劉黎明孫偉張金噸趙麗霞李樹裕王標陳楊林胡樹香吳寶江李喜和，

（1.內(nèi)蒙古大學蒙古高原動物遺傳資源研究中心，呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術股份有限公司，呼和浩特011517）

Xist基因抑制對牛SCNT早期胚胎發(fā)育的影響

劉黎明1孫偉2張金噸1趙麗霞2李樹裕2王標1陳楊林1胡樹香2吳寶江2李喜和1，2

（1.內(nèi)蒙古大學蒙古高原動物遺傳資源研究中心，呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術股份有限公司，呼和浩特011517）

Xist是與X染色體失活相關的非編碼基因，它在合子期基因組開始表達，是胚胎發(fā)育早期表達的第一個印記基因。探討了特異性抑制Xist的TALER-REPRESSOR（TALER）載體轉染到胎牛成纖維細胞對Xist基因的抑制作用，并以抑制Xist基因表達的細胞作為核供體制作克隆胚胎，研究Xist基因抑制對牛克隆胚早期發(fā)育的影響。結果顯示，與對照組細胞相比，TALER載體將Xist相對表達量下調(diào)了93.85%，說明本試驗設計的載體轉染系統(tǒng)能夠有效抑制Xist基因的表達。選取Xist抑制表達陽性的轉染細胞用于體細胞核移植試驗，克隆胚胎發(fā)育結果顯示，試驗組和對照組的卵裂率、8細胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為78.8% vs 75.1%（P＞0.05，無顯著差異）、54.4% vs 50.6%（P＞0.05，無顯著差異）、12.3% vs 27.8%（P＜0.01，差異極顯著）、0 vs 26.6%（P＜0.01，差異極顯著）。綜上所述，試實驗設計的特異性抑制Xist表達的TALER載體可有效抑制雌性胎牛成纖維細胞中Xist的表達。供體細胞Xist這種基因下調(diào)可使克隆胚胎2-8細胞率略有提升，但囊胚期和桑葚胚率明顯降低。因此，其機制尚待于進一步探討。

Xist基因；TALER載體；胎牛成纖維細胞；克隆胚胎早期發(fā)育

Xist（X-inactive specific transcript）是一個與X染色體失活相關的非編碼RNA基因，在受精合子期開始激活，是胚胎早期發(fā)育表達的第一個印記基因［1］。盡管Xist是在雌性動物中參與X染色體失活，但Xist RNA的功能尚未被完全認知［2］。在動物克隆胚胎發(fā)育中，許多的基因表達異常［3］，Xist也是這些異常表達基因之一［4］。前期研究表明，利用Xist基因缺陷型供體細胞用于克隆試驗，可成功將小鼠克隆效率提高8-9倍［5］。目前，尚未有研究抑制牛供體細胞Xist基因表達水平對牛體細胞核移植影響的研究。

TALER（TALE-REPRESSOR）技術是利用TALE（Transcription activator-like effector）蛋白特異性識別DNA序列的特性將轉錄抑制因子REPRESSOR結合到目標基因上進而抑制基因轉錄的技術［6-8］。TALE蛋白的DNA結合結構域由33-35個氨基酸的重復序列組成，每一個重復序列的第12、13是兩個不同的氨基酸，可以識別不同的堿基。根據(jù)目標基因將若干個重復序列順序組裝就可以對目標基因進行特異性識別。REPRESSOR 是來自于Krüppel家族鋅指蛋白中廣泛存在且十分保守的KRAB（Krüppelassociated box）結構域，由75個氨基酸構成，具有轉錄抑制功能［9，10］。將人工組裝的TALE蛋白與轉錄抑制結構域KRAB融合，即構成TALER載體［11］，實現(xiàn)對目標基因的轉錄抑制。

