宿明星 孫穎顥 施鶴 李秋莉

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連116081）

植物非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究方法

宿明星 孫穎顥 施鶴 李秋莉

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連116081）

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，是一大類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，也是植物中最大的基因家族之一。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)眾多下游基因的表達(dá)，對(duì)植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、激素調(diào)節(jié)，以及抵抗多種生物和非生物脅迫具有重要作用。結(jié)合近年來轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展，歸納總結(jié)了植物非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究的主要策略和方法，包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活作用、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體以及轉(zhuǎn)錄因子功能的研究，為植物轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究提供理論和方法的參考。

非生物脅迫；轉(zhuǎn)錄因子；瞬時(shí)表達(dá)；轉(zhuǎn)錄激活；轉(zhuǎn)基因植物

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.008

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）又稱反式作用因子，是直接或間接與基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合、對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用的一類蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子一般具有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD），是轉(zhuǎn)錄因子上識(shí)別并結(jié)合順式作用因子的一段氨基酸序列，可與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合；寡聚化位點(diǎn)區(qū)（Oligomerization site，OS），是不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用的功能域；核定位信號(hào)區(qū)（Nuclear location signal，NLS），可將轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)的某些區(qū)域；轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（Transcription regulation domain，TRD），決定著轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的調(diào)控特征，分為轉(zhuǎn)錄激活域（Activation domain，AD）和轉(zhuǎn)錄抑制域（Repression domain，RD），對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。

轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成及對(duì)生物和非生物脅迫中起著重要的作用，在植物基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄因子一直備受關(guān)注，我們結(jié)合近年來非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展，歸納、總結(jié)了非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究的主要方法和策略，以期為植物轉(zhuǎn)錄因子的鑒定、功能分析及靶基因研究提供理論和技術(shù)上的參考。

1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域分析

1.1 生物信息學(xué)分析轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域

轉(zhuǎn)錄因子序列通常具有保守性，這些保守的結(jié)構(gòu)域（Conserved domains，CD）在進(jìn)化過程中氨基酸序列變化很小，因此可以利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行分析，預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫提供了大量的核苷酸和氨基酸序列，常用的大型生物數(shù)據(jù)庫包括NCBI、EBI和DDBJ等都為轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了大量的數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄因子有其自己的數(shù)據(jù) 庫， 如TRANSFAC（http：//www.gene-regulation. com/pub/ databases.html）和PlnTFDB（http：//plntfdb. bio.unipotsdam.de/v3.0/），為轉(zhuǎn)錄因子的鑒定、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測提供了新的方法［1］。植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 PlantTFDB database（http：//planttfdb.cbi.pku.edu. cn/）中包含多種植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。Kato等［2］將ANAC036基因的核苷酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行在線Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi），預(yù)測ANAC036氨基酸序列具有典型的NAM保守結(jié)構(gòu)域，確定為NAC類轉(zhuǎn)錄因子。Lu等［3］研究的SbSNAC1轉(zhuǎn)錄因子，是從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中提取出的編碼NAC類的轉(zhuǎn)錄因子，SbSNAC1轉(zhuǎn)錄因子具有典型的NAC結(jié)構(gòu)域，具有抵抗干旱的作用。Zhao等［4］以DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結(jié)構(gòu)域?yàn)楹Y選標(biāo)準(zhǔn)，從蘋果（Malus pumila Mill.）基因組數(shù)據(jù)庫（http：// genomics. research. iasma. it/）中獲得多個(gè)蘋果中DREB轉(zhuǎn)錄因子，并構(gòu)建了本地BLASTP搜索，為后續(xù)對(duì)蘋果中DREB轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分析及表達(dá)特性分析奠定基礎(chǔ)。模式生物擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和水稻（Oryza sativa L.）等有自己的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫，如擬南芥的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫RARTF（http：//rarge.gsc.riken.jp/rartf/）和AGRIS（http：//arabidopsis.med.ohio-state.edu/AtTFDB/）， 為轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了大量的數(shù)據(jù)。Sun等［5］利用水稻基因組數(shù)據(jù)庫（http：// rice. plantbiology. msu. edu/），對(duì)分離出的ONAC122和ONAC131進(jìn)行BLASTn和BLASTp比對(duì)，并對(duì)ORF（Open reading frame）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩基因N末端都具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，并包含NAC的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，C末端具有特異性，確定ONAC122和ONAC131屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。本實(shí)驗(yàn)室Li等［6］利用生物信息學(xué)分析遼寧堿蓬（Suaeda liaotungensis K.）中的一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAC1發(fā)現(xiàn)，其具有NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC家族中的TIP亞家族，Yang等［7］利用此方法分析SlNAC2發(fā)現(xiàn)，其具有NAM結(jié)構(gòu)域，屬于NAC家族中的ATAF亞家族。目前，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域分析的方法比較局限，生物信息學(xué)分析是最常見也是最普遍的方法。

