王建軍楊慧珍劉佼

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院隰縣農(nóng)業(yè)試驗站，隰縣 041300；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031）

cryIAc基因在轉(zhuǎn)基因玉米中的遺傳規(guī)律及對抗蟲性影響

王建軍1楊慧珍2劉佼1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院隰縣農(nóng)業(yè)試驗站，隰縣 041300；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031）

旨在研究目的基因在轉(zhuǎn)基因植株和后代植株（株系）中的遺傳規(guī)律及其對轉(zhuǎn)化植株抗蟲性的影響。以花粉介導(dǎo)法將cryIAc基因?qū)胗衩鬃越幌怠?8’和‘昌7-2’，對轉(zhuǎn)化植株及其后代株系進(jìn)行分子檢測和田間抗蟲鑒定。結(jié)果表明：（1）轉(zhuǎn)化‘鄭58’和‘昌7-2’，T1代分別獲得轉(zhuǎn)基因植株24和41個，轉(zhuǎn)化率高達(dá)20%以上；（2）轉(zhuǎn)基因T2代、雜交F2代及回交1代（B1）的分子檢測結(jié)果證明，外源基因的遺傳符合孟德爾的3∶1、3∶1和1∶1的遺傳分離規(guī)律；（3）連續(xù)多帶的分子檢測結(jié)果還表明，外源基因可穩(wěn)定遺傳并有效表達(dá)，表達(dá)水平在9.8-14.3 ng/g葉片鮮重之間；（4）抗蟲鑒定結(jié)果顯示，在陰性對照全部感蟲情形下，轉(zhuǎn)基因純合株系仍表現(xiàn)出較高抗蟲活性；（5）此外，回交試驗結(jié)果還證明外源基因通過雜交可傳遞給下一代；（6）最終經(jīng)篩選得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五個高抗蟲轉(zhuǎn)基因株系。結(jié)果表明，花粉介導(dǎo)法是一種高效、快捷的轉(zhuǎn)化方法，cryIAc基因?qū)胗衩鬃越幌抵仓旰筚x予和提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲活性。

