卻放置10 min，在414 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的甲醛含量。

1.5.2.2葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定［13］

過(guò)濾菌絲后的濾液，稀釋10 倍，取0.2 mL加入5 mL鄰甲苯胺試劑于沸水浴保溫8～10 min，冷卻至室溫后，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。

1.5.2.3甲醛脫氫酶酶活力測(cè)定［14］

濾紙過(guò)濾菌液，取菌絲置于冰浴中，菌絲-石英砂-緩沖液（pH 7.5）按1∶1∶2的比例研磨，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

取0.2 mL去離子水、2 mL緩沖液（pH 7.5）、0.5 mL β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide，β-NAD）、0.1 mL甲醛和0.1 mL谷胱甘肽，于37 ℃水浴鍋恒溫，加0.1 mL粗酶液，反應(yīng)5 min，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。空白組加入0.1 mL緩沖液（pH 7.5）代替酶液。

酶活力單位的定義：在pH 7.5、30 ℃條件下，每分鐘催化生成1 μmol的NADH為1 個(gè)酶活力單位，U/mg菌絲體表示。

式中：t為反應(yīng)時(shí)間/min；6.22為每毫摩爾NADH在340 nm波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)。

1.5.2.4生物量測(cè)定［15］

將定量濾紙于60 ℃恒溫干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，記錄濾紙凈質(zhì)量（m1，g）。用該濾紙過(guò)濾100 mL培養(yǎng)液，自然過(guò)濾，將濾紙于60 ℃恒溫干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量（m2，g）。兩者之差表示菌體生物量，以生物量表示100 mL菌液中菌絲體濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1誘變時(shí)間的選擇

前期實(shí)驗(yàn)確定照射距離為30 cm，分別選取15、30、60、120、180 s和240 s對(duì)出發(fā)菌株CSLG1進(jìn)行照射。由圖1可知，在照射僅15 s時(shí)，其致死率已達(dá)到75%，由此可見(jiàn)出發(fā)菌株對(duì)紫外線較敏感。根據(jù)致死率為90%左右的誘變效果最好，選取誘變時(shí)間為30 s。

圖1　出發(fā)菌株CSLG1的致死曲線Fig.1　Lethality curve of the initial strain CSLG1

2.2菌種篩選

2.2.1初篩

初篩采用甲醛梯度雙層瓊脂培養(yǎng)基篩選，隨著甲醛質(zhì)量濃度的提高，平板上菌落生長(zhǎng)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，菌落數(shù)減少。在培養(yǎng)初期（≤72 h），在甲醛低質(zhì)量濃度區(qū)域觀察到孢子萌發(fā)后形成的菌落，菌落形成之初，以其萌發(fā)形成凸點(diǎn)為中心，呈放射狀生長(zhǎng)白色菌絲，后逐漸蔓延并在白色菌絲上生成孢子。高質(zhì)量濃度區(qū)域孢子萌發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)，出現(xiàn)在培養(yǎng)144～240 h，在高質(zhì)量濃度區(qū)域菌落彼此未接觸前，挑取單菌落進(jìn)行復(fù)篩。圖2為篩選平板經(jīng)25 ℃培養(yǎng)10 d即240 h的結(jié)果。

圖2　紫外誘變后初篩結(jié)果Fig.2　The first round of screening of mutant strains

2.2.2復(fù)篩

通過(guò)初篩確定了60 個(gè)菌株，進(jìn)行復(fù)篩。通過(guò)試管培養(yǎng)，逐步提高甲醛質(zhì)量濃度；以生物量為指標(biāo)，篩選出10 株菌株，此時(shí)甲醛質(zhì)量濃度為6.85 g/L。篩選結(jié)果如表1所示，當(dāng)甲醛質(zhì)量濃度為7.88 g/L時(shí)，F(xiàn)1-23菌株和F1-48菌株仍能生長(zhǎng)，但F1-23的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于F1-48菌株，菌絲多且厚，生物量亦為其1.6 倍，因此確定F1-23菌株為最終實(shí)驗(yàn)菌株。

表1　復(fù)篩結(jié)果Table1　The second round of screening of selected mutants

2.3誘變菌株F1-23與出發(fā)菌株CSLG1的性能比較

2.3.1菌落形態(tài)變化

圖3　誘變前后菌落形態(tài)對(duì)比Fig.3　Morphological comparison of CSLG1 （a） and F1-23 （b）

由圖3可知，誘變菌株F1-23的孢子顏色較出發(fā)菌株SCLG1發(fā)生了變化，CSLG1顏色淡黃褐色，F(xiàn)1-23的呈現(xiàn)棕褐色，顏色比CSLG1深。菌落形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，F(xiàn)1-23較CSLG1更致密，但差異不大，尤其在菌落形成初期，菌落較小時(shí)兩者幾乎沒(méi)有差異。這一結(jié)果表明菌落形態(tài)對(duì)本實(shí)驗(yàn)誘變篩選的作用不大，這為今后進(jìn)一步誘變篩選提供了借鑒。