1.2 定點(diǎn)突變分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的功能位點(diǎn)

定點(diǎn)突變（Site-directed mutagenesis）是在體外增添、缺失或者替換DNA序列中特定堿基的技術(shù)，是分析蛋白質(zhì)中特定的單個(gè)或成簇的氨基酸功能的一種方法，也是分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域功能的常見方法。定點(diǎn)突變研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域可在DNA水平和蛋白質(zhì)水平兩個(gè)方面進(jìn)行。DNA水平進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法主要有：（1）寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變，是指以含有突變堿基的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的催化下啟動(dòng)DNA復(fù)制，該方法保真度高，但操作復(fù)雜且周期長；（2）盒式突變，是利用一段含突變序列的人工合成寡核苷酸片段取代野生型基因中的相應(yīng)序列，該方法簡單易行且突變效率高，但需合成多條引物且受到酶切位點(diǎn)的限制；（3）PCR介導(dǎo)的基因突變，是在基因的5'和3'末端產(chǎn)生突變，PCR延伸后再利用另一對(duì)引物進(jìn)行重疊延伸進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變，該方法操作簡單突變率高，但后續(xù)工作復(fù)雜且Taq DNA聚合酶保真性偏低。蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法主要有兩種：丙氨酸置換法和基團(tuán)置換法。由于丙氨酸疏水性小，側(cè)鏈碳原子少，因此可作為側(cè)鏈缺失突變的類似物；基團(tuán)置換法中用帶有突出側(cè)鏈的氨基酸替代野生型殘基的位置，如將Arg替換為Asp，這種方法可以消除原先的接觸，又可在空間或化學(xué)上破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。Duan等［8］利用DNA定點(diǎn)突變技術(shù)鑒定出AtWRKY1-C的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于 β2和β3鏈上。 Tavares和Ling等［9，10］利用氨基酸定點(diǎn)突變的方法鑒定AtMYB30轉(zhuǎn)錄因子的Cys49和Cys53是亞硝基化作用位點(diǎn)，并且是DNA結(jié)合域的關(guān)鍵位點(diǎn)。定點(diǎn)突變的方法能夠鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域中的功能位點(diǎn)，是分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的重要方法。

2 轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位分析

真核生物轉(zhuǎn)錄過程主要發(fā)生在細(xì)胞核中，因而轉(zhuǎn)錄因子一般定位在細(xì)胞核中，但由于線粒體和葉綠體中也含有少量的DNA和RNA，轉(zhuǎn)錄過程在線粒體、葉綠體中也有發(fā)生，因此轉(zhuǎn)錄因子也可能定位在線粒體或葉綠體中。植物蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究方法有很多，如融合報(bào)告基因定位法，免疫組織化學(xué)定位法，共分離標(biāo)記酶輔助定位法，蛋白質(zhì)組學(xué)定位技術(shù)等。此外生物信息技術(shù)的利用是蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測的常用方法。在植物轉(zhuǎn)錄因子的研究中，生物信息學(xué)分析以及融合報(bào)告基因定位法是預(yù)測和鑒定轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位最常見的方法。

2.1 生物信息學(xué)分析轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)的N端或C端有一段指導(dǎo)蛋白質(zhì)尋靶的氨基酸序列，稱為信號(hào)序列，可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，如核定位信號(hào)（Nuclear localization signal，NSL）能指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中。因此根據(jù)蛋白質(zhì)中的信號(hào)序列，利用生物信息學(xué)分析可以預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。主要預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的軟件有WoLF-PSORT（http：// wolfpsort. seq. cbrc. jp/）、NNPSL（http：//predict.sanger.ac.uk. nnps）、SubLoc（http：// www.bioinfo.tsinghua. edu.cn/ SubLoc）和TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TargetP/），為蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位提供了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Puranik等［11］利用WoLF-PSORT預(yù)測SiNAC轉(zhuǎn)錄因子上存在核定位信號(hào)、C末端存在α折疊，預(yù)測SiNAC的亞細(xì)胞定位位于細(xì)胞核和質(zhì)膜上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SiNAC轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)存在于細(xì)胞核和質(zhì)膜上。生物信息學(xué)分析轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位操作簡便，快捷。