本研究利用特異性識別牛Xist基因的TELER載體，研究抑制牛成纖維細胞Xist基因表達效果，并進一步探討了對牛克隆胚胎早期發(fā)育的影響，以期為進一步提高牛體細胞克隆效率提供基礎技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞總RNA提取試劑盒（74104）、PCR試劑盒（200403）、基因組DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，反轉錄試劑盒（A3500）購自Promega公司，細胞轉染試劑盒（VPI-1002）購自LONZA公司。強力霉素（Dox）誘導型Xist mCherry-TALER載體、rtTa載體、pBase載體由英國Sanger研究所劉鵬濤實驗室提供。胎牛成纖維細胞為本實驗室建立儲存；牛卵巢由呼和浩特屠宰廠提供。

1.2 方法

1.2.1 PCR試驗 分別用基因組DNA提取試劑盒與總RNA提取試劑盒提取牛胎兒成纖維細胞的基因組DNA、總RNA，并將總RNA反轉錄為cDNA，作為PCR反應的模板。根據(jù)NCBI中牛Xist cDNA序列（NR_001464.2），應用primer5.0設計Xist引物、SRY引物，并由Invitrogen公司合成，引物序列及擴增片段大小見表1。根據(jù)PCR試劑盒說明書配制反應體系，采用以下條件擴增：94℃，4 min；94℃，30 s；60-68℃，30 s；72℃，30 s；30個 循 環(huán)；72℃，5 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa）配制反應體系，以β-actin為內(nèi)參用Real-time PCR儀（CFX96，BIO-RAD）檢測Xist基因表達量。選取相同來源、相同代次的雌性胎牛成纖維細胞作為對照，所得數(shù)據(jù)用2（-ΔΔCt）進行計算。

表1 PCR引物

1.2.2 胎牛成纖維細胞電轉染 培養(yǎng)雌性胎牛成纖維細胞至匯合度80%-90%時收集細胞并進行計數(shù)。取1×106個細胞，加入100 μL電轉液重懸，向細胞懸液中加入5 μg Xist mCherry-TALER、5 μg rtTa、5 μg pBase載體，將細胞懸液轉入電轉杯中，采用電轉儀（amaza Nucleofector II，LONZA）U023程序電轉。電轉后將電轉杯中的細胞懸液接入10 cm皿中，置于38.5℃，5% CO2培養(yǎng)箱。

1.2.3 流式細胞儀分選細胞 將轉染后5 d的胎牛成纖維細胞（細胞匯合度達80%-90%）用0.25%胰酶消化細胞，將細胞濃度稀釋為1×106個/mL。利用BD FACS Aria II流式細胞儀分選表達紅色熒光蛋白的細胞，提取RNA，反轉錄擴增cDNA，進行Xist表達量檢測。

1.2.4 體細胞核移植 核移植操作前，將培養(yǎng)3-4d匯合度達100%的供體細胞——胎牛成纖維細胞及轉染后胎牛成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，最后用100 μL操作液重懸，制備成單細胞懸液，置于4℃ 備用。屠宰場取牛卵巢，置于25℃生理鹽水，3 h內(nèi)帶回實驗室。生理鹽水洗滌3遍卵巢，用10 mL注射器吸取2-6 mm卵泡，顯微鏡下揀A級、B級卵丘卵母細胞復合體（COCs）用于核移植試驗。待卵母細胞成熟17 h后，采用盲吸法去核，再將供體細胞注入卵母細胞。細胞核移植后的重構胚在融合液中平衡2 min后進行電融合，融合后洗凈培養(yǎng)15 min后觀察融合情況。將融合的重構胚胎用5 μmol/L離子霉素處理5 min，2 mmol/L 6-DMAP聯(lián)合激活處理4 h，然后將重構胚置于覆蓋石蠟油的SOF培養(yǎng)液的4孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)氣相條件一種是置于38.5℃、5%CO2飽和濕度，48 h后觀察發(fā)育情況。

2 結果

2.1 胎牛成纖維細胞性別鑒定

分別以荷斯坦種公牛（M）與荷斯坦高產(chǎn)母牛（F）的DNA為對照，擴增兩個胎牛成纖維細胞（F1，F(xiàn)2）的SRY基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示，胎牛成纖維細胞F1有，而F2沒有SRY基因擴增（圖1），因此胎牛成纖維細胞F1為雄性，F(xiàn)2為雌性。

