孔文剛黃錠羅劍周琳婷陳則劉旭平譚文松鄧獻存，3

（1.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海生物制品研究所有限責任公司，上海200052；3.浙江海正藥業(yè)股份有限公司，杭州 311404）

細胞密度和營養(yǎng)供給對H1N1流感病毒產(chǎn)率的影響

孔文剛1黃錠1羅劍2周琳婷2陳則2劉旭平1譚文松1鄧獻存1，3

（1.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海生物制品研究所有限責任公司，上海200052；3.浙江海正藥業(yè)股份有限公司，杭州 311404）

探究細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒過程中，高細胞密度引起低單位細胞病毒產(chǎn)率（Svy）的原因及找到解決方法。通過增加微載體濃度以及換液操作獲得較高的細胞密度；考察了感染時細胞密度（CCI）和病毒感染用維持培養(yǎng)基對病毒產(chǎn)量和單位細胞病毒產(chǎn)率的影響。在12.6 g/L微載體培養(yǎng)過程中，通過換液操作，可獲得高細胞密度，達到1.47×107cells/mL。在CCI為1×107cells/mL條件時，選擇合適的維持培養(yǎng)基，其Svy最高達到5.14×103virions/cell，比同等條件下用DMEM維持培養(yǎng)基的Svy值提高了近一倍。高密度培養(yǎng)MDCK細胞生產(chǎn)流感病毒時，充分考慮不同階段的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)需求，可以提高細胞密度和單位細胞病毒產(chǎn)率，進而提高流感病毒的產(chǎn)量。該研究結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)流感病毒疫苗提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

高密度培養(yǎng)；MDCK；流感；病毒

流感病毒（Influenza virus）具有高傳染性，極易發(fā)生流行，疫苗是應對流感流行最好的方法，有效的流感疫苗是預防和控制流感大流行的基石。由于傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)流感病毒存在產(chǎn)量低，批次間差異大，質(zhì)量不穩(wěn)定等問題［1］，1995年WHO建議各流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)使用哺乳動物細胞培養(yǎng)流感病毒來替代雞胚培養(yǎng)以快速制備流感疫苗，使其抗原性更接近自然流行株［2，3］。其中，連續(xù)細胞系犬腎細胞（MDCK）已被用于生產(chǎn)流感疫苗［4-7］。

利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒的過程中，提高病毒感染時的細胞密度（CCI）和單位細胞病毒產(chǎn)率（Svy）可以提高病毒的總產(chǎn)量［8，9］。因此，工業(yè)化生產(chǎn)疫苗過程中，為了獲得更多的流感病毒液，往往追求較高的細胞密度。通常情況下通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，如提高培養(yǎng)過程中微載體的濃度［2，3］，細胞生長后期更換新鮮培養(yǎng)液，都可以獲得較高的細胞密度。但高細胞密度條件下并不一定能獲得高病毒產(chǎn)量，在細胞密度高的情況下進行接毒，單位細胞病毒產(chǎn)率反而下降，即“高細胞密度低病毒產(chǎn)率”的現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為 “細胞密度效應”［10］。目前，大多數(shù)學者認為“細胞密度效應”可能是由于培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物（如谷氨酰胺，葡萄糖等）的不足或代謝副產(chǎn)物（如乳酸、氨等）累積引起的。為此，通過灌注，多次流加的方式可以解除營養(yǎng)物不足或代謝副產(chǎn)物累積的限制，消除細胞密度效應，使得單位細胞病毒產(chǎn)率得到提高［3］。但同時，這些操作模式都需要特殊的細胞截留裝置以及合適的補料控制策略，增加了生產(chǎn)的技術(shù)難度和培養(yǎng)污染的機會，提升了生產(chǎn)工藝的復雜性，這些都不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)流感疫苗［11，12］。因此，如果能通過合適的營養(yǎng)供給，采用簡單的批式培養(yǎng)方式就能解除細胞密度效應，達到較高的病毒產(chǎn)率，具有顯著的創(chuàng)新和應用價值。