2.2 融合報(bào)告基因定位法分析轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）在488 nm的激發(fā)光下會(huì)發(fā)出綠色熒光，將目的轉(zhuǎn)錄因子基因與綠色熒光蛋白基因串聯(lián)，形成融合表達(dá)載體，基因槍法將表達(dá)載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，在共聚焦顯微鏡下通過觀察GFP的位置，從而確定轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位。常用的表達(dá)載體有pEGAD、pCAMBIA1302等。Puranik等［11］利用pCAMBIA1302載體分別構(gòu)建GFP-SiNAC Full length、缺失C末端的GFP-SiNACΔC1-158表達(dá)載體，在CaMV35S啟動(dòng)子作用下，以 GFP為對(duì)照，基因槍法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞，融合表達(dá)48 h，共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的位置，在明場、488 nm激發(fā)光和DAPI染色下，GFP-SiNAC Full length定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，GFP-SiNACΔC1-158定位在細(xì)胞核中（圖1），確定SiNAC上存在核定位信號(hào)，C末端與膜定位密切聯(lián)系。Liu等［12］構(gòu)建TaPIMP1-GFP融合表達(dá)載體，基因槍法轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示 TaPIMP1蛋白質(zhì)僅定位在細(xì)胞核中，屬于核蛋白。Sun等［13］亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明脅迫相關(guān)的一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。本實(shí)驗(yàn)室Li等［6］構(gòu)建GFP-SlNAC1融合表達(dá)載體，基因槍法轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示GFP-SlNAC1定位在細(xì)胞核中；Yang等［7］構(gòu)建GFP-SlNAC2融合表達(dá)載體，基因槍法轉(zhuǎn)化至洋蔥表皮細(xì)胞，SlNAC2-GFP同樣定位在細(xì)胞核中。該方法靈敏度高，并且對(duì)細(xì)胞無毒害，可廣泛利用。由于基因槍瞬間轉(zhuǎn)化設(shè)備十分昂貴，在一定程度上阻礙了該方法的廣泛應(yīng)用，也可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化效率較低。

3 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活作用分析

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性通常在酵母細(xì)胞中進(jìn)行檢測。常用方法是構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至酵母菌中，在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠生長的酵母菌具有轉(zhuǎn)錄激活活性，通過β-半乳糖苷酶染色可進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活作用。常用的載體有pGBKT7、pDBLeu等。為檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄因子具體是哪一段序列具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可構(gòu)建多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活載體。Peng等［14］為了鑒定CarNAC5轉(zhuǎn)錄因子的激活域位置，分別構(gòu)建了pDBLeu-F、pDBLeu-N和pDBLeu-C表達(dá)載體，以pDBLeu為對(duì)照，轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中，在His單缺培養(yǎng)基上僅pDBLeu-F和pDBLeu-C的酵母菌才能夠生長（圖2），β-半乳糖苷酶染色表明CarNAC5轉(zhuǎn)錄因子的激活域位于C末端。Sun等［15］根據(jù) AtbZIP1轉(zhuǎn)錄因子上的模體不同，分別構(gòu)建pGBKT7-AtbZIP1，pGBKT7-AtbZ1，pGBKT7-AtbZ2、pGBKT7-AtbZ3及 pGBKT7-AtbZ4，以pGBKT7-AtDREB1A作為陽性對(duì)照，用醋酸鋰介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至酵母菌中，在Trp單缺培養(yǎng)基上帶有表達(dá)載體的酵母細(xì)胞均能正常生長，而在Trp-His-Ade三缺培養(yǎng)基上只有pGBKT7-AtbZIP1、pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-AtbZ3能生長，將酵母菌進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色，pGBKT7-AtbZIP1藍(lán)色最深，轉(zhuǎn)錄激活最強(qiáng)；pGBKT7-AtbZ1、pGBKT7-AtbZ3顏色較淺，活性相對(duì)弱，結(jié)果顯示AtbZIP1轉(zhuǎn)錄因子的N末端和靠近C端的第92-145個(gè)氨基酸對(duì)轉(zhuǎn)錄激活活性是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)室Li等［6］利用此方法鑒定SlNAC1具有轉(zhuǎn)錄激活活性，Yang等［7］鑒定SlNAC2具有轉(zhuǎn)錄激活活性。該方法簡單易行，無需分離純化蛋白，且酵母菌屬于真核生物，表達(dá)的蛋白質(zhì)處于自然構(gòu)象，克服了體外研究蛋白質(zhì)時(shí)的非自然構(gòu)象，因而靈敏度高，并便于檢測。該方法的缺點(diǎn)是一方面會(huì)出現(xiàn)待鑒定轉(zhuǎn)錄因子可能與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而激活報(bào)告基因表達(dá)的假陽性結(jié)果；另一方面是酵母菌表達(dá)的融合蛋白對(duì)細(xì)胞有毒或蛋白不能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)而造成的假陰性結(jié)果。

