趙慶亮 楊素芳 梁田 張殿卿 楊霞 盛金良

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 人獸共患病實驗室，石河子 832003）

嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的生物信息學(xué)分析及表達鑒定

趙慶亮 楊素芳 梁田 張殿卿 楊霞 盛金良

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 人獸共患病實驗室，石河子 832003）

分析預(yù)測嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的抗原性，對嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4蛋白采用生物信息學(xué)對其進行分析二級結(jié)構(gòu)，親水性，疏水性，B細(xì)胞線性表位；根據(jù)分析的優(yōu)勢抗原表位區(qū)，進行基因合成并亞克隆至pET32a表達載體，在大腸埃希菌中獲得重組蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示msp4蛋白由283個氨基酸組成，分子量為29.8 ku，理論等電點為6.05，不穩(wěn)定系數(shù)為32.79，總平均疏水性為0.063；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測msp4蛋白主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主；B細(xì)胞表位預(yù)測msp4蛋白有14個線性表位；根據(jù)分析的結(jié)果選取msp4蛋白親水性高的膜外區(qū)的28-158位序列克隆至pET32a進行原核表達，在34 ku出有目的蛋白的表達。成功對嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4蛋白原核表達及純化，為無形體病血清學(xué)檢測方法的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

嗜吞噬細(xì)胞無形體；生物信息學(xué)分析；msp4蛋白；原核表達

人粒細(xì)胞無形體?。╤uman granulocytic anaplasmosis，HGA）是由嗜吞噬細(xì)胞無形體經(jīng)蜱傳播一種新發(fā)的人獸共患病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、不適、頭痛及肌痛等，并伴有白細(xì)胞和血小板減少，轉(zhuǎn)氨酶升高和多器官功能損傷。1994年美國首次報道該病例后［1］，2006年我國首次在安徽省發(fā)現(xiàn)人粒細(xì)胞無形體病例［2］。該病臨床癥狀與某些病毒性疾病相似，容易誤診，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［3］。

嗜吞噬細(xì)胞無形體（Anaplasma phagocytophilum，APH）屬立克次氏體目無形體科無形體屬，是專性的胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，直徑約為0.2-2 μm，中性粒細(xì)胞是它的特異性宿主細(xì)胞［4］。嗜吞噬細(xì)胞無形體的傳播媒介在我國主要為硬蜱，宿主主要有白足鼠、山羊、綿羊等家畜動物［5，6］。

目前診斷該病原的方法主要依據(jù)PCR檢測和IFA（間接免疫熒光），病原分離等方法，但是這些方法要求試驗條件高，不易操作，成本高等缺點。目前通過生物信息學(xué)的方法分析嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4基因，獲取其優(yōu)勢抗原表位區(qū)，進行原核表達和純化，經(jīng)WB驗證蛋白的免疫原性，可作為候選診斷抗原，為研究形體病的血清學(xué)檢測方法的建立提供生物材料。

1 方法與材料

1.1 材料

嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的氨基酸序列來源于GenBank，序列登錄號為AFD54597.1，E. coil DH5α和BL21（DE3）菌株及pET32a載體均由本實驗室保存。瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，T4 連接酶、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI網(wǎng)站（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank上查找嗜吞噬細(xì)胞無形體（NY18 株）MSP4膜蛋白完整的基因序列（JQ522935.1）和氨基酸序列（AFD54597.1）；利用ExPASy蛋白分析專家（http：//www.Expasy.org/tools）服務(wù)器中的ProtParam程序預(yù)測蛋白的基本組成，等電點、吸光系數(shù)、脂肪族系數(shù)、親水系數(shù)等；利用ExPASy蛋白分析專家服務(wù)器中的SOPMA程序預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用在線軟件TMHMM 2.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)；利用抗原表位分析軟件（Immune Epitope Database Analysis Resource）（http：//tools.immuneepitope.org/ main/html/bcell_tools.html） 的Parker Hydrophilicity， Bepipred Linear Epitope方法預(yù)測蛋白親水性和氨基酸水平的B細(xì)胞表位。

