廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（510623）鄭健斌 張劍琿 陶建平 司徒勛 黃莉

干擾素家族(IFNs)是一類對抗病毒活性有標(biāo)志功能并與細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子蛋白質(zhì)，具有生物功能的多樣性[1]，已被廣泛應(yīng)用于病毒感染疾病的預(yù)防和治療[2]。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白( interferon inducible transmembrane proteins，IFITM) 1、2、3可以抑制流感病毒的早期復(fù)制。目前該蛋白的抗病毒作用及其機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。本研究通過大量閱讀以往相關(guān)文獻(xiàn)，探討了（IFITM)1、2、3抗小兒流感病毒的效果，現(xiàn)將其報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1、2、3 及 β-actin 目的基因的質(zhì)粒 pVAXl-IFITMl、pVAXl-IFITM2、pVAXl-IFITM3和pMD-18T-β-actin由本院實(shí)驗(yàn)中心構(gòu)建并保存；真核表達(dá)載體pCMV-N-HA購自上海三維生物技術(shù)有限公司。

1.1.1 細(xì)胞株與培養(yǎng) A549細(xì)胞株（人肺癌細(xì)胞系，購自中科院北京細(xì)胞庫）。用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液置37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，含5.0%二氧化碳的37℃溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞以3×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，37℃，5%二氧化碳孵育14小時[3]。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照X-treme GENE HP DNATransfection Reagent說明書中推薦的轉(zhuǎn)染程序，轉(zhuǎn)入相應(yīng)劑量的pCMV-N-HANS質(zhì)粒，6～8小時后更換培養(yǎng)液。同時將pCMV-N-HA空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染做對照并進(jìn)行分析。

1.2.3 蛋白表達(dá)量檢測 將病毒液分別接入IFITM1、IFITM2、IFITM3的細(xì)胞孔中48h后，采用Western blot 方法檢測流感病毒后NS的變化，以此來證明IFITM對病毒的抵制效果。將已包裝出的病毒液按照6孔細(xì)胞板每孔1moi的量加入到應(yīng)經(jīng)過IFITM1、IFITM2、IFITM3的細(xì)胞孔中，并作為陰性對照，按毒48h后，收取細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western blot 方法檢測NS的變化[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 for windows軟件包，運(yùn)用兩獨(dú)立樣本的值和檢驗(yàn)分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFITM對抗流感病毒A549細(xì)胞效果 將重組質(zhì)粒pVIFITM1、pVIFITM2、pVIFITM3轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，等待48h后，將上述已經(jīng)包裝好的病毒液分別加入過表達(dá)的細(xì)胞孔內(nèi)，每孔加入1moi的病毒液，48h后收取細(xì)胞，采用Western blot 方法檢測NS的變化。結(jié)果顯示IFITM1、IFITM2、IFITM3可以有效抵制流感病毒蛋白NS的表達(dá)，見附圖。

附圖 Western blot檢測結(jié)果

3 討論

干擾素家族(IFNs)是生命體中重要的生理功能的細(xì)胞因子，但I(xiàn)FNs不能直接發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤、抗免疫反應(yīng)等作用，其發(fā)揮作用主要依賴于與受體（IFNR）的結(jié)合，從而誘導(dǎo)大量干擾素刺激基因的表達(dá)，這些刺激基因間接或直接發(fā)揮抗病毒等作用[5]。而干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins，IFITM)就是這些刺激基因中最主要的基因之一。大量研究顯示，IFITM1、IFITM2、IFITM3在細(xì)胞中的過度表達(dá)抵制了病毒蛋白的表達(dá)[6]。流感病毒是常見的易感病毒之一，其屬于正點(diǎn)病毒科，基因組由8個分節(jié)段的負(fù)鏈RNA組成，編碼NS1和NS2兩個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中NS1蛋白在病毒感染過程中發(fā)揮主要作用[7]。

本研究為了探討IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白是否具有抗流感病毒的效果，通過感染IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白的表達(dá)，評估其活性，同時通過檢測流感病毒蛋白的表達(dá)變化，探討IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白對抗流感病毒的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白均具有一定的抗流感病毒效果。

綜合上述研究，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白能夠抑制流感病毒NS蛋白的表達(dá)，值得臨床進(jìn)行更深入的研究。