圖1 SiNAC在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析［11］

圖2 CarNAC5轉(zhuǎn)錄激活活性分析［14］

4 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究

轉(zhuǎn)錄因子作為一種蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)并不都是獨(dú)立存在、單獨(dú)發(fā)揮作用的，它往往與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相互作用，最后以復(fù)合體的形式行使功能。鑒定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的方法有很多，其中酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)以及免疫共沉淀技術(shù)（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、Pull Down等方法最常見，此外還有串聯(lián)親和純化技術(shù)、寡沉淀等多種技術(shù)。這些方法均可用于植物轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究。

4.1 酵母雙雜交

Fields和Song［16］于1989年建立酵母雙雜交系統(tǒng)，用于真核生物蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。該方法是將轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域分別與待研究蛋白質(zhì)融合表達(dá)，若蛋白之間存在相互作用，則兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在空間上靠近可激活報(bào)告基因的表達(dá)（圖3）。鄭甲成等［17］利用酵母雙雜交技術(shù)以TaAIDFa為誘餌，從cDNA文庫中篩選到84個(gè)與TaAIDFa相互作用的序列，Blast比對(duì)獲得4類候選蛋白，經(jīng)同源性分析預(yù)測與逆境脅迫相關(guān)。Li等［18］利用酵母雙雜交鑒定擬南芥中RCAR1/PYL9與一個(gè)R2R3-MYB類型的AtMYB44之間具有相互作用，促進(jìn)AtMYB44轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。這種方法靈敏度高、高通量化，但由于酵母菌內(nèi)源蛋白質(zhì)可能被激活而存在著假陽性，且要求待測蛋白為核內(nèi)蛋白，若在核外發(fā)揮作用不能激活報(bào)告基因的表達(dá)，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。1998年Karimova等、Ladant等和姜茜等［19-21］分別于1998年、2000年和2008年建立細(xì)菌雙雜交，彌補(bǔ)了酵母雙雜交的缺陷。

圖3 酵母雙雜交原理示意圖

4.2 雙分子熒光互補(bǔ)

雙分子熒光互補(bǔ)（Bimoleeular fluoreseence complementation，BiFC）方法是將兩個(gè)不發(fā)光的熒光互補(bǔ)片段與待測蛋白融合表達(dá)，在待測蛋白的相互作用下，驅(qū)動(dòng)熒光片段重新組裝，恢復(fù)熒光特性。Li 等和Walter等［18，22］利用BiFC方法鑒定出擬南芥中RCAR1/PYL9與一個(gè)R2R3-MYB類型的AtMYB44之間具有相互作用，促進(jìn)AtMYB44轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。Grinberg等［23］利用該技術(shù)研究3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族Myc、Max和Mad在活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的相互作用，觀察到不同轉(zhuǎn)錄因子蛋白間競爭性二聚體的形成。該技術(shù)可檢測體內(nèi)蛋白發(fā)揮作用的時(shí)間、強(qiáng)度及位置等，其缺點(diǎn)是存在假陽性和假陰性結(jié)果。

4.3 免疫共沉淀

免疫共沉淀是利用抗原-抗體之間特異性識(shí)別并結(jié)合的特點(diǎn)來研究體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的一種方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其基本原理是在細(xì)胞裂解液中加入轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體，孵育后加入與抗體特異結(jié)合的Protein A或G，Protein A或G結(jié)合于Agarose珠上，若細(xì)胞中存在與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的目的蛋白，就可以形成“轉(zhuǎn)錄因子-抗體-Protein A或G-Agarose珠-目的蛋白”復(fù)合物，變性后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測就可鑒定目的蛋白。Kawarazaki 等［24］利用免疫共沉淀鑒定AtSRC2與AtRbohF的N末端相互作用。Weis等［25］鑒定擬南芥中的95個(gè)蛋白質(zhì)與GFP相作用。該方法優(yōu)點(diǎn)是可以分離天然狀態(tài)下相互作用的蛋白質(zhì)，缺點(diǎn)是對(duì)于低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)合體可能檢測不到，因而可能存在假陰性。