1.2.2 原核表達載體構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，選取msp4蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)，進行人工基因合成，在兩端分別添加限制性酶EcoRⅠ和XhoⅠ位點。用限制性酶切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切目的基因，同法酶切pET32a載體。用瓊脂糖膠回收試劑盒將酶切的目的基因和載體回收，然后16℃過夜連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐抗生素抗性平板，挑取抗性平板上的單個細(xì)菌進行液體培養(yǎng)之后，進行菌液PCR驗證，PCR驗證的陽性克隆菌進行37℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。

1.2.3 原核表達及純化 將酶切鑒定的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化表達菌進行培養(yǎng)，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.45-0.6，在不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L）誘導(dǎo)劑IPTG，不同時間（2、6、6和8 h）條件下誘導(dǎo)pET32a-msp4重組蛋白的表達，于誘導(dǎo)前收菌1 mL，誘導(dǎo)的不同時間段收菌1 mL，離心菌液進行SDSPAGE分析。此外，另取100 mL經(jīng)誘導(dǎo)6 h的菌液，收集菌體沉淀，用5 mL的PBS重懸菌體，超聲破碎菌體（工作循環(huán)30次，超聲10 s，間隔10 s），然后將裂解液離心，分別收集上清和沉淀（包涵體）進行SDS-PAGE分析。鑒別目的蛋白是以可溶性形式存在于上清液中還是以包涵體形式存在于沉淀中。對以包涵體形式表達的重組蛋白用8 mol/L濃度尿素進行變性處理，包涵體溶解后采用鎳離子親和層析法純化，將純化的蛋白利用透析袋復(fù)性，對復(fù)性蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組msp4蛋白的多抗制備及Western blotting鑒定 取純化的msp4重組蛋白200 μg與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后免疫小白鼠，2周后100 μg的蛋白與等量的弗式不完全佐劑混合進行加強免疫，末次加強免疫劑量為50 μg/只，第3次免疫10 d后心臟采血，分離血清，進行Western blotting 鑒定。純化的msp4重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，將免疫過小白鼠分離的血清作為一抗（1∶100）作用1 h，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠（1∶5 000）作用1 h，TBST緩沖液洗滌3次，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液中顯色3-5 min后加去離子水終止。

2 結(jié)果

2.1 msp4的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 ProtParam工具分析結(jié)果 根據(jù)ProtParam軟件預(yù)測表面msp4基因編碼的蛋白分子式為：C1333H2035N347O413S10，分子量為29.8 ku，理論等電點為6.05；msp4蛋白的組成含量最多的氨基酸是：Ser（13.5%），Ala（11%），Gly（9.6%），Val（8.2%）；Leu（6.0%），Asn（5.7%），Tyr（5.7%）；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為24，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為21；不穩(wěn)定系數(shù)為32.79，為穩(wěn)定蛋白（標(biāo)準(zhǔn)40以下的為穩(wěn)定蛋白）；預(yù)測的半衰期30 h（體外哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞），＞20 h（酵母菌體內(nèi)），＞10 h（大腸桿菌體內(nèi)）；脂肪系數(shù)平均為78.90，總平均疏水性為0.063。

2.1.2 SOPMA預(yù)測msp4蛋白的二級結(jié)構(gòu) 利用ExPASy蛋白分析專家服務(wù)器中的SOPMA程序?qū)sp4蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。預(yù)測msp4蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括282個氨基酸，其中129個氨基酸（占45.74%）可能形成無規(guī)卷曲（c），75個氨基酸（占26.60%）可能形成延伸鏈（e），57個氨基酸（占20.21%）可能形成α-螺旋（h），21個氨基酸（占7.45%）可能形成β-轉(zhuǎn)角（t）。無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)主要位于氨基酸的第10-12、30-40、52-61、87-99、154-161、242-260區(qū)段；α-螺旋結(jié)構(gòu)主要位于氨基酸的第1-8、13-20、126-135、205-212區(qū)段，延伸鏈結(jié)構(gòu)在氨基酸中的分布均一。由以上預(yù)測結(jié)果可知該蛋白質(zhì)主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主。