轉(zhuǎn)基因玉米；cryIAc基因；遺傳規(guī)律；抗蟲性

玉米（Zea mays L.）是我國重要的糧食、飼料作物。目前我國玉米生產(chǎn)的總體形勢是供不應(yīng)求，加之在玉米生產(chǎn)中還存在許多影響玉米產(chǎn)量的因素，特別是蟲害對玉米生產(chǎn)的制約，使得玉米市場的供應(yīng)壓力更加沉重。由于資源匱乏，常規(guī)育種也已無法滿足當(dāng)前玉米生產(chǎn)對抗性品種的需求，因此應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，突破常規(guī)育種中物種間基因橫向交流的壁壘，擴(kuò)大其可利用基因資源的范圍，是改良玉米自交系、創(chuàng)制玉米新的抗蟲品種、提高玉米產(chǎn)量、緩解市場壓力的一條新途徑。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）所產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICPs）恰好可引起昆蟲細(xì)胞膜穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，以致昆蟲進(jìn)食困難并死亡［1，2］。目前Bt 基因是植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最廣泛、最具應(yīng)用前景的抗蟲基因。轉(zhuǎn)基因植株抗蟲性方面：國外，早在1990年美國孟山都公司和迪卡公司就用基因槍轟擊法獲得了能正常結(jié)實的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米［3，4］。Lauer等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在玉米螟自然侵染和人工接種4次的條件下，轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白基因玉米的產(chǎn)量不受玉米螟的影響，產(chǎn)量比非轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白基因玉米增產(chǎn)10%以上，比生產(chǎn)上應(yīng)用的適應(yīng)性好的對照品種增產(chǎn)4%-8%。同樣研究還發(fā)現(xiàn)，在歐洲玉米螟中等偏重發(fā)生的情況下，雖轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白基因玉米殺蟲效果同化學(xué)防治相當(dāng)，但較非轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白基因玉米卻增產(chǎn)10%［6，7］。國內(nèi)，丁群星等［8］首次用子房注射法將Bt 毒蛋白基因?qū)胗衩鬃越幌?；王國英等?］用基因槍轟擊法將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織和幼胚獲得再生轉(zhuǎn)基因植株；袁英等［10］采用基因槍法將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲毒蛋白基因（cryIA）導(dǎo)入東北春玉米自交系鐵7922 的幼胚中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)篩選最終得到一批抗玉米螟自交系。在目的基因遺傳規(guī)律研究方面：大量的轉(zhuǎn)基因研究表明，轉(zhuǎn)化的外源基因能夠整合到植物細(xì)胞基因組，整合后的外源基因遵循該細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制和表達(dá)規(guī)律，T1或T2代呈常見的3∶1遺傳分離［3，11-17］，也有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)Bt 基因植株的測交后代抗蟲和感蟲植株的比例接近1∶1，符合孟德爾單顯性基因的遺傳規(guī)律［18，19］。而李余良等［20］則認(rèn)為轉(zhuǎn)基因T1代植株P(guān)CR檢測證明Bt基因能夠穩(wěn)定遺傳，基因分離符合1∶1的孟德爾遺傳規(guī)律［19］。此外，還有一些研究認(rèn)為由于轉(zhuǎn)基因整合的方式和拷貝數(shù)不同，或者由于沉默、損傷或丟失導(dǎo)致不規(guī)則的遺傳［21-24］。上述關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性研究，大多集中在對轉(zhuǎn)基因植物前幾代抗蟲性研究，而轉(zhuǎn)基因純合株系的抗蟲性表現(xiàn)即對轉(zhuǎn)化株系抗蟲性穩(wěn)定性卻少見報道；關(guān)于Bt基因在轉(zhuǎn)化株系中的遺傳分離方式的研究主要是針對T1、T2代或回交后代的遺傳分離，很少有人將兩者結(jié)合起來進(jìn)行系統(tǒng)的研究。總之，由于在各自試驗中所用材料不盡相同，轉(zhuǎn)化方法也各有區(qū)別、缺少連續(xù)而系統(tǒng)的試驗策略，故所得結(jié)論雖類同，但可比性較差。

因此，本研究以p3301UbiAc為供體質(zhì)粒，采用花粉介導(dǎo)法［25］將cryIAc基因?qū)胗衩鬃越幌怠?8’和‘昌7-2’，通過多代PCR檢測、Southern雜交分析，在獲得轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)上，加代分析，即對后代植株進(jìn)行PCR檢測、Southern雜交分析、ELISA分析，直到獲得轉(zhuǎn)基因純合株系，并通過雜交和回交，分別對T2代、F1代和B1代材料進(jìn)行PCR和ELISA分析，驗證其外源基因分離比，并在T5代進(jìn)行田間抗蟲鑒定，旨在連續(xù)系統(tǒng)地研究目的基因在轉(zhuǎn)化植株及其后代株系中的遺傳規(guī)律和轉(zhuǎn)化植株純合系的抗蟲活性表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以目前玉米制種上使用較廣泛的自交系‘鄭58’和‘昌7-2’為受體材料。材料為本研究室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為p3301UbiAc，含有cryIAc基因，啟動子為Ubi，終止子為nos，載體菌為農(nóng)桿菌LBA4404。圖1是質(zhì)粒p3301UbiAc的圖譜。載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王國英教授提供。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA、植物DNA和可溶性蛋白質(zhì)的提取 質(zhì)粒DNA的提取方法參見《分子克隆》［26］，植物DNA采用CTAB法提取。提取的DNA用于PCR檢測和Southern雜交分析。植物可溶性蛋白提取方法參考楊文鵬等［27］的方法，提取的蛋白用于ELISA分析。

圖1 質(zhì)粒p3301UbiAc圖譜

1.2.2 轉(zhuǎn)化方法 轉(zhuǎn)化方法采用花粉介導(dǎo)法［28］，略作改良，在加入質(zhì)粒DNA前做第1次超聲波處理，加入質(zhì)粒DNA后，做第2次超聲波處理，處理參數(shù)不變。在授粉前，花粉處理液中加入少量的硼酸（50 mg/L）、GA3（40 mg/L）以促進(jìn)花粉在授粉后的萌發(fā)。授粉后套袋，秋季收獲T0代種子。