5 轉(zhuǎn)錄因子功能研究

對(duì)非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子功能的分析的方法很多，包括通過生物信息學(xué)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測、脅迫條件下鑒定基因表達(dá)特性、在基因缺失和過表達(dá)條件下檢測植株的表型變化及生理變化、檢測過表達(dá)植株基因表達(dá)變化分析轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游效應(yīng)基因等。綜合這些方法，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄因子功能進(jìn)行全面的分析。

5.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子功能

系統(tǒng)進(jìn)化樹已經(jīng)是公認(rèn)的一種生物進(jìn)化模型，其主要是依據(jù)DNA或氨基酸的相似度構(gòu)建的。根據(jù)已知序列在線Blast比對(duì)的結(jié)果，找出與已知基因相似度較高的相關(guān)基因，利用構(gòu)建生物進(jìn)化樹的軟件，根據(jù)親緣關(guān)系大小構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在進(jìn)化樹中找出與該基因親緣關(guān)系最相近的基因，通過相關(guān)基因文獻(xiàn)的閱讀，推測已知基因可能具有的功能。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法主要有兩大類，距離法和離散特征法。距離法中有UPGM、鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）等。距離法是根據(jù)距離的類聚算法，運(yùn)算量不大，但在進(jìn)化樹中無法確定進(jìn)化分支的時(shí)間。離散特征法根據(jù)最優(yōu)原則不同，可分為最大似然法（Maximum likelihood，ML）及最大簡約法（Maximum parsimony，MP），這種進(jìn)化樹最大的優(yōu)點(diǎn)就是樹中有進(jìn)化的時(shí)間。常用構(gòu)建生物系統(tǒng)進(jìn)化樹的軟件有PHYLIP（http：//evolution.genetics.washinton.edu/phylip/software.html）、PAUP（ftp：//onyx.si.edu/paup）、MEGA（http：//bioinfo.weizmann.ac.il/ databases/info/ mega.sof） 及TreeView（http：//taxonomy.zoology.gla. ac.uk/rod/treeview.html）等。Li等［26］將EsDREB2B與來自鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）中的CAP2有高達(dá)80%的相似度，且具有DREB轉(zhuǎn)錄因子典型的纈氨酸（V14）和谷氨酸（E19），EsDREB2B屬于AP2/ERF蛋白亞家族，其他成員還包括CAP2、GmDREB2B、OsDREB2B和AtDREB2A，這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均具有抵抗干旱的作用，因此預(yù)測了EsDREB2B也具有抵抗干旱的作用。Lu等［27］將ZmSNAC1基因序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線Blast，找出與ZmSNAC1基因相似的序列，利用ClustalW軟件將這些相關(guān)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，同時(shí)根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示ZmSNAC1基因與OsNAC044、OsSNAC1基因和的相似度較高，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，OsNAC044、OsSNAC1基因具有抵抗干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫的作用，進(jìn)而推測ZmSNAC1基因也可能具有抵抗非生物脅迫的功能，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。Sun等［28］利用ClustalW軟件將 ENAC1與大豆、水稻等多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示ENAC1轉(zhuǎn)錄因子與OsDREB1A同源性最高。Liu等［29］利用系統(tǒng)進(jìn)化樹將苧麻（Boehmeria nivea L.）中32個(gè)全長的NAC轉(zhuǎn)錄因子與其他物種中的47個(gè)功能性的NAC蛋白同源關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示這79個(gè)NAC蛋白質(zhì)可分為8組。Cenci等［30］對(duì)香蕉（Musa acuminata L.）中的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了全基因組分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)室Li等［6］構(gòu)建進(jìn)化樹表明SlNAC1與擬南芥中AtNAC014親緣關(guān)系最近，通過閱讀AtNAC014相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)測SlNAC1響應(yīng)非生物脅迫。Yang等［7］的進(jìn)化樹結(jié)果顯示SlNAC2與PaNAC1親緣關(guān)系最大，通過閱讀PaNAC1相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)測SlNAC2響應(yīng)非生物脅迫。目前，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子功能，這一方法已經(jīng)十分成熟，操作簡單且預(yù)測結(jié)果可信度高，但該方法要求轉(zhuǎn)錄因子序列中要含有保守的結(jié)構(gòu)域，否則預(yù)測結(jié)果將不準(zhǔn)確。