2.3.2甲醛降解能力比較

圖4　誘變前后菌株甲醛降解能力的對(duì)比Fig.4　Comparison of formaldehyde degradation ability of CSLG1 and F1-23

如圖4所示，誘變菌株F1-23的甲醛降解能力顯著提高。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在甲醛質(zhì)量濃度為3.08 g/L，CSLG1和F1-23的甲醛降解率未達(dá)到顯著差異水平（P＞0.05），說(shuō)明突變體對(duì)低質(zhì)量濃度甲醛的降解能力并未受到影響。在不同甲醛質(zhì)量濃度之間，CSLG1在低質(zhì)量濃度（3.08、3.70 g/L）甲醛條件下，對(duì)甲醛的降解率之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），但在3.7、4.32 g/L和4.63 g/L質(zhì)量濃度條件下，降解率達(dá)到極顯著差異水平（P＜0.01）。F1-23在較高甲醛質(zhì)量濃度（4.32、4.63 g/L）條件下，其降解率達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。這些結(jié)果說(shuō)明，菌株CSLG1和F1-23對(duì)甲醛的降解率水平明顯不同。培養(yǎng)120 h后，誘變菌F1-23能夠基本降解4.32 g/L甲醛溶液，降解率為85%，而出發(fā)菌株CSLG1僅為25%，誘變之后菌株的降解能力提高了2.4 倍。

2.3.3在含有甲醛的培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)特性比較

為了能更直觀準(zhǔn)確地對(duì)比誘變前后菌株生長(zhǎng)特性的差異，分別在含有3.08 g/L甲醛的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)出發(fā)菌株CSLG1和誘變株F 1- 23，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、6。如圖5所示，出發(fā)菌株CSLG1在最初的60 h內(nèi)緩慢降解甲醛，在60～72 h內(nèi)進(jìn)入甲醛快速降解期，直至120 h時(shí)甲醛被完全降解。而葡萄糖的消耗在前96 h較低，當(dāng)甲醛近乎耗盡時(shí)，開(kāi)始利用葡萄糖，菌株進(jìn)入快速生長(zhǎng)期。

圖6是誘變菌株F1-23的生長(zhǎng)曲線。F1-23在最初72 h內(nèi)以恒定速率降解甲醛，在72～84 h內(nèi)進(jìn)入甲醛快速降解期；84 h時(shí)已將甲醛完全降解，降解周期比出發(fā)菌株縮短了36 h。經(jīng)過(guò)誘變之后的菌株與誘變前的在葡萄糖利用上基本相似，利用率由原來(lái)的28%上升至38%，同時(shí)導(dǎo)致生物量上升了15.9%。

圖5　出發(fā)菌株CSLG1的生長(zhǎng)曲線Fig.5　The growth curve of the original strain CSLG1

圖6　誘變菌株F1-23的生長(zhǎng)曲線Fig.6　The growth curve of themutant strain F1-23

2.3.4甲醛脫氫酶酶活力比較

出發(fā)菌株CSLG1在培養(yǎng)60 h進(jìn)入甲醛快速降解期，至72 h結(jié)束（圖5）；由此推測(cè)此階段的甲醛脫氫酶酶活力最高，確定在培養(yǎng)66 h取樣，根據(jù)1.5.2.3節(jié)測(cè)得酶活力為67.5 U/mg。

誘變菌株F1-23在72 h進(jìn)入甲醛快速降解期，至84 h結(jié)束（圖6），推斷此階段的甲醛脫氫酶酶活力最高，確定培養(yǎng)78 h后取樣，根據(jù)1.5.2.3節(jié)測(cè)定酶活力，為83.6 U/mg，較誘變前提高了23.8%。

2.4誘變菌株的穩(wěn)定性

表2　誘變菌株F1-23甲醛抗性和甲醛降解能力遺傳穩(wěn)定性Table2　Genetic stability of the formaldehyde resistance and degradation ability of F1-23

如表2所示，誘變菌株F1-23在其甲醛最高耐受質(zhì)量濃度（7.88 g/L）下，每一代均生長(zhǎng)良好；而在其最高甲醛降解質(zhì)量濃度（4.63 g/L）下，每一代的降解率基本維持在27%左右。因此，誘變菌株F1-23具有很好的遺傳穩(wěn)定性。