1.2.3 田間試驗安排 2009-2013年間完成本項目研究，所有田間試驗均在山西東陽基地或三亞南繁基地進(jìn)行，每年兩季。所有分子檢測試驗均在本中心基因工程研究室進(jìn)行。

T0代種子全部播種得到T1代植株，全部取樣做PCR擴(kuò)增分析，對PCR檢測呈陽性結(jié)果的材料做Southern雜交分析和ELISA分析，以獲得轉(zhuǎn)基因植株；T1代PCR和Southern檢測呈陽性的植株全部套袋自交，收獲的種子來年全部播種得到T2代植株，每個株系種5行，每行留苗12株，全部取樣進(jìn)行PCR檢測，每個株系隨機(jī)取樣5份進(jìn)行ELISA分析，每個株系取5份PCR擴(kuò)增結(jié)果陽性的材料進(jìn)行Southern雜交分析；T3代為隨機(jī)選取T2代分子檢測結(jié)果呈陽性株系的植株，每個自交系選20株，每株種5行，每行留苗12株，全部取樣做PCR檢測，隨機(jī)選取PCR陽性結(jié)果的材料做Southern雜交和ELISA分析；T4代同T3代；以此類推直到獲得穩(wěn)定遺傳的純合轉(zhuǎn)基因株系。本研究在T4代獲得了6個‘鄭58’轉(zhuǎn)基因純合株系和7個‘昌7-2’轉(zhuǎn)基因純合株系。

2011年冬，每個自交系隨機(jī)選取2份轉(zhuǎn)基因純合株系的種子赴三亞做雜交試驗，每份種1行，另外取4份非轉(zhuǎn)基因的‘鄭58’和‘昌7-2’種子（每個自交系2份），每份播種1行，每行10株（對應(yīng)于1個純合株系），花期取轉(zhuǎn)基因純合株系植株花粉授粉于其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植株上，套袋，并作標(biāo)記，秋季收獲F1雜交種子。2012年春東陽基地播種得到F1代植株，每穗種子種6行，每行定苗時留10株（3次重復(fù)），F(xiàn)1代植株全部取樣，做PCR擴(kuò)增分析，每系每個重復(fù)各隨機(jī)選取30份樣品做ELISA分析，確定雜交F1代的外源基因分離比；同時取適量雜交F1代種子和各自交系非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子分別播種，取陰性對照花粉分別授粉于各個自交系的F1代植株，得到B1代種子；2012年冬季赴海南播種B1代種子，5葉期取樣做PCR檢測和ELISA分析，確定B1代材料的分離比。

1.2.4 遺傳規(guī)律研究 T1代來自T0種子單粒播種，因此不存在遺傳分離問題，僅通過PCR擴(kuò)增、Southern雜交分析和ELISA分析，觀察外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的導(dǎo)入、整合和表達(dá)等遺傳現(xiàn)象；對T2代轉(zhuǎn)化植株做同樣的分子檢測，結(jié)果可用來確定T2代中外源基因的遺傳分離現(xiàn)象；獲得轉(zhuǎn)基因純合株系前各代的分子檢測結(jié)果可用來確定外源基因在轉(zhuǎn)化株系中的世代遺傳規(guī)律；對F2、B1代的分子檢測結(jié)果可用于分析外源基因能否通過雜交方式傳遞給后代植株以及外源基因在F2和B1代的遺傳規(guī)律。