圖1 性別鑒定結果

2.2 胎牛成纖維細胞轉染結果

Xist mCherry-TALER、rtTA與pBase載體共轉染雌性胎牛成纖維細胞F2后，培養(yǎng)液加入Dox。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉染后20 h細胞陽性率（紅色熒光細胞，顏色標識見電子版）在90%以上，培養(yǎng)5 d后陽性細胞比例逐漸下降（圖2）。

圖2 細胞轉染后20 h結果

2.3 流式細胞分選

將轉染后培養(yǎng)至5 d的細胞用胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)液重懸，使細胞密度為1×106個/mL，利用流式細胞儀進行檢測及篩選。先對對照細胞進行篩選確定陰性細胞區(qū)域，再對轉染后的細胞進行篩選，結果陽性率為18.4%（圖3）。經(jīng)分選得到約5×105個陽性細胞，用于RNA提取，進行后續(xù)試驗。

圖3 流式細胞儀進行陽性率檢測轉染后培養(yǎng)5 d的細胞

2.4 Xist表達抑制效果檢測

用SYBR Premix Ex TaqTM擴增反轉錄得到的cDNA模板，β-actin為內(nèi)參、未轉染細胞為對照，檢測Xist 表達量。試驗重復3次，結果見表2，圖4。

表2 Xist 表達抑制效果檢測結果

圖4 Xist 相對表達量檢測

2.5 體細胞核移植獲得早期胚胎效率比較

選取表達紅色熒光的細胞用于體細胞核移植試驗，用正常胎牛成纖維細胞做對照。試驗組和對照組的卵裂率、8細胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為78.8% vs 75.1%、54.4%及50.6%、 12.3% vs 27.8%、26.6% vs 0。

3 討論

本試驗使用特異性抑制Xist基因的TALER載體轉染雌性胎牛成纖維細胞，并通過流式細胞儀進行分選獲得陽性細胞后檢測Xist基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)Xist TALER 載體可以成功轉染胎牛成纖維細胞并能顯著下調(diào)Xist基因表達量。Cong等［12］將識別多能性基因Sox2的TALE分別與KRAB和SID（一種轉錄抑制因子）融合構建TELER載體，轉染細胞后發(fā)現(xiàn)，TELER載體可以顯著下調(diào)Sox2 的表達。Garg等［7］將識別CMV啟動子的TELER載體與CMV-CFP載體共轉染細胞，發(fā)現(xiàn)TELER可以顯著抑制CFP表達，同時與RNA干擾試驗比較發(fā)現(xiàn)TELER的抑制效率比RNA干擾高5倍以上。綜上所述，本試驗所使用Xist TALER載體適合在牛體細胞水平抑制Xist基因表達，能夠用于進一步研究。

表3 體細胞核移植獲得早期胚胎效率比較

圖5 發(fā)育到4細胞階段的克隆胚胎

圖6 發(fā)育到8細胞階段的克隆胚胎

Xist基因主要參與雌性動物的X染色體失活［2］，但Xist RNA的功能還需進一步深入研究。Matoba等［13］用siRNA方法降低植入前的早期胚胎Xist RNA，盡管Xist RNA下調(diào)的效果是暫時的，但可以提高重構胚胎的早期發(fā)育能力；但在胚胎植入后期仍有負面影響。有研究將Xist 的干擾序列片段整合到?；蚪M中，在 8 細胞時期加入誘導劑四環(huán)素誘導干擾片段的表達，成功糾正雄性動物某些異常表達的基因［14］。Dean等［15］發(fā)現(xiàn)，牛體外受精胚胎從受精卵至8細胞，甲基化程度逐步下降，到16細胞時又開始再甲基化?？寺∨咛ピ趩渭毎麜r期甲基化程度下降，但之后的發(fā)育并未進一步去甲基化，而是提前開始甲基化?？寺∩］嘏唠A段卵裂球核高度甲基化，程度和供核細胞胎牛成纖維細胞相同。本試驗選取陽性的轉染細胞作為核供體進行SCNT試驗，與對照組相比，桑葚胚和囊胚發(fā)育率都顯著降低，可能與DNA非正常甲基化相關。但是關于確切的牛X染色體基因表達失活時期及其與DNA甲基化、組蛋白修飾等的關系，目前還沒有確定［16］。