2.1.3 msp4蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果 借用TMHMM 2.0在線軟件預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)（圖1）。從圖1中可看出大約第1-6位氨基酸位于膜內(nèi)的可能性比較大，第30-282位氨基酸位于膜外的可能性比較大，第7-29位氨基酸可能存在跨膜區(qū)。

圖1 TMHMM2.0預(yù)測msp4蛋白跨膜區(qū)

2.1.4 msp4蛋白的親水性預(yù)測結(jié)果 對msp4蛋白的親水性分析結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示該蛋白包含多個親水性區(qū)域，主要分布在27-43、51-56、64-98、110-145、152-159、217-221、235-238、249-269這個區(qū)段，其中27-43、64-98、135-145區(qū)段親水性較高。

圖2 msp4蛋白的親水性分析

2.1.5 msp4蛋白的抗原表位分析 根據(jù)蛋白表位分析中的B細(xì)胞線性表位分析模塊分析msp4蛋白結(jié)果見圖3，msp4蛋白包含有14個線性表位，其中以 28-42、50-59、65-77、87-100、111-118、135、137-138、140-143、154-158、188-190、245-251、253-257、259-263區(qū)段是msp4蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段，明確msp4蛋白的線性表位區(qū)段，為獲得特異性的抗原區(qū)段提供了較好的依據(jù)。

圖3 msp4蛋白的B細(xì)胞線性表位預(yù)測

2.2 原核表達載體的構(gòu)建

選取msp4蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)段第28-158位氨基酸作為目的表達基因進行人工合成，將目的基因連到pET32a原核表達載體，經(jīng)雙酶切驗證目的基因插入到表達載體，測序結(jié)果表明，合成的基因序列正確無誤的插入到pET32a原核表達載體

2.3 pET32a-msp4原核表達和純化

在37℃、IPTG濃度為1.0 mmol/L誘導(dǎo)時間為6 h時，蛋白表達條件最佳（圖4）。將誘導(dǎo)收集菌液超聲破碎，分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示目的蛋白大部分都是以包涵體的形式存在，包涵體經(jīng)尿素變性、鎳離子親和層析法純化及透析復(fù)性后進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示獲得了分子量為34 ku的msp4重組蛋白。

圖4 msp4重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析

2.4 重組msp4蛋白多抗效價測定和Western blotting鑒定

以純化的重組msp4蛋白為包被抗原，利用間接ELISA對純化后的多抗進行了效價測定，以多抗孔的OD值對陰性對照孔的OD值的比值（P/N）大于2.1時，多抗的最高稀釋度為多抗的效價。結(jié)果表明，純化后的多抗效價為1∶51200。

取純化的重組msp4蛋白做SDS-PAGE，然后將純化的多抗作為一抗進行Western blotting檢測。結(jié)果（圖5）表明多抗能與重組msp4蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖5 Western blotting分析結(jié)果

3 討論

嗜吞噬細(xì)胞無形體作為一種新發(fā)的人獸共患病原體，可以引起反芻動物的蜱咬熱［7］、馬邊蟲?。?］、HGA［9］。自1994年美國首次報道人粒細(xì)胞無形體病例，嗜吞噬細(xì)胞無形體引起人粒細(xì)胞無形體病的報道日益增多，2010年Huang等［10］報道HGA是美國第二大的蜱傳播的疾病。美國從2000年至2010年人粒細(xì)胞無形體病的發(fā)病例由348例增加至1 761例，平均每百萬人1.4個病例上升至每百萬6.1個病例。分子生物學(xué)及人群血清學(xué)檢測證實該病原體在中國及周邊國家存在，2006年天津地區(qū)的高危人群人粒細(xì)胞無形體病的陽性率為8.8%［11］，2009年山東沂源地區(qū)正常人群人粒細(xì)胞無形體IgG抗體陽性率為26.7%［12］，2011年張麗娟等［13］報道新疆伊犁地區(qū)人無形體IgG抗體陽性率為5.3%，2013年劉志杰等［14］報道甘肅地區(qū)的綿羊的PCR檢出率為42.9%，山羊為38.5%；說明我國存在自然感染的嗜吞噬細(xì)胞無形體，可能會給人們的健康安全帶來危害。