1.2.5 抗蟲性鑒定 2012年將T4代純合株系種子播種得到的T5代材料作為抗蟲鑒定接蟲圃。各個自交系分別選取5份純合系種子播種，每份種子出苗后定苗60株，以非轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)自交系為對照，試驗設(shè)3次重復(fù)。為避免株系間以及環(huán)境的干擾，每個株系間都用遮蟲網(wǎng)分開，空中也用遮蟲網(wǎng)覆蓋。當(dāng)玉米生長到9-10 片葉左右時，將孵化的玉米螟卵接在心葉中，每株接3個中等大小的卵塊。在玉米抽雄吐絲期調(diào)查玉米螟危害植株的葉片數(shù)、蟲孔大小及其數(shù)目；在成熟期調(diào)查莖桿中玉米螟的隧道長度，按照Armstrong等［6］采用的標(biāo)準(zhǔn)，把只有蛀孔沒有運動的隧道長度記為＜2.5 cm；另外每份材料隨機(jī)取樣10份并混合，提取其可溶性蛋白質(zhì)，采用Bradford［29］的方法測定蛋白濃度，以陰性對照的光吸收值為0，測定目的基因表達(dá)的蛋白量，以探討轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性與其體內(nèi)殺蟲蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。

1.2.6 分子檢測 各代植株均在5葉期取新鮮幼嫩葉片作為樣品，按1.2.1方法提取植物DNA或可溶性蛋白質(zhì)，以備進(jìn)行分子檢測和分析。

1.2.6.1 PCR擴(kuò)增 cryIAc基因引物序列：上游5'-CTGACCGTGACCGTGCTG-3'，下游5'-TGGTGCCGTAGGCGAACT-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴(kuò)增體系：總體積20 μL，Taq酶購自TRANSGEN 生物技術(shù)公司。擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離，在SYN成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果并照相。試驗設(shè)質(zhì)粒DNA陽性對照，陰性對照。

1.2.6.2 Southern雜交分析 以PCR擴(kuò)增結(jié)果呈陽性的植株為材料，用核酸蛋白檢測儀測定待酶切DNA濃度，再經(jīng)適當(dāng)稀釋，使各總DNA 濃度大致相同。取質(zhì)粒DNA 25 μg和陰性對照DNA 25 μg各1份，轉(zhuǎn)化植株DNA 25 μg若干份，植物DNA用Xba I內(nèi)切酶37℃ 酶切16 h，質(zhì)粒DNA用Hind Ⅲ內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上［26］。

以cry I Ac 基因的PCR 特異擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用隨機(jī)引物方法制備地高辛標(biāo)記探針。預(yù)雜交、雜交和洗膜，均按Roche 公司的地高辛DNA 標(biāo)記及檢測試劑盒提供的方法進(jìn)行，最后在含有NBT 和BCIP 的染色液中顯色。

1.2.6.3 ELISA檢測 各代材料取樣數(shù)參見表1。ELISA 檢測按試劑盒（EnviroLogix，USA）說明書進(jìn)行。

1.2.6.4 玉米不同生育期目的基因表達(dá)分析 T5代植株，每個自交系選取2個株系，每個株系所取樣品混合后提取總蛋白，取樣時期和取樣材料為：5葉期，取樣第5葉片；拔節(jié)期，取樣此時植株部分心葉葉片；抽雄期，取樣此時植株第3頂葉葉片葉尖；灌漿期，取樣第2頂葉葉片葉尖。分別提取蛋白質(zhì)做ELISA分析，從而研究外源基因在轉(zhuǎn)化植株不同生育期的表達(dá)現(xiàn)象。

1.2.7 對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 用DPS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化植株的獲得

花粉介導(dǎo)法收獲T0種子‘鄭58’129粒、‘昌7-2’153粒。來年播種‘鄭58’出苗118株，‘昌7-2’出苗143株。經(jīng)PCR檢測呈陽性結(jié)果：‘鄭58’ 51個，‘昌7-2’83個，對PCR陽性結(jié)果植株的Southern雜交分析，呈陽性結(jié)果：‘鄭58’24個，‘昌7-2’41個，轉(zhuǎn)化率分別為20.3%和28.7%。對Southern雜交陽性結(jié)果植株的ELISA檢測，結(jié)果全為陽性。證明cryIAc基因已導(dǎo)入并整合到轉(zhuǎn)化植株的染色體組中，且外源基因得到表達(dá)。由此獲得轉(zhuǎn)化植株‘鄭58’24個，‘昌7-2’41個。以上分子檢測中，所有陰性對照的檢測結(jié)果均為陰性。

