徐楊玉溫世杰李海芬李玲梁炫強(qiáng)

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631）

綠色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的構(gòu)建與原核表達(dá)

徐楊玉1，2溫世杰1李海芬1李玲2梁炫強(qiáng)1

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣州 510640；2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631）

在TvALP基因和TvRBL基因間加入一段柔性鏈接頭（linker）基因序列，構(gòu)建融合基因。生物信息學(xué)分析表明該融合基因含有一段信號(hào)肽序列。利用RT-PCR技術(shù)從綠色木霉菌絲體總RNA中擴(kuò)增出TvRBL基因、TvALP基因和去除信號(hào)肽的ΔTvALP基因，分別克隆到原核表達(dá)載體pET30a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，去除信號(hào)肽的表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中獲得了表達(dá)，在60 kD處有一條蛋白質(zhì)特異條帶，與預(yù)測(cè)的目的產(chǎn)物蛋白條帶大小一致。

綠色木霉；TvALP-linker-TvRBL融合基因；信號(hào)肽；原核表達(dá)

生物防治黃曲霉毒素污染是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。綠色木霉是重要的生物防治菌，在植病生防中具有重要的作用。它的作用機(jī)制有以下幾種：（1）抗生作用；（2）重寄生作用；（3）溶菌作用；（4）競(jìng)爭(zhēng)作用（主要為對(duì)生存空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)）；（5）誘導(dǎo)植物抗性；（6）協(xié)同拮抗作用；（7）毒性蛋白。

綠色木霉中的蓖麻毒素-B-凝集素（TvRBL）和堿性蛋白酶（TvALP）在植病生防中的作用機(jī)制分別屬于毒性蛋白和重寄生作用，其中重寄生作用是主要的防治機(jī)制。堿性蛋白酶可以降解植物病原真菌細(xì)胞壁，從而抑制病原菌的孢子萌發(fā)，并引起菌絲和孢子的崩解，以達(dá)到殺滅病原真菌的目的［1-4］。1978 年Rodriguez-Kabana發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性與綠色木霉（T. viride）防治白絹病（S. rotlfsii）的能力有關(guān)［5］。而蓖麻毒蛋白-B-凝集素最早在傘菌中發(fā)現(xiàn)具有血凝活性［6］，其細(xì)胞凝集作用機(jī)制是凝集素分子的一個(gè)亞基與一個(gè)細(xì)胞表面的凝集素專(zhuān)一識(shí)別的糖基結(jié)合，另一個(gè)亞基與另一個(gè)細(xì)胞上的糖基結(jié)合，從而通過(guò)凝集素的“架橋”作用而導(dǎo)致的［7］。1994年P(guān)emberton［8］發(fā)現(xiàn)他所研究的400余種大型真菌中，50%具有很強(qiáng)的凝集素活性。

本研究前期成功克隆了綠色木霉TvRBL和TvALP兩個(gè)基因，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，TvRBL蛋白為可溶性表達(dá)；而TvALP蛋白形成了包涵體，復(fù)性不成功，無(wú)法研究對(duì)黃曲霉的作用機(jī)理，因此獲得有活性的堿性蛋白酶對(duì)生物防治黃曲霉意義重大。目前，構(gòu)建融合蛋白已經(jīng)成為一種行之有效的方法來(lái)增加可溶性蛋白的表達(dá)和方便蛋白的純化［9，10］。其方法之一是通過(guò)連接肽序列將功能分子連接起來(lái)。本研究通過(guò)添加5個(gè)中性氨基酸的柔性多肽序列將TvRBL基因連接到TvALP基因的下游，構(gòu)建pET30a-TvALP-linker-TvRBL以及切除信號(hào)肽的pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL原核表達(dá)載體，切除信號(hào)肽后獲得目的蛋白，旨在為進(jìn)一步研究該融合蛋白的可溶性表達(dá)以及抗黃曲霉污染的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體質(zhì)粒 菌株綠色木霉（Trichoderma viride）由本實(shí)驗(yàn)室前期獲得；黃曲霉（Aspergillus flavus L.）菌株GIM3.493引自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該菌株侵染能力和產(chǎn)毒能力均較強(qiáng)；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）pLysS是本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種；載體有pUM-T Vector（Bioteke）、pET30a Vector（Novagen）。

1.1.2 試劑與工具酶盒 絲狀真菌RNA提取試劑盒、純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；各限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物合成與測(cè)序由Invitrogen公司完成；BioTeke 2×Power Taq PCR Master Mix購(gòu)Bioteke；蛋白Marker、Gel Extraction Kit均為T(mén)IANGEN公司的產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、考瑪斯亮藍(lán)R-250、TEMED、過(guò)硫酸胺、二硫蘇糖醇（DTT）等常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 常用溶液及培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏5、胰蛋白胨10、NaCl 10，加過(guò)柱水，調(diào)pH值至 7.0，常壓滅菌20 min；LB 固體LB培養(yǎng)基在液體LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加15 g瓊脂粉。

