蘇甲林闕彪張繼勤李錦輝王敏紀衛(wèi)東

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東省泌尿外科重點實驗室，廣州　510230；2.中山大學附屬第一醫(yī)院，廣州　510080）

建立CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)高效敲除人源AIP1基因

蘇甲林1闕彪1張繼勤2李錦輝1王敏2紀衛(wèi)東2

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東省泌尿外科重點實驗室，廣州510230；2.中山大學附屬第一醫(yī)院，廣州510080）

旨在構建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除體系，獲得高效、穩(wěn)定、永久性AIP1敲除的人胚腎細胞株（293T）。針對AIP1的外顯子設計3個20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）。與PX458載體連接，構建PX458-sgRNA敲除表達載體。T7E1實驗評估敲除效率。將敲除效率最高的sgRNA與lentiCRISPRv2慢病毒載體連接，構建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表達載體，將陽性重組質粒導入病毒包裝細胞293T中，收集病毒上清液轉染293T細胞。對敲除成功的293T細胞通過有限稀釋法構建敲除AIP1基因的穩(wěn)定細胞株。Western blot測定轉染后293T細胞中AIP1蛋白的表達量。結果顯示，測序證實AIP1的3個靶序列分別正確插入PX458表達載體中，T7E1實驗證實AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高；成功構建lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1敲除表達載體，并包裝病毒，感染293T細胞；Western blot證實獲得穩(wěn)定的AIP1基因表達缺失的293T細胞株。建立了能穩(wěn)定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)，成功獲得AIP1敲除的293T穩(wěn)定細胞株。

CRISPR/Cas9；慢病毒；AIP1；穩(wěn)定細胞株

AIP1（Apoptosis signal-regulating kinase 1-interacting protein-1，又稱為DAB2IP）是近來鑒定的Ras-GTP酶活化蛋白家族新成員，其基因定位于人染色體9q33.1-9q33.3上，含有1個開放閱讀框架，cDNA全長6.3 kb，編碼1 065個氨基酸、分子量為120 kD左右的蛋白質。AIP1蛋白的N端有參與膜蛋白定位的PH結構域、細胞信號凋亡調節(jié)酶1結合有關C2結構域和抑制Ras信號通路的GAP結構域；C端有抑制核轉錄因子NF-κB信號通路有關的PER結構域和調控PI3K-Akt信號通路的PR結構域［1］。AIP1是新發(fā)現的一種抑癌基因，它通過介導多種腫瘤相關信號通路，如MAPK-ERK、PI3K-Akt、ASKl-JNK和GSK-3β-β-catenin等，影響細胞的增殖、存活和凋亡［2-4］。研究發(fā)現AIP1在前列腺癌、肝細胞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5-9］。

目前，普遍使用基因敲減技術敲低目的細胞AIP1基因研究AIP1基因功能，但是基因敲減技術僅影響mRNA降解，不能完全沉默目的細胞AIP1基因的表達，對充分研究AIP1基因功能有一定的局限性。本實驗利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建AIP1基因敲除質粒，并用慢病毒系統(tǒng)進行包裝，旨在建立CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)敲除人源性細胞系AIP1基因的方法，為深入研究AIP1基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞株（293T）購于美國ATCC細胞庫，PX458和lentiCRISPRv2質粒購于Addgene公司，Bbs I酶、Bsm B I酶、T4 DNA連接酶和T7E1酶購自New England Biolabs（NEB）公司，質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司，DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司，Lipofectamine? 2000試劑、高糖.DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco公司，寡核苷酸序列由上海捷瑞公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA寡核苷酸鏈合成 我們使用CRISPR在線設計工具（http：//crispr.mit.edu/）根據評分系統(tǒng)，分別在AIP1的外顯子6和16設計3個20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）（圖1）。分別在編碼鏈模板5'端添加CACCG，非編碼鏈模板5'端添加AAAC，3'端添加C，設計3對CRISPR寡核苷酸鏈，由上海捷瑞公司合成。設計sgRNA及序列見表1。

圖1 CRISPR/Cas靶序列在AIP1基因的位點及擴增靶序列位點引物示意圖

表1 AIP1靶向位點及sgRNA寡核苷酸序列

1.2.2 載體構建 將兩條sgRNA寡核苷酸單鏈化學合成雙鏈，連接至Bbs I酶切線性化的PX458質粒；轉化到stbl3感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆菌落抽提質粒并送廣州艾基生物測序驗證。將重組質粒分別命名為：PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3。將sgRNAsp2與Bsm B I酶切后的lentiCRISPRv2載體使用上述方法連接，并測序驗證。

1.2.3 敲除效率驗證 細胞培養(yǎng)和細胞轉染：293T細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)。轉染前24 h，取對數期細胞以5×105/孔接種到6孔板培養(yǎng)，將其分組為：PX458（陰性對照組）、PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3。將相應的敲除質粒及陰性對照質粒各2 μg經Lipofectamine? 2000試劑瞬時轉染到293T細胞中，轉染48 h后消化收集各組細胞，提取基因組DNA。采用T7E1實驗進一步驗證敲除效率：根據BLAST分別設計3條靶向序列的引物（表2）。PCR擴增目的片段，純化后使用PCR儀進行變性退火。加入10 U T7E1酶，37℃水浴15 min，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA終止反應。使用2%的瓊脂糖凝膠DNA電泳，檢測敲除效率。