T4代部分轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測結(jié)果（圖2）顯示，除陰性對照外，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化植株都可看到期望大小的特異條帶，表明目的基因存在于T4代轉(zhuǎn)化植株中。同時證明T4代轉(zhuǎn)基因株系已擬視純合。結(jié)合T4代材料的Southern雜交分析結(jié)果以及其田間抗蟲表現(xiàn)，最終選擇得到轉(zhuǎn)基因純合株系。

圖2 T4代部分轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測結(jié)果

圖3 T2代部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交分析結(jié)果

部分T2代轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交結(jié)果（圖3）顯示，陰性對照（泳道1）無雜交條帶出現(xiàn)，陽性對照（P）和絕大部分轉(zhuǎn)化植株（泳道2，3，4，6，7）都有雜交條帶存在，證明目的基因已整合到轉(zhuǎn)化植株的染色體組中。泳道5沒有發(fā)現(xiàn)雜交信號，可能與基因分離或丟失有關(guān)。圖3中還可看到，絕大部分轉(zhuǎn)基因植株均有一條雜交信號條帶，證明目的基因皆以單拷貝、單位點方式插入并整合到轉(zhuǎn)基因植株的染色體上。其中，泳道2和4號植株有兩條雜交信號帶，可能與多拷貝數(shù)整合有關(guān)（被淘汰）。各代分子檢測結(jié)果，見表1。

表1 各代轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測結(jié)果

2.2 遺傳規(guī)律研究結(jié)果

T1代樣品的PCR檢測和Southern雜交分析結(jié)果證明，cryIAc基因已導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株并整合到轉(zhuǎn)基因植株的染色體組中，ELISA檢測結(jié)果表明外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達(dá)。

T2代材料的PCR檢測，‘鄭58’材料的陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=2.61∶1（χ2=5.633 3），‘昌7-2’材料的陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=2.8∶1（χ2= 2.220 1）；ELISA檢測結(jié)果：‘鄭58’材料的陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=2.64∶1（χ2=0.400 0），‘昌7-2’材料的陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=2.66∶1（χ2= 0.588 8）。PCR檢測結(jié)果與ELISA分析結(jié)果接近一致，對分離比例進(jìn)行χ2測驗，結(jié)果證明外源基因在T2代的遺傳分離符合3∶1 的孟德爾遺傳規(guī)律。上述χ2檢驗水平為P＞0.01。

T3代轉(zhuǎn)基因材料的分子檢測結(jié)果顯示，PCR檢測陽性結(jié)果率接近99%，Southern雜交和ELISA分析的陽性結(jié)果率均為100%。證明轉(zhuǎn)基因株系已趨于純合。

T4代的分子檢測結(jié)果全為陽性，通過4代篩選，最終得到‘鄭58’轉(zhuǎn)基因純合株系9個，‘昌7-2’轉(zhuǎn)基因純合株系8個。

B1代的PCR擴(kuò)增結(jié)果為：‘鄭58’陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=1.05∶1（χ2=2.151 1），‘昌7-2’陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=1.09∶1（χ2=0.257 8），ELISA檢測結(jié)果為：‘鄭58’陽性結(jié)果數(shù)：陰性結(jié)果數(shù)=1.05∶1（χ2=0.044 4），‘昌7-2’ 陽性結(jié)果數(shù)∶陰性結(jié)果數(shù)=1.14∶1（χ2=0.400 0）。χ2測驗，結(jié)果證明外源基因在F1代的分配符合1∶1 的孟德爾遺傳規(guī)律。同時，F(xiàn)2代植株中檢測到目的基因，證明轉(zhuǎn)基因可以通過雜交方式傳遞給期望的玉米自交系。同樣，F(xiàn)2代呈現(xiàn)出明顯的3∶1分離現(xiàn)象（PCR：χ2=5.305 9和 χ2=0.963 2，ELISA：χ2=0.088 9和χ2=0.355 5，P＞0.05）。