本研究通過研究微載體濃度及細胞培養(yǎng)過程中更換新鮮培養(yǎng)基對細胞生長代謝的影響，以期獲得較高的細胞密度。進而，研究高細胞密度和病毒復制階段營養(yǎng)供給對流感病毒產(chǎn)量和單位細胞產(chǎn)病毒效率的影響，選擇合適的營養(yǎng)供給策略，提高高細胞密度條件下的病毒產(chǎn)量，為高密度培養(yǎng)MDCK細胞大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)流感病毒工藝開發(fā)工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和病毒株 犬腎上皮連續(xù)細胞系MDCK（Madin-Daby canine kidney cells）細胞，購自ATCC。病毒株：甲型流感病毒株A/PR8/34（H1N1）來源于上海生物制品研究所有限責任公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM（Gibco公司）補加3700 mg/L碳酸氫鈉（Amresco公司）和和10%（V/V）胎牛血清FBS（Fatal Bovine Serum，Gibco公司），滲透壓為300 mOsm/kg。

病毒感染用維持培養(yǎng)基：A：1.5×（DMEM/F12），滲透壓為472 mOsm/kg；B：1.5×DMEM，滲透壓443 mOsm/kg；C：DMEM，補加葡萄糖至45 mmol/L，谷氨酰胺至15 mmol/L，滲透壓為330 mOsm/kg；D：DMEM，補加葡萄糖至50 mmol/L，谷氨酰胺至14 mmol/L，氨基酸和維生素的量按F12培養(yǎng)基的5倍量添加，滲透壓為372 mOsm/kg。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 MDCK細胞攪拌瓶培養(yǎng)：將消化后的細胞接種至裝有微載體的無菌攪拌瓶，接種密度為5×105-6×105cells/mL，微載體用量為3 g/L或12.6 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速為60 r/min，工作體積為150 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h取樣計數(shù)，取上清液測營養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物濃度。

MDCK細胞換液培養(yǎng)：基本操作與MDCK細胞攪拌瓶培養(yǎng)相同，每24 h去除舊的培養(yǎng)基，并加入等體積新鮮培養(yǎng)基。

不同CCI條件下流感病毒的生產(chǎn)：基本操作與MDCK細胞攪拌瓶培養(yǎng)相同，細胞培養(yǎng)至72 h時調(diào)整細胞密度至1×106，5×106，10×106cells/mL，去除舊培養(yǎng)基，換為等體積病毒染維持培養(yǎng)基，以MOI為0.01接入病毒種子液進行培養(yǎng)。

1.2.2 細胞計數(shù) 以結(jié)晶紫染色，用血球計數(shù)板計數(shù)，每個樣重復3次，取平均值。

1.2.3 葡萄糖、乳酸和氨濃度的測定 葡萄糖濃度采用葡萄糖試劑盒（購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所）測定。乳酸濃度用乳酸測定試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）測定。氨濃度采用尿素氮試劑盒（購自上海申索試劑有限公司）測定，操作按使用說明書進行。

1.2.4 HA的檢測方法 采用 HA血凝效價試驗測定。首先將病毒懸液在第一個孔中與PBS等量混合，再依次半數(shù)倍比稀釋至后續(xù)孔中；分別加入0.5%（V/V）的雞血紅細胞懸液進行震蕩混勻，約30 min后觀察結(jié)果，計算病毒HA血凝效價。單位細胞病毒產(chǎn)率Svy（virions/cell）的計算方法見文獻［3］。

2 結(jié)果

2.1 微載體濃度和換液操作對MDCK細胞生長的影響

圖1是兩種微載體濃度條件下批式培養(yǎng)和換液培養(yǎng)過程中MDCK的生長曲線。批式培養(yǎng)過程中，在3 g/L，12.6 g/L 兩種微載體濃度條件下，72 h時細胞密度都達到最大值，分別為42.8和51.7×105cells/mL，之后細胞密度下降，進入衰亡期。換液培養(yǎng)過程中，3 g/L條件下，72 h時達到最高細胞密度為52.73×105cells/mL，隨后細胞數(shù)稍有下降，144 h時細胞密度為37.85×105cells/mL。而在12.6 g/L條件下，96h時細胞達到最高密度為147.75×105cells/mL，之后細胞稍有下降，144 h時細胞密度為131.35×105cells/mL。與批式培養(yǎng)過程比較，換液操作條件下3 g/L和12.6 g/L微載體濃度條件下最高細胞密度相應提高了23%和185 %。