5.2 表達(dá)特性分析推測轉(zhuǎn)錄因子功能

轉(zhuǎn)錄因子是否與植物抗逆相關(guān)，需要對(duì)逆境條件下轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析。利用半定量PCR（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)可以檢測脅迫條件下轉(zhuǎn)錄因子基因在不同組織、器官中隨脅迫時(shí)間變化的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)而確定轉(zhuǎn)錄因子是否與脅迫相關(guān)以及與哪種脅迫相關(guān)。Peng等［31］提取不同時(shí)間、不同條件脅迫處理下鷹嘴豆中CarNAC3基因的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板利用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明CarNAC3基因在盛開的花朵中相對(duì)表達(dá)量高，而在開花后15 d的植株的根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量較低。在脅迫條件下，CarNAC3基因表達(dá)量有明顯的升高，且在高溫1 h、干旱12 h、創(chuàng)傷1 h、水楊酸12 h、生長素1 h等脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量最大，因此CarNAC3基因與高溫、干旱等非生物脅迫相關(guān)。Tian等［32］分別在低溫脅迫下對(duì)紅掌中的AaDREB1、AaWRKY1和AaNAC1等基因進(jìn)行半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分析其表達(dá)量的變化，結(jié)果表明隨低溫處理時(shí)間加長，以上基因的相對(duì)表達(dá)量上升，有的在24 h表達(dá)量最高。Hu等［33］利用qRT-PCR技術(shù)分別檢測楊樹（Populus trichocarpa）中25個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在芽尖、葉、韌皮部、微分化木質(zhì)部以及根的成熟區(qū)和根尖的相對(duì)表達(dá)量，表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同組織器官中表達(dá)量有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)室Li［6］利用qRT-PCR技術(shù)分析遼寧堿蓬SlNAC1基因在非生物脅迫下的表達(dá)，SlNAC1基因受鹽、干旱、低溫及ABA誘導(dǎo)表達(dá)，推測SlNAC1基因與響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)。Yang等［7］利用qRT-PCR技術(shù)分析遼寧堿蓬SlNAC2基因在非生物脅迫下的表達(dá)，SlNAC2基因受鹽、干旱、低溫及ABA誘導(dǎo)表達(dá)，推測SlNAC2基因與響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)。半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR在檢測基因表達(dá)特性中應(yīng)用比較廣泛，為研究提供可靠的數(shù)據(jù)。該方法中材料RNA的提取十分關(guān)鍵，且相對(duì)于RT-PCR，qRT-PCR檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，對(duì)分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子抵抗生物及非生物脅迫響應(yīng)提供重要證據(jù)。

5.3 基因缺失表型分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子功能

基因缺失引起的表型變化最能體現(xiàn)基因的生理功能。基因功能缺失突變體的獲得通常采用插入法和反義RNA抑制法等。插入法將一段DNA插入到目的基因中，使目的基因不表達(dá)，包括轉(zhuǎn)座子插入法、T-DNA插入法和同源重組插入法。最常使用的是T-DNA插入法，T-DNA是質(zhì)粒上一段容易轉(zhuǎn)移到其他基因上的DNA，插入到基因中使目的基因無法表達(dá)，在擬南芥中應(yīng)用十分廣泛。Lacroix等［34］利用T-DNA插入法破壞WRKY17 基因，發(fā)現(xiàn)WRKY17 突變體植株農(nóng)桿菌更敏感，表明WRKY17 基因在農(nóng)桿菌侵染中發(fā)揮積極的作用。Lu等［35］將T-DNA插入到ATAF1基因，破壞其結(jié)構(gòu)，以標(biāo)簽基因 COR47、ERD10、KIN1、RD22 和RD29A的表達(dá)量變化檢測ATAF1的功能，結(jié)果顯示在干旱脅迫下ataf1-1突變體植株標(biāo)簽基因在2 h、3 h和5 h相對(duì)表達(dá)量更高，證明ATAF1轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫中發(fā)揮重要的作用。Paul等［36］檢測到插入了T-DNA的OsTEF1水稻，降低了60%-80%的分蘗，而且出現(xiàn)根部生長阻滯、對(duì)高鹽更為敏感。T-DNA插入法存在其局限性，若目的基因編碼區(qū)序列過短，T-DNA插入的概率較小，插入到非編碼區(qū)或內(nèi)含子中不一定會(huì)引起基因表達(dá)的完全缺失，只是使基因表達(dá)水平下降。T-DNA插入法主要局限性在于植物中有一定數(shù)量的基因是多拷貝的，有的甚至緊密地串聯(lián)在一起，通常不易獲得純合突變體。