目前嗜吞噬細(xì)胞無形體診斷的主要方法有：外周血涂片鏡檢中性粒細(xì)胞內(nèi)可見桑葚狀包涵體；急性期特異性IgM陽性；急性期及恢復(fù)期雙份血清免疫熒光法（IFA）檢測到特異抗體（IgG）滴度升高或降低4倍及以上；急性期全血或血細(xì)胞標(biāo)本PCR檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性核酸陽性，且序列分析證實與嗜吞噬細(xì)胞無形體的同源性達99%以上等，其中以IFA和PCR為重要的檢測手段。國內(nèi)關(guān)于無形體病的血清學(xué)檢測的方法研究較少，目前國內(nèi)的主要檢測使用的是美國FOCUS生產(chǎn)的無形體IgG免疫熒光試劑盒，缺少于成品檢測試劑盒，這就對國內(nèi)的嗜吞噬細(xì)胞無形體的快速診斷提出了挑戰(zhàn)。Zhi等［15］對嗜吞噬細(xì)胞無形體44 kD蛋白成功實現(xiàn)了原核重組表達，并對重組表達產(chǎn)物進行了血清學(xué)診斷評價，結(jié)果顯示用重組蛋白作為抗原進行診斷特異性和一致性更明顯，而且通過原核表達制備重組蛋白遠(yuǎn)比培養(yǎng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染、收集菌體、純化抗原的途徑簡單得多。Msp4蛋白是嗜吞噬細(xì)胞無形體的一個主要表面蛋白，本試驗利用生物信息的方法對msp4蛋白進行分析，通過分析獲得msp4優(yōu)勢抗原區(qū)段，進行原核表達，并進行蛋白純化。可以將重組純化的msp4蛋白作為血清學(xué)檢測的備選材料，為無形體的血清學(xué)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4基因含有完整的開放閱讀框（846 bp），編碼283個氨基酸，分子量為29.8 ku，理論等電點為6.05；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測msp4蛋白主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主；B細(xì)胞表位預(yù)測msp4蛋白有14個線性表位。根據(jù)分析的結(jié)果選取msp4蛋白親水性高的膜外區(qū)的28-158位序列克隆至pET32a進行原核表達，在34 ku出有目的蛋白的表達。

［1］ Chen SM， Dumler JS， et al. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease［J］. Journal of Clinical Microbiology， 1994， 32（3）：589-595.

［2］ Zhang L， liu Y， et al. Nosocomial transmission of human granulocyitc anaplasmosis in China［J］. JAMA， 2008， 300（19）：2263-2270.

［3］Dumler JS， Choi KS， Garcia-Garcia JC， et al. Human granulocytic anaplasmosis and Anaplasma phagocytophilum［J］. Emerging Infectious Diseases， 2005， 11（12）：1828-1834.

［4］Dumler JS， Barbet AF， Bekker CP， et al. Recorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales：unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma， Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia，descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila［J］. International Journal of Systeatic and Evolutionary Mcirobiology， 2001， 51（6）：2145-2165.

［5］ Dumler JS， Choi KS， Garcia-Garcia JC， et al. Human ganulocytic anaplaosis and anaplama phagocytophilum［J］. Emerging Infectious Disease， 2005， 11（12）：1828-1834.

［6］ Ijdo JW， Meek JI， Cartter ML， et al. The emergence of another tickborne infection in the 12-town area around Lyme， Connecticut：huamn granulocytic ehrlichiosis［J］.Journal of Infectious Diseases，2000， 181（4）：1388-1393.