圖1 3 g/L，12.6 g/L微載體濃度條件下批式培養(yǎng)（A）與換液培養(yǎng)（B）中MDCK細胞的生長曲線

2.2 病毒感染時細胞密度（CCI）對病毒擴增的影響

通過提高微載體濃度和換液操作兩個策略能獲得較高的細胞密度，可達107cells/mL。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步考察了不同CCI條件下MDCK細胞生長、流感病毒生產(chǎn)特征（如圖2，3所示），同時也分析了其對培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物代謝及代謝副產(chǎn)物生成的影響（圖4）。從圖2可以看出，3種CCI條件對接毒后MDCK細胞的生長無明顯影響。在接入病毒后 24 h內(nèi)，3種CCI條件下細胞密度均急劇下降，24 h時已低于接種病毒時密度的50%，接毒72 h后活細胞數(shù)幾乎為零。

圖2 接毒后3種CCI條件下MDCK的生長曲線

由圖3可知，CCI越大，HA的值越大，10×106cells/mL條件下的HA值比1×106cells/mL提高了2.5個單位，較5×106cells/mL只提高了0.5個單位。分析相對應的Svy值可知，CCI越高，Svy越低。10× 106cells/mL條件下的Svy值僅為1×106cells/mL條件下的50 %，5×106cells/mL條件下的72 %。

從圖4可以看出，在CCI為1×106cells/mL條件下，接毒后72 h葡萄糖濃度為10.72 mmol/L，谷氨酰胺為1.19 mmol/L；CCI為5×106cells/mL條件下，接毒后72 h葡萄糖為4.61 mmol/L，谷氨酰胺為0.93 mmol/L；而CCI為10×106cells/mL條件下，接毒后48 h時葡萄糖，谷氨酰胺的濃度分別為0.72，0.05 mmol/L，72 h的濃度都為0 mmol/L。3種CCI下乳酸濃度都在18-29 mmol/L，氨在1.7-2.5 mmol/L范圍內(nèi)波動。以上結(jié)果說明，后期營養(yǎng)供給不足，可能是高CCI條件下，單位細胞病毒產(chǎn)率下降的主要原因。

圖3 不同CCI條件下MDCK細胞中流感病毒最大HA滴度與Svy值

圖4 不同CCI條件下MDCK細胞培養(yǎng)中谷氨酰胺、氨、葡萄糖和乳酸的濃度變化

2.3 病毒感染過程中營養(yǎng)對病毒擴增的影響

隨著CCI的提高，相對應的Svy值不增反降低。如上分析，該現(xiàn)象可能是由培養(yǎng)后期營養(yǎng)供給不足造成的，需要對維持培養(yǎng)基中營養(yǎng)組分進行合理調(diào)整。為此，本研究考察了不同維持培養(yǎng)基對細胞生長和病毒復制擴增的影響（圖5，圖6）。由圖5可知，在A、B、C、D四種條件下，病毒感染后細胞生長特征相似，接毒48 h后細胞密度均低于初始密度的50 %，感染72 h后基本細胞幾乎完全死亡。

測定病毒的最大HA滴度和計算相應的Svy值可以發(fā)現(xiàn)（圖6），A、B、C、D四種條件下最大的HA值分別為9、8.5、10、11 log2（HA/50 μL），相 應 的Svy分 別 為1.29、1.04、2.57、5.14×103virions/cell。A和B組Svy均低于以DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為病毒復制維持液的對照組的Svy值（2.5×103virions/cell）；C組與DMEM對照組Svy值差不多；而D組Svy值則比DMEM對照組提高了將近1倍。至于A和B提高了營養(yǎng)組分卻引起Svy下降的主要原因可能是培養(yǎng)基滲透壓過高引起的。當滲透壓高于400 mOsm/kg［13］時，將會對細胞生長產(chǎn)生不利影響，進而影響病毒的復制擴增。