綠色木霉菌絲基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液100 mL，Mandels微量元素濃縮液1 mL，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL，吐溫-80 2 mL，胰蛋白胨1.5 g，D-葡萄糖20 g，雙蒸水定容至1 L。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。把馬鈴薯去皮后，切成1 cm3的小塊煮沸30 min，然后用紗布過(guò)濾，再加蔗糖和瓊脂，并補(bǔ)足水至1 L，混勻后分裝，115℃滅菌20 min，室溫保存。

50×TAE：242 g Tris，37.2 g Na2EDTA·2H2O，800 mL去離子水溶解，加入57.1 mL醋酸，混勻，去離子水定容至1 L，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

常用抗生素：氯霉素用無(wú)水乙醇溶解，其余抗生素滅菌水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 融合基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的TvALP cDNA基因序列（GenBank登錄號(hào)：KJ659907）和TvRBL cDNA基因序列（GenBank登錄號(hào)：KJ659907），去除TvALP基因的終止密碼子和TvRBL基因的起始密碼子，中間用5個(gè)中性氨基酸的小型連接（GGCGGTGGCGGCAGC），將TvRBL基因連接到TvALP基因的下游，構(gòu)建TvALP-linker-TvRBL融合基因（圖1）。生物信息學(xué)分析（圖2）表明，該融合基因前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。

1.2.2 PCR引物與linker的設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)測(cè)的融合基因序列，運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物。擴(kuò)增TvALP基因序列的引物為T(mén)valp；擴(kuò)增ΔTvALP基因序列的引物為ΔTvalp；擴(kuò)增TvRBL基因序列的引物為T(mén)vrbl。具體的PCR引物序列見(jiàn)表1。

圖1 TvALP-linker-TvRBL融合基因

圖2 TvALP-linker-TvRBL融合基因信號(hào)肽的預(yù)測(cè)

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

1.2.3 目的片段的擴(kuò)增、PCR鑒定與測(cè)序 以綠色木霉菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用引物Tvalp、ΔTvalp及Tvrbl，分別擴(kuò)增TvALP、ΔTvALP和TvRBL三個(gè)目的片段，PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 10 μL；引物各1.0 μL；模板為1.0 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，按照DNA凝膠回收試劑盒操作純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

回收純化后的目的片段與pUM-T質(zhì)粒連接調(diào)制成10 μL，反應(yīng)體系如下：pUM-T質(zhì)粒1 μL，T4 DNA Ligase（3 U/μL）1 μL，2×T4 DNA Rapid Ligation Buffer 5 μL，目的片段3 μL，22-25℃反應(yīng)10-30 min。取連接產(chǎn)物10 μL加入冰上融化的100 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α，混勻冰浴30 min；42℃熱激90 s，冰浴2 min。向離心管中加入500 μL 37℃預(yù)熱的（不含抗生素）LB培養(yǎng)基150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)60 min，使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)；取100 μL菌液涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置30 min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

挑取LB平板培養(yǎng)基上的孤立菌落，以1 μL菌懸液為模板，PCR反應(yīng)體系和程序同上，將預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)到15 min。反應(yīng)結(jié)束后1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pUM-T-TvALP、pUM-T-ΔTvALP及pUM-TTvRBL。

1.2.4 融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Kpn I和BamHⅠ雙酶切堿裂解法獲得的pUM-T-TvALP質(zhì)粒、pUM-T-ΔTvALP質(zhì)粒和pET30a載體，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，37℃過(guò)夜搖菌，堿裂解法提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pE30a-TvALP和pE30a-ΔTvALP。

BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切堿裂解法獲取的pUM-T-TvRBL重組質(zhì)粒和鑒定正確的pET30a-TvALP、pET30a-ΔTvALP重組質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化BL21（DE3）pLysS菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有終濃度50 μg/mL Kanamycn和34 μg/mL Chloromycetin的LB選擇性平板上，37℃培養(yǎng)，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定。以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL為 模板，用Tvalp、Tvalp-Tvrbl、Tvrbl、ΔTvalp、ΔTvalp-Tvrbl這5對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用Kpn Ⅰ 和BamHⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ分別對(duì)兩個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名pET30a-TvALP-linker-TvRBL、pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL。

1.2.5 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 提取質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL、pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）pLysS，分別挑取一個(gè)單克隆菌落接種于含有終濃度為50 μg/mL Kanamycn和34 μg/mL Chloromycetin 的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。次日按1%轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)。每隔2 h取樣，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h，同時(shí)以轉(zhuǎn)化有空載體pET30a的BL21（DE3）pLysS為陰性對(duì)照。分別離心收集細(xì)菌沉淀，每管加入400 μL蛋白上樣緩沖液，重懸后煮沸10 min，10 000×g離心10 min取上清液備用。

