熊鶴雯吳志慧段思宇謝皓秦玉濤郭蓓，3

（1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京　102206；2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京　102206；3.　農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) （北方） 重點(diǎn)開放實驗室，北京 102206）

大豆基因GmGW2的克隆與轉(zhuǎn)化

熊鶴雯1吳志慧1段思宇2謝皓1秦玉濤2郭蓓2，3

（1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) （北方） 重點(diǎn)開放實驗室，北京 102206）

GW2 編碼一個環(huán)型E3 泛素連接酶，位于細(xì)胞質(zhì)中，通過將其底物錨定到蛋白酶體進(jìn)行降解，從而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂。之前有文獻(xiàn)報道GW2位點(diǎn)突變可導(dǎo)致水稻籽粒大小的改變。根據(jù)水稻中GW2基因序列，在GenBank中找到與之同源的大豆基因序列GmGW2，克隆目的片段并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP，并對大豆品種中黃10進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用含有重組載體的農(nóng)桿菌EHA105侵染萌發(fā)24 h的中黃10幼胚。當(dāng)外植體長出3片復(fù)葉后，提取基因組DNA，對報告基因EYFP進(jìn)行PCR檢測。得到的陽性株在激光共聚焦顯微鏡下觀察，EYFP蛋白含量顯著增加，實驗結(jié)果顯示目的基因已轉(zhuǎn)化成功。序列分析表明GW2基因與苜蓿，鷹嘴豆中的GW2基因具有較高的同源性。

GmGW2；大豆；系統(tǒng)進(jìn)化樹；遺傳轉(zhuǎn)化；EYFP

產(chǎn)量一直是大豆育種最重要的性狀之一。大豆產(chǎn)量是一個綜合性狀，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，研究與產(chǎn)量密切相關(guān)的性狀或產(chǎn)量因素，是揭示產(chǎn)量性狀遺傳基礎(chǔ)的有效途徑。大豆產(chǎn)量主要影響因素可歸為三類：（1）光合生理有關(guān)性狀：生物量累積與分配、葉部性狀等；（2）產(chǎn)量因子：收獲指數(shù)、百粒重、莢數(shù)、節(jié)數(shù)及分枝性狀等；（3）倒伏性［1］；前二者是產(chǎn)量決定因素，后者是高產(chǎn)限制因素。目前對這三類產(chǎn)量主要影響因素的分子遺傳基礎(chǔ)研究尚需加強(qiáng)。

有研究報道，水稻中的GW2基因負(fù)責(zé)編碼一個環(huán)形E3泛素連接酶，是調(diào)控水稻粒寬和粒重的主效基因［2］。GW 2功能的缺失使得泛素不能被轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，因而導(dǎo)致本應(yīng)降解的底物不能被特異識別，進(jìn)而激活穎花外殼細(xì)胞的分裂，增加穎花外殼的寬度，另一方面，灌漿速率也間接地得到了提高，胚乳大小隨之得到了增加，最終谷殼的寬度、粒重以及產(chǎn)量都得到了增加［3，4］。

目前，除了在水稻中對GW2基因進(jìn)行了較深入的研究外，在大麥［12］、小麥［13，14］、玉米［15］中也有少量的研究，但至今未見在大豆中的研究報道。本實驗針對大豆中的GW2基因開展了初步的研究，期望能夠發(fā)現(xiàn)GmGW2是否與大豆產(chǎn)量相關(guān)，為將來利用基因工程技術(shù)手段培育出高產(chǎn)的新型大豆品種進(jìn)行有益的嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的大豆品種為中黃10，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，并在北京農(nóng)學(xué)院試驗地進(jìn)行繁育?？寺≥d體pMD18-T購自TaKaRa公司。農(nóng)桿菌菌株EHA105，表達(dá)載體pCAMBIA1300∷EYFP由本實驗室留存。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆與轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建 根據(jù)之前文獻(xiàn)中報道的水稻基因GW2的序列，在GenBank中與大豆基因組進(jìn)行序列比對，找到同源基因GmGW2（1 287 bp），其位于大豆基因組15號染色體上。根據(jù)GmGW2的mRNA序列設(shè)計引物。提取大豆品種中黃10的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段。將目的片段亞克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測序，然后用Kpn I與Eco R I雙酶切T載體，將切下的目的片段連入載體骨架pCAMBIA1300∷EYFP中，構(gòu)建出重組載體pCAMBIA1300∷GmGW2∷EYFP。

1.2.2 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染大豆幼胚 將含有目的片段的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，并做PCR鑒定，挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.8左右。