總體來講，轉(zhuǎn)cryIAc基因玉米植株及其后代株系中，目的基因均表現(xiàn)出孟德爾的單顯性基因的遺傳分離規(guī)律。

T5代轉(zhuǎn)基因植株的ELISA分析結(jié)果證明，在玉米生長的5葉期、撥節(jié)期、抽雄期和灌漿期，cryIAc基因均能正常表達(dá)，意味著在轉(zhuǎn)基因的玉米株系的大部分生長發(fā)育階段，均能在一定程度上減少殺蟲劑的使用或不用。

本研究從橫向、縱向分別對轉(zhuǎn)基因植株（株系）中目的基因的遺傳方式和表達(dá)現(xiàn)象進(jìn)行了分析。均未發(fā)現(xiàn)cryIAc基因的基因沉默現(xiàn)象。

2.3 轉(zhuǎn)化植株的抗蟲鑒定結(jié)果

田間抗蟲鑒定轉(zhuǎn)基因植株的蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果（表2）顯示，T5代轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)量介于9.8-14.3 ng/g葉片鮮重之間，占植株總可溶蛋白量的0.1%左右。抗蟲調(diào)查結(jié)果（表3）顯示，陰性對照株系的玉米螟食葉危害的程度比轉(zhuǎn)基因株系大，即兩個自交系的陰性對照材料全部感蟲，且單株蟲孔葉片數(shù)多、蟲孔也大，害蟲的莖稈隧道長度為5.7-14.6 cm。圖4顯示轉(zhuǎn)基因株系的受損植株數(shù)和單株受損葉片數(shù)均比陰性對照低得多，而且受害葉片的受損程度也比對照低。證明目的基因的導(dǎo)入賦予和提高了轉(zhuǎn)化植株的抗蟲活性，不同的轉(zhuǎn)基因株系間感蟲程度和蟲害程度以及各重復(fù)間雖有差異，但差異不顯著，而且轉(zhuǎn)基因株系的莖稈隧道長度均＜2.5 cm，證明在純合株系T5代時轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲活性基本穩(wěn)定。這與張紅偉等［30］認(rèn)為高代轉(zhuǎn)基因株系植株的田間食葉級別均較小的結(jié)論基本一致。

表2 T5代轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的表達(dá)量測定好結(jié)果

表3 轉(zhuǎn)基因株系抗玉米螟鑒定調(diào)查和分析結(jié)果

在玉米成熟期，莖桿中玉米螟的隧道長度可反映玉米材料對玉米螟抗性的強(qiáng)弱［31，32］。本研究同樣證明，轉(zhuǎn)基因株系的玉米螟莖稈隧道長度＜2.5 cm，表現(xiàn)出比陰性對照株系高抗蟲的特性。以上結(jié)果證明，在玉米轉(zhuǎn)基因純合株系中，抗蟲活性基本穩(wěn)定。

結(jié)合轉(zhuǎn)基因純合株系植株中目的基因表達(dá)量與其抗蟲活性的相關(guān)性分析，轉(zhuǎn)基因植株中目的基因表達(dá)量與其自身的抗蟲活性呈顯著相關(guān)（R2=0.821，P＜0.01）。最終經(jīng)認(rèn)真篩選，本研究最后得到5個高抗蟲的轉(zhuǎn)基因出合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。

3 討論

轉(zhuǎn)cryIAc基因玉米自交系中，外源基因的遺傳分析表明，外源基因多以單拷貝、單位點形式整合到轉(zhuǎn)基因植株的染色體組中，而且可以有效表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，T2代和F2代的遺傳分離研究結(jié)果證明符合孟德爾單因子顯性遺傳分離規(guī)律，與朱常香等［33］的研究結(jié)論一致。轉(zhuǎn)基因株系的回交試驗結(jié)果顯示，外源基因的分離比為1∶1，與朱衛(wèi)紅等［18］結(jié)果相近。不同生育期材料的ELISA分析結(jié)果表明，在玉米生長期間的大部分階段，外源基因都能以較高的水平表達(dá)，這對害蟲的防治是非常有益的。本研究分別依據(jù)T2代、F1代和B1代植株的檢測結(jié)果，證明目的基因遵循孟德爾單顯性因子的遺傳分離規(guī)律。