圖6 四種維持培養(yǎng)基條件下流感病毒最大的Svy值（A）與HA滴度（B）

3 討論

貼壁細胞的最大細胞密度會受到微載體表面積的影響，一般可通過增加微載體的用量來提高細胞最大密度。在批式培養(yǎng)過程中，12.6 g/L微載體上的細胞密度只比3 g/L微載體上的細胞高20%。通過換液操作，3 g/L微載體上的細胞密度提高了23%，而12.6 g/L的細胞密度提高了185 %，達到1.47×107cells/mL，為3 g/L的3.9倍?？梢钥闯鲈诘蜐舛任⑤d體條件下，細胞密度的主要限制因素為微載體的表面積，而在高微載體濃度條件下主要限制因素為營養(yǎng)物的耗竭。由此推斷，在高微載體濃度下加強營養(yǎng)供給能夠獲得較高的細胞密度。

不同CCI條件下接入病毒種子液發(fā)現(xiàn)，HA滴度隨著CCI的提高而提高，但病毒的Svy不升反降，即存在“細胞密度效應”。究其原因，在病毒感染48 h后時，培養(yǎng)液的葡萄糖和谷氨酰胺已經(jīng)耗盡，后期營養(yǎng)物的耗竭很可能是Svy降低的原因。為此，在CCI為1×107cells/mL條件下考察了不同維持培養(yǎng)基對Svy值的影響。結(jié)果表明充足的營養(yǎng)供給可以提高Svy值，D組的營養(yǎng)方式下，Svy值較DMEM對照組提高了近一倍，達5.14×103virions/cell。Bock等［3］通過灌注或多次流加等復雜培養(yǎng)方式來提高流感病毒產(chǎn)量，其Svy為2.4×103virions/cell，僅比其批式培養(yǎng)過程Svy值（2.1×103virions/cell）提高了14.29%。本研究通過維持培養(yǎng)基的選擇，應用簡單的批式培養(yǎng)模式便使Svy得到大幅提升。由此可見，簡單的增強營養(yǎng)供給并不一定能夠使流感病毒生產(chǎn)效率得到顯著，選擇合適的維持培養(yǎng)基更重要。

4 結(jié)論

本研究通過微載體濃度選擇和和換夜培養(yǎng)操作提高了批式培養(yǎng)過程中MDCK細胞密度，并通過維持培養(yǎng)基的選擇及簡單的營養(yǎng)調(diào)整策略解除了高細胞密度培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒過程中的細胞密度效應，提高了單個細胞的產(chǎn)毒能力，從而獲得較高的病毒產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)流感疫苗提供了數(shù)據(jù)參考。

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（責任編輯 李楠）

Effect of Cell Density and Nutrition Supply on Cell-specific Virus Yields of Influenza Virus H1N1

Kong Wengang1Huang Ding1Luo Jian2Zhou Linting2Chen Ze2Liu Xuping1Tan Wensong1Deng Xiancun1，3
（1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237；2. Shanghai Institute of Biological Products，Shanghai 200052；3. Zhejiang Hisun Pharmaceutical（Hangzhou）Co.Ltd，Hangzhou 311404）

It was to investigate the phenomenon that high cell density with low cell-specific virus yields and find out the solution. Methods：High cell density was achieved by increasing the microcarrier concentration and enhancing nutrition supply， then the effect of cell concentration at infection（CCI）and virus maintenance medium（VMM）on virus titer and cell-specific virus yield（Svy）was studied. Results：The maximum cell density was up to 1.47×107cells/mL in 12.6 g/L microcarrier culture using medium exchange strategy. Under high CCI（1×107cells/mL）condition， the Svy was up to 5.14×103virions/cell by choosing appropriate virus maintenance medium， which is nearly twice of Svy in DMEM. Conclusion：In order to achieve higher influenza virus titer， culture conditions and nutrition demands at different stages of influenza production should be taken into consideration. The results in this work provide guidance for further development of industrial-scale vaccine production processes.

high-density culture；MDCK；influenza production；virions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.031

2014-10-28

國家自然科學基金項目（21106045，21206040），國家“863”計劃（2012AA02A303），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003），中央高校基本科研業(yè)務費（WF1214035）

孔文剛，男，碩士研究生，研究方向：動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)；E-mail：abcd669855@126.com

劉旭平，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；譚文松，E-mail：wstan@ecust.edu.cn