挑選數(shù)粒表面光滑無菌斑的成熟的大豆中黃10種子，置于干凈的培養(yǎng)皿中，噴灑75%酒精進(jìn)行表面消毒，置于通風(fēng)櫥中吹干，再用1%次氯酸鈉溶液噴灑種皮，再次置于通風(fēng)櫥中吹干。將消毒后的種子放在干燥器中，使用氯氣滅菌法（100 mL次氯酸鈉溶液加入4 mL濃鹽酸）［5］滅菌24 h。將滅菌后的大豆種子用無菌水沖洗，去除表面離子，放入盛有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，暗培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度25-28℃，光照強(qiáng)度為150 μmol×m-2×s-1［6］。將萌發(fā)的大豆種子除去種皮，并分開兩片子葉，去掉其中的一片，剩下的子葉要保留完整的胚。輕輕地去掉一片真葉，并在胚軸，子葉節(jié)處劃幾道傷口，以備侵染［7］。將外植體浸泡在之前制備的農(nóng)桿菌菌液中，15 min之后將外植體置于共培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后將外植體上的農(nóng)桿菌洗凈，栽植到花盆中，前期用保鮮膜覆蓋表面。后期定時澆水，每2周澆灌一次營養(yǎng)液［8］。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 使用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片的DNA進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系（20 mL）：ddH2O 13.5 mL，10×buffer 2 mL，2.5 mmol/L dNTPs 2 mL，10 mm引物各0.5 mL，模板DNA 1 mL（50-100 ng），Taq酶0.5 mL（5 u/mL）。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用于檢測EYFP（增強(qiáng)型黃色熒光蛋白）基因的引物為：EYFP-F：5'-GTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3'；EYFP-R：5'-TTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'，擴(kuò)增片段為717 bp。

1.2.4 激光共聚焦顯微觀察 激光共聚焦顯微鏡是以激光為光源，對觀察的樣品進(jìn)行斷層掃描和成像［9］，可以用于檢測熒光標(biāo)記。選擇PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因植株，摘取新鮮的葉片，制作徒手切片，在激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS SP5）下觀察EYFP的熒光信號。以野生型大豆中黃10為對照。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 將克隆基因的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行核酸序列和蛋白序列比對及CDD（Conserved domain database）分析［10］；GENSCAN掃描核酸序列上的編碼序列號，翻譯成蛋白序列；將蛋白序列與其他物種進(jìn)行比對，形成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆與載體構(gòu)建

以大豆中黃10 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），經(jīng)對亞克隆載體測序，擴(kuò)增出的GmGW2基因序列相比于GenBank中預(yù)測序列的相似度為96.03%。將目的片段回收后，連接至經(jīng)酶切的pCAMBIA1300∷EYFP載體上。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定。圖2顯示，在8個候選的克隆中有6個擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶，表明重組表達(dá)載體pCAMBIA1300∷GmGW 2∷EYFP已成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。

圖1 以大豆中黃10的cDNA為模板擴(kuò)增GmGW2

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定

2.2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

將構(gòu)建好的重組載體pCAMBIA1300∷GmGW-2∷EYFP熱激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，挑取PCR檢測陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為0.8，將上述菌液浸泡外植體，置于共培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)入土培。2-3周后，提取幼嫩葉片基因組DNA，PCR鑒定出陽性植株（圖3），結(jié)果表明已將目的基因轉(zhuǎn)到大豆中黃10中。

圖3 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因大豆植株

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

將PCR鑒定陽性的大豆中黃10轉(zhuǎn)基因植株與野生型一起進(jìn)行盆栽培養(yǎng)（圖4），每2周澆灌營養(yǎng)液，培養(yǎng)至開花。其間摘取新鮮葉片，制作徒手切片，放至激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖5），激發(fā)光波長為514 nm［11］。比較野生型和轉(zhuǎn)基因中黃10的葉片組織，可以明顯看到在轉(zhuǎn)基因植株葉片上有強(qiáng)烈的YFP熒光信號，而野生型葉片上并未出現(xiàn)熒光信號。由此進(jìn)一步證實了目的基因已成功轉(zhuǎn)入受體植株中。

圖4 轉(zhuǎn)入盆栽培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植株與野生型中黃10植株

圖5 激光共聚焦顯微鏡下切片觀察

2.4 序列分析

對GmGW2測序結(jié)果分析表明，該基因具有完整的CDS區(qū)，長度為1 287 bp。利用GENSCAN掃描核酸序列上的編碼序列號，翻譯成蛋白序列（圖6）。利用推測的蛋白序列檢索NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)翻譯蛋白從第50-100個氨基酸中含有一個RING 型結(jié)構(gòu)域（圖7）。進(jìn)一步證明此基因是一個編碼新型E3泛素連接酶的基因。