SDS-PAGE分析：配制12%分離膠和5%濃縮膠，取上述樣品，每孔30 μL，濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V，電泳結(jié)束后，參照康彬等［11］（2000）的方法，剝膠后用ddH2O沖洗數(shù)次，在考馬斯亮藍(lán)染色液中短暫振動(dòng)染色20 min，然后用ddH2O反復(fù)沖洗后，浸入250 mmol/L KCl溶液中，直到背景清晰為止，整個(gè)過(guò)程大約需要1 h。暫時(shí)保存在保存液中或立即拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果（圖3）表明，以綠色木霉菌絲體總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用P1和P2、P1'和P2、P3和P4三對(duì)基因特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得 TvALP、ΔTvALP和TvRBL三個(gè)目的片段，大小約1 227、1 167及456 bp，與預(yù)期大小相符。

圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)對(duì)pUM-T-TvALP、pUM-T-ΔTvALP和pUMT-TvRBL重組克隆質(zhì)粒的菌液PCR鑒定，分別得到大小約1 227、1 167及456 bp的目的片段（圖4），結(jié)果均與預(yù)期值相符，視為擬陽(yáng)性克隆，送華大測(cè)序，驗(yàn)證正確后，表明目的基因均已插入載體質(zhì)粒pUM-T多克隆位點(diǎn)。

圖4 重組克隆質(zhì)粒的菌落PCR檢測(cè)

2.3 融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒pET30a-TvALP和pET30a-ΔTv-ALP的Kpn Ⅰ 和BamH Ⅰ雙酶切鑒定、PCR鑒定，分別得到大小約5 382、1 227和1 167 bp的目的片段（圖5，圖6），結(jié)果均與預(yù)期值相符，證明質(zhì)粒中含有目的片段，并且基因序列和閱讀框架均正確，表明已成功構(gòu)建了pET30a-TvALP和pET30a-ΔTvALP載體。

圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-TvALP（A）和pET30a-ΔTvALP（B）的PCR鑒定

圖6 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-TvALP（A）和pET30a-ΔTvALP（B）的雙酶切鑒定

通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL和pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切和PCR鑒定，分別得到大小約為5 377、1 227、456、1 683、5 377、1 167、456和 1 623 bp的目的片段（圖7，圖8），結(jié)果均與預(yù)期值相符，證明兩個(gè)質(zhì)粒中分別含有TvALP-linker-TvRBL以及ΔTvALP-linker-TvRBL融合基因，并且基因序列和閱讀框架均正確，表明已成功構(gòu)建了TvALP-linker-TvRBL以及ΔTvALP-linker-TvRBL融合基因的表達(dá)載體。

圖7 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定

圖8 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定

2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

含重組質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的菌株未能誘導(dǎo)出蛋白，但含重組質(zhì)粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的菌株在60 kD處出現(xiàn)一條新生蛋白帶（圖9，圖10），與預(yù)測(cè)的融合蛋白大小相近，表明切除信號(hào)肽后可以誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。

圖9 TvALP-linker-TvRBL融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖10 ΔTvALP-linker-TvRBL融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

3 討論

本研究通過(guò)基因重組，組建了TvALP-linker-TvRBL及ΔTvALP-linker-TvRBL融合蛋白。融合蛋白中的兩個(gè)成分能否相互協(xié)同，發(fā)揮更好的生物活性，與二者能否分別形成正確的空間構(gòu)象是密切相關(guān)的。目前，多數(shù)研究者采用低疏水性及低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的多肽接頭充分伸展以分開(kāi)兩種組分，使它們能互不干擾地充分折疊成各自的天然構(gòu)象。一般認(rèn)為L(zhǎng)inker的長(zhǎng)度在5-25個(gè)氨基酸殘基為適，太短不能提供足夠的空間，較長(zhǎng)對(duì)蛋白的折疊及穩(wěn)定性有益，但容易受到蛋白酶的攻擊。含有Gly-Ser的連接肽是目前報(bào)道使用較多的連接肽之一，其中甘氨酸是分子量最小、側(cè)鏈最短的氨基酸，可增加側(cè)鏈的柔性；絲氨酸是親水性最強(qiáng)的氨基酸，可增加Linker的親水性［12-14］。

鐘丹丹等［15］通過(guò)添加10個(gè)中性氨基酸殘基的柔性肽基因序列將CD59和CD2兩類(lèi)重要的淋巴細(xì)胞膜表面分子連接起來(lái)，成功構(gòu)建了pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表達(dá)系統(tǒng)。張明明等［16］添加19個(gè)中性氨基酸殘基TS-（G4S）3-AC的Linker編碼序列將心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和肌鈣蛋白C（TnC）基因連接起來(lái)，成功構(gòu)建了pET28a-cTnI-linker-TnC融合基因原核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中可溶性表達(dá)。