［7］ Nieder M， Silaghi C， Hamel D， et al. Tick-borne fever caused by anaplasma phagocytophilum in Germany：first laboratory confirmed case in dairy cattle herd［J］. Tierarzliche Praxis. Ausgabe G，Grosstiere/Nutziere， 2012， 40（2）：101-106.

［8］ Silaghi C， Liebisch G， Pfister K. Genetic variants of Anaplasma phagocytophilum from 14 equine granulocytic anaplasmosis cases［J］. Parasites & Vectors， 2011， 4（1）：1-9.

［9］ Bakkern JS， Dumler S. Human granulocytic anaplasmosis［J］. Infectious Disease Clinics of North America， 2008， 22（3）：433-448.

［10］ Huang B， Troese MJ， et al. Aaaplasma phagocytophilum APH_1387 is expressed throughout bacterial intracellular development and localizes to the pathogen-occupied vacuolar membrane［J］. Infection and Immunity， 2010， 78（5）：1864-1873.

［11］ Zhang L， Shan A， Mathew B， et al. Rickettsial seroepidemiology among farm workers， Tianjin， People’s Republic of China［J］. Emerging Infectius Diseases， 2008， 14（6）：938-940.

［12］張麗娟， 崔峰， 王玲， 等.山東省沂源縣無形體病實驗室調(diào)查分析［J］.傳染病信息， 2009， 22（1）：21-25.

［13］范德生， 禹惠蘭， 吳保新， 等. 新疆伊犁地區(qū)無形體流行病學(xué)調(diào)查及病原序列分析［J］. 中國人獸共患病學(xué)報， 2011， 27（4）：327-330.

［14］ Yang J， Liu Z， Guan G， et al. Prevalence of Anaplasma phagocytophilum in ruminants， rodents and ticks in Gansu， north- western China［J］. Journal of Medical Microbiology， 2013， 62（2）：254-258.

［15］Zhi N， Ohashi N， Rikihisa Y， et al. Cloning and expression of the 44-kilodalton major outer membrane protein gene of the human granulocytic ehrlichiosis agent and application of the recombinant protein to serodiagnosis［J］. Journal of Clinical Microbiology，1998， 36（6）：1666-1673.

（責(zé)任編輯 李楠）

Expression and Bioinformatics Analysis of the msp4 Protein of Anaplasma Phagocytophilum

Zhao Qingliang Yang Sufang Liang Tian Zhang Dianqing Yang Xia Sheng Jinliang
（College of Animal Science and Technology of Shihezi University，Shihezi 832003）

The purpose of this study was to analysis the antigenicity of msp4 protein of anaplamsa phagocytophilum. The informatics analysis was used to predict and analyze the important parameters of the msp4 protein， such as the physical and chemical properties， protein secondary structure， and its hydrophilicity， hydrophicity， bepipred linear epitope. According to the advantage epitope， we selected the high hydrophilic region of protein membrane outside domains， and cloned to pET32a prokaryotic expression vector. The bioinformatics analysis revealed that the msp4 protein was composed of 283 amino acids， and that its isoelectric point was 6.52. The msp4 protein was an stable hydropathilic protein（the instablility coefficient was 32.79， the grand average of hydropathicity was 0.063）. The secondary structure of the msp4 protein was mainly composed of random coils， extended strands， and alpha helixes. B cell epitope predicted that the msp4 protein has 14 linear epitopes. From the result of bioinformatics analysis， we selected the the 28-158 aa of the high hydrophilic region of protein membrane outside domains， and cloned to pET32a prokaryotic expression vector， the msp4 protein was successfully expressed and purified. The expressed and purified the recombinant msp4 protein lays a material foundation for the establishment of serological methods for anaplasma phaagocytophilum detection.

anaplasma phagocytophilum；bioinformatics analysis；msp4 protein；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.034

2014-02-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃資助（2010CB53020X）

趙慶亮，男，碩士研究生，研究方向：動物疾病病理；E-mail：zhaoqingliang2009@126.com

盛金良，副教授，E-mai：sjlshz@126.com