圖6 GW 2蛋白序列

圖7 特異片段蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

將GmGW 2氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blastx分析，并利用DNAMAN軟件將其氨基酸序列與其他物種中編碼GmGW 2的氨基酸序列進(jìn)行多重比對（圖8），構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9），進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明GmGW2氨基酸序列與苜蓿（XP_003622248.1）和鷹嘴豆（XP_004488643.1）的GW 2分別有62%和84%的相似性。

圖8 GmGW2基因多重序列比對結(jié)果

3 討論

實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，大豆在無菌水中萌發(fā)的時間比較關(guān)鍵，以24 h左右為宜，時間過長將會使胚芽從子葉上脫離；時間太短，胚芽過分幼嫩不利于操作。農(nóng)桿菌侵染的時間以15 min為宜，時間過長對外植體傷害較大，使種子萌發(fā)率明顯下降，時間過短則不利于農(nóng)桿菌侵染，影響轉(zhuǎn)化率。制備侵染菌液時加入了silweet-77，實驗中增加了共培養(yǎng)環(huán)節(jié)，這些有助于農(nóng)桿菌的生長及進(jìn)入外植體，以提高轉(zhuǎn)化率。

圖9 GmGW2基因進(jìn)化樹

通過對轉(zhuǎn)基因植株T0代表現(xiàn)型的初步觀察發(fā)現(xiàn)，植株呈現(xiàn)矮小，生育期提前等特點(diǎn)，分析認(rèn)為，出現(xiàn)這種情況可能是因為外植體經(jīng)過了農(nóng)桿菌侵染后受到一定程度傷害，長勢與野生型植株相比較差。為能夠比較準(zhǔn)確地看到轉(zhuǎn)基因植株的表型變化，需要進(jìn)一步繁殖轉(zhuǎn)基因后代，獲得相對穩(wěn)定遺傳個體，以便判斷GmGW2過量表達(dá)對受體的影響。

本研究將目的基因與pCAMBIA1300∷EYFP載體連接，利用載體上具有的增強(qiáng)型報告基因YFP，使轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定更加快捷方便，同時黃色熒光蛋白可以很好地排除植物的綠色背景干擾，使轉(zhuǎn)基因的檢測結(jié)果更加直觀，明顯。與此同時，我們還將克隆的目的基因進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼E3泛素連接酶，且與其他物種（苜蓿，鷹嘴豆）中的GW2基因具有比較高的同源性。有關(guān)該基因的相應(yīng)功能有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究利用已發(fā)表的水稻GW2基因序列，在GenBank中找到與之同源性較高的大豆基因GmGW2，克隆測序結(jié)果表明與GenBank中預(yù)測序列相似度達(dá)到96.03%。用克隆片段構(gòu)建出重組表達(dá)載體pCAMBIA1300∷GmGW 2∷EYFP，并通過萌發(fā)種子的方法轉(zhuǎn)化至大豆品種中黃10中。對陽性的植株進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，可見轉(zhuǎn)基因植株中報告基因YFP的表達(dá)量極明顯地增加。通過對GmGW2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其編碼E3泛素連接酶，具有保守的環(huán)形結(jié)構(gòu)，進(jìn)化樹分析顯示其與苜蓿和鷹嘴豆的同源性較高。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Transformation of Gene GmGW2 in Soybean

Xiong Hewen1Wu Zhihui1Duan Siyu2Xie Hao1Qin Yutao2Guo Bei2，3
（1. College of Plant Science and Technology，Beijing102206；2. College of Biological Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing102206；3. Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture China，Beijing102206）

GW2 encodes a previously unknown RING-type protein with E3 ubiquitin ligase activity， which is located in cytoplasm. It is known to function in the degradation by the ubiquitin-proteasome pathway. Loss of GW2 function increased cell numbers. It was reported that the mutation of GW2 lead to change the size of rice seeds. According to rice GW2 gene sequence， blast in the NCBI， we found a soybean GW2 gene which is homologous. We cloned the target gene and carried on bioinformatics analysis， then we constructed a over-expression vector pCAMBIA1300∷GmGW 2∷EYFP， and transformed into soybean named zhonghuang10 by Agrobacterium-mediated method. Seeds were germinated on sterile moistened paper towels in Petri dishes for 24 h then infected the immature embryo by Agrobacterium EHA105 which obtained recombining vector. When the explants have 3 compound leaves， we extract the genome DNA and PCR identified the report gene EYFP. The content of EYFP is enhanced in PCR positive plant was observed by LSCM. It is demonstrated the transformation of target gene is successful. The sequence analysis showed that the target gene have higher homology with those of Alfalfa and Gram.

GmGW2；soybean；phylogenetic tree；transformation；EYFP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.012

2014-11-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目（2012AA101106）

熊鶴雯，女，碩士研究生，研究方向：大豆分子遺傳育種；E-mail：344356549@qq.com

郭蓓，女，教授，研究方向：植物分子遺傳育種；E-mail：guobeibac@tom.com