抗蟲性鑒定表明，相對于陰性對照，轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲能力都有很大提升。但是不同轉(zhuǎn)基因植株或株系之間，殺蟲活力還是存在一定的差異，除了這些轉(zhuǎn)化體中存在個體差異外，還與外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)量、整合拷貝數(shù)、位點等有關(guān)、甚至與基因的沉默或丟失或修飾也有關(guān)，表達(dá)量越高，抗性也越強(qiáng)［34，35］。關(guān)于抗蟲轉(zhuǎn)基因作物選育過程，轉(zhuǎn)基因后代材料抗蟲能力的穩(wěn)定性一直受到人們關(guān)注。郭東全等［36］在研究大豆的轉(zhuǎn)化植株及其后代抗蟲性中，經(jīng)連續(xù)4代篩選，得到抗蟲性趨于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化后代株系。本研究對轉(zhuǎn)基因純合株系的抗蟲性分析表明純合株系中除個體間略有差異外，株系間、株系內(nèi)植株的抗蟲活性基本一致。這較先前報道中在研究轉(zhuǎn)基因前幾代中轉(zhuǎn)基因株系抗蟲活性時所得出的株系間差異較大的結(jié)論更接近現(xiàn)實，因為遺傳不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系是不可能釋放到田間的。

圖4 田間抗蟲試驗照片

玉米優(yōu)良自交系很多，對這些自交系一一轉(zhuǎn)化不僅需要很多時間，而且還要耗費大量的人力、物力。能否通過雜交方式將外源基因傳遞到期望的自交系中，從而培育出優(yōu)良自交系，用于創(chuàng)制優(yōu)異性狀的玉米品種，是人們所期望的。有報道認(rèn)為，無論用何種轉(zhuǎn)化方法，基因整合一旦發(fā)生，外源DNA 都有可能在減數(shù)分裂過程中保留下來，從而穩(wěn)定地遺傳給后代［37］。本研究中T5轉(zhuǎn)基因植株與其對應(yīng)非轉(zhuǎn)化自交系雜交得到含有目的基因的F1代，也證明了轉(zhuǎn)化體中的外源基因可通過雜交方式傳遞給下一代，這將為玉米新型抗性品種的創(chuàng)制提供技術(shù)保障。不過花粉與非轉(zhuǎn)基因自交系雜交結(jié)果還證明，花粉可攜帶導(dǎo)入的外源基因，這與前人研究所得的Bt基因能通過轉(zhuǎn)基因玉米的花粉大量傳送而發(fā)生轉(zhuǎn)移以及也能通過轉(zhuǎn)基因玉米的花粉飄落等多種形式進(jìn)入土壤等結(jié)論［38-40］一致，再次證明Bt基因可能會飄逸造成基因污染；還有研究結(jié)果表明，鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的多種昆蟲對生物制劑和轉(zhuǎn)基因植物均可產(chǎn)生抗性，鱗翅目昆蟲更容易產(chǎn)生抗性［41］，因此如何避免基因飄逸造成污染及其防止昆蟲對轉(zhuǎn)基因植株中殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性等問題還需要進(jìn)行深入的研究。此外，根據(jù)傳統(tǒng)理論，雜交F1代植株中的目的基因需要回交至少5代以上才能穩(wěn)定，本研究中僅回交了1代，還需繼續(xù)開展這方面的工作。

許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系都以抗生素或除草劑作為選擇標(biāo)記基因，雖提高了獲得轉(zhuǎn)基因植物的效率，但隨著選擇過程的結(jié)束，這些外源選擇基因在植物基因組中的存在和表達(dá)就變得多余，可能會引發(fā)有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物安全的許多問題［42］。本研究采用的花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化體系，無需冗長的組培過程，直接得到轉(zhuǎn)化種子，因此也無需這些標(biāo)記基因的存在，在一定程度上會減少人們對轉(zhuǎn)基因食品和環(huán)境安全的擔(dān)憂。