為了保持融合蛋白的空間構(gòu)型，本研究在兩個(gè)基因之間添加了5個(gè)中性氨基酸的“小型柔性肽”，技術(shù)關(guān)鍵在于利用了linker基因中間的ggatcc序列恰好是BamHⅠ酶切位點(diǎn)這一特性，把linker基因分成兩部分，分別放在TvALP和TvRBL基因的引物中，通過(guò)BamHⅠ酶切連接，成功拼接出了linker基因，篩選到了pET30a-TvALP-linker-TvRBL及pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并在E.coli BL21（DE3）pLysS宿主菌中得以表達(dá)，這與國(guó)內(nèi)外一般采用合成單鏈，然后退火形成雙鏈DNA實(shí)現(xiàn)連接，或直接合成DNA后再連接的技術(shù)路線相比較，具有更容易篩選到陽(yáng)性重組子的優(yōu)點(diǎn)。

pET30a系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，已成功在大腸桿菌中表達(dá)了各種的異源蛋白［17，18］。本研究以pET30a質(zhì)粒為表達(dá)載體，以E.coli BL21（DE3）pLysS為宿主表達(dá)菌，將TvALP-linker-TvRBL及切除信號(hào)肽的ΔTvALP-linker-TvRBL的融合基因分別克隆到原核表達(dá)載體，在相同條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)含重組質(zhì)粒pET30a-TvALP-linker-TvRBL的菌株未誘導(dǎo)出蛋白，但含重組質(zhì)粒pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL的菌株可以誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。原核生物翻譯過(guò)程的正確起始于mRNA 5'端的SD序列及其SD序列與起始密碼子之間的距離有關(guān)，30S亞基中16S rRNA必須與SD序列結(jié)合，才能使起始密碼子正確進(jìn)入P位點(diǎn)，并形成復(fù)合物。因此，mRNA 5'端的二級(jí)結(jié)構(gòu)是影響翻譯起始的一個(gè)重要因素，TvALP-linker-TvRBL信號(hào)肽的存在，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端相對(duì)于去除信號(hào)肽的5'端形成復(fù)雜穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響到30S亞基與SD序列的識(shí)別與結(jié)合。

真核生物的信號(hào)肽在原核生物中進(jìn)行表達(dá)時(shí)大部分不具有分泌功能，并且它始終與活性蛋白融合在一起，影響活性蛋白的正確折疊與功能發(fā)揮，需要在體外切除，因此，采用切除信號(hào)肽序列的ΔTvALP-linker-TvRBL基因在原核細(xì)胞中獲得了表達(dá)。該研究需要進(jìn)一步探究該融合蛋白的可溶性，為下一步融合蛋白的純化，研究其抑制黃曲霉的分子作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)添加5個(gè)中性氨基酸的柔性多肽序列（linker）將TvRBL基因融合到TvALP基因的下游，成功構(gòu)建了pET30a-TvALP-linker-TvRBL原核表達(dá)載體以及切除信號(hào)肽的pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL原核表達(dá)載體，切除信號(hào)肽后獲得大小約60 kD的蛋白條帶。與預(yù)測(cè)的目的產(chǎn)物蛋白條帶大小一致。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction and Prokaryotic Expression of Trichoderma viride TvALP-linker-TvRBL Fusion Gene

Xu Yangyu1，2Wen Shijie1Li Haifen1Li Ling2Liang Xuanqiang1
（1. Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640；2. College of Life Science，South China Normal University，Guangzhou 510631）

Fusion gene were constructed by linking the TvALP and TvRBL genes with a flexible chain（linker）. Bioinformatics analysis showed that the fusion gene contained a signal peptide. The TvRBL、TvALP and ΔTvALP genes were cloned by RT-PCR from the total RNA of Trichoderma viride mycelium， which in turn were cloned into expression plasmid pET30a to construct prokaryotic expression plasmids pET30a-TvALP-linker-TvRBL and pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL， then these two expression plasmids were transformed into E.coli BL21（DE3）pLysS， and protein expression were induced by IPTG. SDS-PAGE was used to analyze the expression of the fusion protein. The result showed that expression plasmid pET30a-ΔTvALP-linker-TvRBL was obtained expression in E.coli BL21（DE3）pLysS， which was a specific band at about 60 kD in size and identical with the expected molecular weight of the fusion protein.

Trichoderma viride；TvALP-linker-TvRBL fusion gene；signal peptide；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.020

2014-05-22

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA10Z156），廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（07117967）

徐楊玉，男，碩士，研究方向：生物防治微生物學(xué)；E-mail：574301612@qq.com

梁炫強(qiáng)，男，博士后，研究員，研究方向：花生遺傳育種；E-mail：Liang804@yahoo.com