反義RNA抑制技術(shù)又稱為RNA干擾（RNAi）技術(shù)，是將目的基因全部或部分的反向序列轉(zhuǎn)入植物中，轉(zhuǎn)錄時(shí)就會(huì)與目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成雜交雙鏈，阻止目的基因的表達(dá)，從而獲得功能缺失突變體植株。與RNAi相比，人工miRNA（Artificial microRNA，amiRNA）來源于RNA一個(gè)短的莖環(huán)，只產(chǎn)生一個(gè)單一的小的RNA，能更精準(zhǔn)的抑制相關(guān)靶基因的表達(dá)。目前已有Web MicroRNA designer（http：//wmd3.weigelworld.org）和THE RNAi WEB（http：//www.rnaiweb.com）工具用于amiRNA的設(shè)計(jì)。Song等［37］為檢測OsNAC5轉(zhuǎn)錄因子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，利用RNAi技術(shù)將水稻中OsNAC5基因敲除，與野生型水稻相對(duì)照，在干旱、高鹽、冷等脅迫條件下，敲除OsNAC5的水稻植株對(duì)脅迫具有更強(qiáng)的抵抗能力。基因缺失表型分析只適用于模式植物，對(duì)于一些非模式植物操作有困難。

5.4 基因過表達(dá)表型分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子功能

基因功能增加通常采用過表達(dá)法，又稱超表達(dá)法，是指在目的基因前加一個(gè)組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，如CaMV 35S啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化植物，使轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植物中大量表達(dá)，從而促進(jìn)下游基因的大量表達(dá)，從而改變轉(zhuǎn)基因植物的性狀，分析該轉(zhuǎn)錄因子的抗逆功能。Bouaziz等［38］利用基因過表達(dá)的方法證明，StDREB1基因的過量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對(duì)鹽脅迫的抵抗力，在鹽脅迫下植株能健康生長。Takaskki等［39］以CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsNAC5轉(zhuǎn)錄因子基因，轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥中過量表達(dá)，過表達(dá)的擬南芥植株在250 mmol/L NaCl溶液脅迫處理下，比較野生型抵抗力更強(qiáng)，證明OsNAC5具有抵抗高鹽脅迫的作用。Xiong 等［40］研究在OsMYB48-1基因過表達(dá)情況下，水稻增強(qiáng)了對(duì)干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)。Yu等［41］將鷹嘴豆中CarNAC2基因過表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱能力更強(qiáng)，但對(duì)種子的發(fā)芽具有延緩作用。本實(shí)驗(yàn)室獲得的過表達(dá)SlNAC1基因擬南芥的鹽、干旱、低溫耐受性增強(qiáng)［6］、過表達(dá)SlNAC2基因擬南芥［7］的抗鹽性增強(qiáng)，表明SlNAC1、SlNAC2能提高植物抗非生物脅迫的能力。

基因過表達(dá)鑒定植物的表型已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但也存在著一定的局限性。由于許多轉(zhuǎn)錄因子都是以蛋白復(fù)合體的形式行使功能，只過量表達(dá)其中的一個(gè)蛋白質(zhì)，植物一般不會(huì)發(fā)生明顯的表型變化，另外，由于有些基因的表達(dá)是轉(zhuǎn)錄因子和其他因素共同作用的結(jié)果，因此轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)也并不一定總是引起下游基因的變化。

5.5 下游相關(guān)基因分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子功能

轉(zhuǎn)錄因子行使生理功能的過程十分復(fù)雜，涉及轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的下游基因和與其相互作用的其他轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子下游基因的研究可以進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄因子的功能。