3　討 論

紫外誘變具有隨機(jī)性，既可以引起抗性基因發(fā)生突變，也可導(dǎo)致與正常生長(zhǎng)相關(guān)的基因發(fā)生突變，其中任何一種突變均有可能引起菌株生長(zhǎng)發(fā)生變化。本研究中通過(guò)紫外誘變得到的突變菌F1-23在正常條件下的生長(zhǎng)并未受到影響，其菌落形態(tài)的改變不顯著；對(duì)于低質(zhì)量濃度甲醛的降解率幾乎無(wú)改變，但隨著甲醛質(zhì)量濃度的增高，抗性及其降解能力顯著提高。因此，突變菌F1-23對(duì)甲醛降解率的提高是紫外照射導(dǎo)致的基因位點(diǎn)發(fā)生突變的結(jié)果。

通過(guò)紫外誘變、初篩及復(fù)篩方法篩選得到的甲醛降解菌F1-23，其最高甲醛耐受質(zhì)量濃度已達(dá)到7.88 g/L，超過(guò)目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的最高質(zhì)量濃度7.5 g/L［16-20］，這對(duì)研究極端微生物提供了很好的樣本，同時(shí)也為生物降解高質(zhì)量濃度甲醛廢水提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，菌株F1-23的甲醛脫氫酶的酶活力為83.6 U/mg，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的其他甲醛降解菌［2，21-22］。

目前，利用微生物降解甲醛已成為甲醛降解的研究熱點(diǎn)。盡管誘變菌株F1-23在耐受質(zhì)量濃度及酶活方面有顯著的提高，但要應(yīng)用于生產(chǎn)還需進(jìn)一步馴化。Tetsuya等［14］報(bào)道，其從土壤中分離了一株甲醛降解真菌Aspepgillus nomius IR1013，能在最高甲醛質(zhì)量濃度為4.5 g/L中生長(zhǎng)并將其完全消耗掉。Saeed等［23］報(bào)道，其得到的一株P(guān). pseudoalcaligenes OSS在培養(yǎng)24 h后，可將3.70 g/L甲醛100%消耗，培養(yǎng)72 h可將5.92 g/L甲醛消耗70%。而本實(shí)驗(yàn)菌株在培養(yǎng)84 h后，可將3.08 g/L甲醛完全降解，培養(yǎng)120 h后可將4.63 g/L甲醛消耗30%，無(wú)論從降解質(zhì)量濃度還是降解時(shí)間都存在一定差距。因此今后的工作將放在提高其降解能力，以期得到更高的甲醛降解力菌株，為工業(yè)應(yīng)用提供良好菌種資源。

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Ultraviolet Mutagenesis of Paecilomyces variotii for Formaldehyde Degradation and Degradation Characteristics of Its Mutant Strain

YAO Luye1， LI Xiang2， XING Yun1， GAO Xing1， CAO Yeping1， GU Jiajia1
（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu 215500， China；2. School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Paecilomyces variotii CSLG1A， a strain able to degrade formaldehyde， was mutagenized by ultraviolet （UV）irradiation and the selected mutants were tested for their abilities to degrade formaldehyde. The UV mutagenesis was carried out by placing the original strain at a distance of 30 cm away from a 15-W UV light lamp for 30 s， yielding a mortality rate of 88%. The mutant stain F1-23 with significantly increased formaldehyde degradation ability was obtained by two rounds of screening. The critical formaldehyde concentration degraded by the mutant strain was 7.88 g/L， which was enhanced by 22.2% when compared with that obtain with the original strain. The activity of formaldehyde dehydrogenase produced by F1-23 was 83.6 U/mg， representing a 23.8% increase over that produced by the original strain. The formaldehyde resistance and degradation capacity of F1-23 remained substantially unchanged after 5 passages， suggesting good genetic stability. In summary， the strain F1-23 holds great promise for application in the exploration of formaldehyde biodegradation.

formaldehyde degradation； Paecilomyces variotii； ultraviolet mutagenesis； formaldehyde dehydrogenase； degradation

Q939.9

A

1002-6630（2015）13-0143-05

10.7506/spkx1002-6630-201513027

2014-08-13

2012年全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)踐計(jì)劃項(xiàng)目（201210333014）；常熟理工學(xué)院校青年教師科研啟動(dòng)項(xiàng)目（KYZ2011178Z）；常熟理工學(xué)院2014屆本科畢業(yè)論文重點(diǎn)資助項(xiàng)目（LG79）

姚璐曄（1983—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸?。E-mail：yaoluye@cslg.com