本研究根據(jù)cryIAc基因的遺傳規(guī)律、表達(dá)水平以及田間抗蟲鑒定的研究分析，經(jīng)篩選，得到5個高抗蟲的轉(zhuǎn)基因出合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。針對這5個株系材料，我們已申請了農(nóng)業(yè)部的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中間試驗，在進(jìn)行中間試驗的同時，以轉(zhuǎn)基因材料作為親本，設(shè)計多個組合，觀察轉(zhuǎn)基因技術(shù)對轉(zhuǎn)化材料的配合力、農(nóng)藝性狀等的影響，進(jìn)而篩選出更適合生產(chǎn)上應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因新品新，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品早日走向市場做好技術(shù)和物質(zhì)準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

采用花粉介導(dǎo)法將cryIAc基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，T4代獲得了轉(zhuǎn)化植株及轉(zhuǎn)基因純合株系，目的基因在轉(zhuǎn)化植株及其后代植株中能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，表達(dá)量占總可溶蛋白的0.1%左右，而且目的基因表達(dá)量與植株的抗蟲活性間顯著相關(guān)。遺傳規(guī)律研究表明，轉(zhuǎn)基因材料在T2、雜交F2和回交B1代，外源基因的分離或分配比分別為3∶1、3∶1和1∶1?？瓜x鑒定結(jié)果證明，轉(zhuǎn)cryIAc基因的玉米植株獲得和增強(qiáng)了對玉米螟蟲害的抗性。經(jīng)篩選，得到5個高抗蟲的轉(zhuǎn)基因純合株系，分別為SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Genetic Analysis of cryIAC Gene in Transgenic Maize Plants and Its Effects on Insect-resistance

Wang Jianjun1Yang Huizhen2Liu Jiao1
（1. Xixian Agricultural Experiment Stations，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xixian 041300；2. Crop Science Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

In order to analyse the genetic regularity of target gene cryIAc in transgenic and their descendant plants（lines）， and to study the effect of target gene on insect-resistant activity of transgenic plants at the same time， this research work was conducted. Firstly， cryIAc gene was transformed into maize inbred ‘Zheng 58’ and ‘Chang7-2’ separately by pollen-mediated transformation method. PCR， Southern，ELISA analysis and bioassay in the field of each generation transgenic plants were then conducted according to experimental requirements. Results showed that ⑴ A total of 24 and 41 transgenic plants were obtained through transformed cryIAc gene into maize inbred ‘Zheng 58’and ‘Chang7-2’， respectively. ⑵ The molecular detection results of transgenic T2， hybridization F2and backcross B1plants suggested that the segregation of target gene in these lines followed 3∶1， 3∶1 and 1∶1 segregation ratio of the Mendel laws of heredity， respectively. ⑶ The molecular detection results of T1to T4transgenic plants（lines）showed that the target gene could stably inherited and expressed effectively， the expression amount of the target gene was from 9.8 to 14.3 ng/g leaf fresh weight. ⑷ Moreover， the results of bioassay in the field indicated that in the case of high insect-susceptibility of negative control line， the transgenic lines still showed highly insect-resistant activity. ⑸ In addition， the target gene integrated into genomics of transgenic plants could inherit to the next generation plants by hybridization. ⑹ At last， 5 high insectresistant transgenic lines， SZ003， SZ005， SC001， SC004 and SC007， was gained by screening. The pollen-mediated transformation method was a effective and shortcut tool used in plant transformation， cryIAc gene could confer and enhance insect-resistant activity of transgenic plants（lines）tansfomated with it.

transgenic maize；cryIAc gene；genetic regularity；insect-resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.019

2014-05-21

山西省科技攻關(guān)項目（20140311002-1），山西省農(nóng)科院院育種高產(chǎn)項目（11yzgc064）

王建軍，研究方向：玉米育種和栽培；E-mail：wangjianjun1123@126.com