5.5.1 染色質(zhì)免疫沉淀-DNA基因芯片分析 染色質(zhì)免疫沉淀-DNA基因芯片（Chromatin immunoprecipitation-gene chip）是研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有效方法，可用于轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)靶基因的篩選。染色質(zhì)免疫沉淀是在活細(xì)胞狀態(tài)下用甲醇固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，用酶切或超聲波將復(fù)合物隨機(jī)切斷并分為一定大小的片段，利用特異性的抗體結(jié)合此復(fù)合體上的轉(zhuǎn)錄因子使其沉淀，通過水解釋放復(fù)合體中的DNA，即可得到目的DNA片段。利用基因芯片與目的DNA進(jìn)行雜交，可以獲得DNA序列信息。Zhu等［42］利用染色質(zhì)免疫沉淀-DNA基因芯片相結(jié)合的技術(shù)成功鑒定擬南芥和水稻中與BZR1轉(zhuǎn)錄因子直接作用的靶基因。

5.5.2 酵母單雜交分析 酵母單雜交也可以鑒定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游相關(guān)基因。其原理是將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子的cDNA與AD形成融合表達(dá)載體并導(dǎo)入酵母菌細(xì)胞中，該基因產(chǎn)物若能與順式作用原件（cis）結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得以表達(dá)，從而篩選出與已知轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的順式作用元件（圖4）。酵母單雜交方法是在細(xì)胞內(nèi)分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的有效方法，在基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究中是一個(gè)很有價(jià)值的工具，通過酵母單雜交可以在大范圍內(nèi)確定蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，實(shí)現(xiàn)高通量篩選。該方法雖然能快速分析轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合特性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性，但在綜合分析其功能具有一定局限性，因此需要與植株體內(nèi)功能分析相配合。

圖4 酵母單雜交分析原理示意圖

5.5.3 過表達(dá)植株基因表達(dá)變化分析 利用實(shí)時(shí)定量PCR分析轉(zhuǎn)錄因子基因過表達(dá)植株中已知脅迫相關(guān)基因的表達(dá)變化，可以分析該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游基因。Xiao等［43］利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測PeMYB2基因過表達(dá)擬南芥中與干旱脅迫相關(guān)的NXH1、SOS1、RD29A和 COR15A基因表達(dá)量有明顯上升，可推測PeMYB2基因與NXH1、SOS1、RD29A和 COR15A表達(dá)相關(guān)。Yu等［41］研究CarNAC2基因過表達(dá)時(shí)，RD22、RD29A、COR15A、KIN1在干旱情況下表達(dá)量也明顯上升，表明這4個(gè)基因可能是CarNAC2轉(zhuǎn)錄因子作用的下游基因。轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)可能使轉(zhuǎn)錄因子與不相關(guān)啟動(dòng)子中親和力較低的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而激活一些不相關(guān)基因的表達(dá)，因此很難估計(jì)哪些基因是受目的轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控，哪些基因受其間接調(diào)控。

基因芯片（Gene chip）可以分析轉(zhuǎn)錄因子基因過表達(dá)植株中基因表達(dá)的變化。構(gòu)建野生型植株、轉(zhuǎn)錄因子基因過表達(dá)植株的基因芯片，通過篩選分析轉(zhuǎn)錄因子基因過表達(dá)植株中上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證后，確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游基因。

6 展望

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育以及抵抗非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入、細(xì)致的研究，更好地理解轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能顯得尤為重要。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄因子的研究方法將不斷豐富，將極大推動(dòng)植物非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Methods of Abiotic Stress-related Transcription Factors in Plants

Su Mingxing Sun Yinghao Shi He Li Qiuli
（Key Laboratory of Plant Biotechnlogy of Liaoning Province， College of Life Sciences， Liaoning Normal University，Dalian 116081）

Transcription factor is a kind of proteins which bind to the cis element region of the promoters specifically and a kind of transcription regulatory factors， and it is also one of the biggest gene families in plants. Many transcription factors can regulate the expression of downstream genes， and play important roles on plant growth and development， morphogenesis， hormone adjustment， and resistance to a variety of biological and abiotic stress. In combination with the research progress of transcription factors in recent years， we have summarized main strategies and methods of transcription factors to the abiotic stress， including the transcription factor domain structure， subcellular localization and transcriptional activation， transcription factor complex and functions of transcription factors， to provide related research theories and methods to plant transcription factors for reference.

abiotic stress；transcription factor；transient expression；transcriptional activation；transgenic plants

2014-04-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31340052），遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013020069）

宿明星，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：sumingxing8866@163.com

李秋莉，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：skyliqiuli@163.com