前期研究顯示經(jīng)過藥物篩選的轉基因細胞做核供體會降低哺乳動物克隆的效率［17，18］，本試驗未使用G418藥物篩選轉染陽性的胎牛成纖維細胞，排除了藥物篩選對供體細胞以及對早期克隆胚胎的不良影響。本試驗結果表明，經(jīng)Xist TALER轉染獲得的Xist被抑制胎牛成纖維細胞作為供體時存在影響克隆早期胚胎發(fā)育的因素，其深層機理有待進一步研究。在今后的研究中，進一步探討抑制Xist基因表達對克隆胚胎的DNA甲基化、組蛋白修飾等的影響及其與早期克隆胚胎發(fā)育的相關性，為提高牛體細胞克隆效率和產(chǎn)業(yè)化應用提供理論和技術支撐。

4 結論

本研究使用mCherry-TALER載體轉染胎牛成纖維細胞，并通過紅色熒光儀進行流式分選。分選細胞中Xist的表達量被mCherry-TALER載體極顯著地抑制。后續(xù)的核移植試驗表明，抑制Xist基因表達，可以克隆胚8-細胞發(fā)育率，但是降低桑椹胚和囊胚發(fā)育率。由Xist抑制引起的克隆胚發(fā)育及相關表觀遺傳學修飾變化還需進一步研究。

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（責任編輯 李楠）

《中國食物與營養(yǎng)》2015年征稿征訂啟事

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Effect of Xist Gene Repression on Early Development of Bovine SCNT Embryos

Liu Liming1Sun Wei2Zhang Jindun1Zhao Lixia2Li Shuyu2Wang Biao1Chen Yanglin1Hu Shuxiang2Wu Baojiang2Li Xihe1，2
（1.Research Center for Animal Genetic Resources of Mongolia Plateau，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2. Inner Mongolia Saikexing Reproductive Biotechnology Co.，Ltd.，Hohhot 011517）

Xist is an X-inactivation related gene that produces a noncoding RNA， and it is one of the first imprinted genes to be expressed in the early embryo with expression beginning at zygotic genome activation. This experiment aimed at investigating Xist repression in fetal bovine fibroblast by TALE-REPRESSOR（TALER）which contains mCherry as reporter， and the impact of Xist repression on early development of cloned cattle embryos using the transfected cells as nuclei donor. The results showed TALER repressed Xist gene expression by 93.85% in fluorescence-activated sorted cells compared with wild type fibroblast， indicating the TALER vector designed in this experiment effectively suppressed expression of Xist. The mCherry positive cells were selected for somatic cell nuclear transfer（SCNT）. The 2-cell， 8-cell， morula and blastocyst rates of suppressed group vs. control group were 78.8% vs 75.1%（P＞0.05）， 54.4% vs. 50.6%（P＞0.05）， 12.3% vs. 27.8%（P＜0.01）and 0 vs. 26.6%（P＜0.01）， respectively. These results indicated that TALER vectors effectively inhibited Xist gene expression in female fetal bovine fibroblast. Suppression of Xist gene promotes the 2-8 cell embryonic development of cloned embryo， however， development of morula/blastocyst decreased significantly. Therefore， the mechanism by which Xist gene expression regulates early embryonic development of cloned embryos needs further investigation.

Xist gene；TALER vector；fetal bovine fibroblast；early embryonic development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.033

2014-05-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)家畜性控精液技術熟化與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)（20111701）

劉黎明，男，碩士，研究方向：動物生殖生物學與生物技術；E-mail：nmgdxllm@163.com

李喜和，男，博士，教授，研究方向：動物生殖生物學與生物技術；E-mail：Lixh@life.imu.edu.cn