1.2.4 慢病毒載體包裝 將重組質粒lentiCRISPRv2-sgRNAsp2和lentiCRISPRv2空載體各1.2 μg分別與包裝質粒pCMV-R8.2 0.6 μg及輔助質粒VSV-G 1.2 μg混合，分別穩(wěn)定轉染293T細胞；轉染12 h后，棄去培養(yǎng)基，加入3 mL培養(yǎng)基置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后收集，0.45 μm濾器過濾并分裝病毒上清液。加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后再次收集含病毒上清液的培養(yǎng)基。-80℃保存。

表2 擴增靶序列引物

1.2.5 嘌呤霉素對293T細胞的最小致死量篩選 將293T細胞種入6孔板培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時，按照下列濃度加入嘌呤霉素（μg/mL）：0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5，隔天換液，并保持培養(yǎng)基的嘌呤霉素濃度恒定。第3天能夠使293T細胞全部死亡的最小濃度為1.0 μg/mL。

1.2.6 構建穩(wěn)定細胞株 待293T細胞融合度達到50%時更換1 mL培養(yǎng)基，加入1 mL病毒上清液和1.6 mL polybrene（終濃度8 μg/mL），6 h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后重復感染一次，感染完畢后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后加入嘌呤霉素（1.0 μg/mL），維持嘌呤霉素濃度7 d，對于篩選出的陽性克隆，消化收集各孔細胞并計數，采用有限稀釋法稀釋至終濃度為每100 μL培養(yǎng)基0.5個細胞，按每孔200 μL細胞稀釋液加至96孔板［10］。顯微鏡下觀察只含有單個細胞的孔并標記。待單個細胞生長至細胞團時逐級擴大培養(yǎng)，取少量細胞提取基因組DNA，經PCR擴增后測序與野生型基因組對比，檢測AIP1是否成功敲除。對缺失突變堿基最多的細胞株進行擴大培養(yǎng)，提取細胞蛋白，Western blot 檢測單克隆細胞AIP1蛋白表達量。

2 結果

2.1 重組質粒載體的檢測結果

分別在AIP1的3條靶序列添加粘性末端，化學合成sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3與酶切后的PX458質粒連接，轉化到stbl3感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆菌落抽提質粒。廣州艾基生物公司測序結果（圖2）顯示，sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3分別正確插入pX458載體中。

2.2 AIP1靶向序列的篩選

將PX458空載體及PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3分別瞬時轉染至293T細胞，轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察4組293T細胞都有綠色熒光蛋白表達（圖3），消化收集各組細胞，提取基因組DNA。PCR擴增含有sgRNA的目的片段，純化后加入T7E1酶反應，瓊脂糖凝膠DNA電泳發(fā)現與對照組比較sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3都有兩條切開的條帶，其中sgRNAsp2切開效果最顯著，表明AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高（圖4）。

2.3 構建敲除AIP1基因的293T穩(wěn)定細胞株

為了提高轉染效率，將sgRNAsp2連接到lentiCRISPRv2慢病毒質粒，和空載體分別轉染至293T細胞，收集病毒液，感染正常293T細胞，嘌呤霉素篩選出陽性克隆，有限稀釋法稀釋至單個細胞，逐級擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)出6個單克隆穩(wěn)定細胞株與其野生型基因組DNA比較，發(fā)現目的片段中出現了不同堿基數的缺失突變和插入突變（圖5）。

對缺失突變堿基最多的細胞株和轉染空載體細胞株進行擴大培養(yǎng)，提取細胞蛋白，Western blot檢測敲除AIP1基因的293T細胞與對照組比較，發(fā)現AIP1蛋白表達缺失（圖6），表明已敲除393T細胞中AIP1基因。

3 討論

隨著生物學研究的發(fā)展，基因組編輯技術為了解特定基因的功能提供了基礎。目前ZFNs和TALENs技術突破了傳統(tǒng)的基因組定點編輯，但其具體操作對實驗要求較高，耗時較長，較難廣泛普及。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對任何后面緊隨NGG（PAM）的20 bp的序列進行編輯，能同時作用于多個靶位點［11］。此外，載體構建簡單，針對特定基因位點只需要設計sgRNA，不需要對每個基因編輯位點都設計和組裝兩個核酸酶。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡單靈活、特異性高、細胞毒性低等特點，可以對特定基因組位點進行切割置換［12］。與RNAi技術比較，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過RNA識別DNA 序列然后再改變DNA序列是可以遺傳的［13］。本研究構建的lentiCRISPRv2-sgRNAsp2質粒攜帶有化膿性鏈球菌Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)的Cas9核酸內切酶基因，在轉染進細胞后可以表達該核酸內切酶。通過T7E1實驗檢測sgRNA靶位點的切割效率，發(fā)現sgRNAsp2在AIP1基因目的位點產生切割的效率高達51.8%。連接sgRNAsp2到慢病毒lentiCRISPRv2載體，更高效穩(wěn)定的轉入293T細胞。在細胞亞克隆中，有6個單克隆細胞基因組在目的片段中出現了不同堿基數的突變。對缺失突變堿基最多的細胞株進行擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定敲除AIP1的293T細胞株。

圖2 質粒序列測序圖

圖3 PX458空載及3組PX458-sgRNA轉染至293T細胞

圖4 檢測3個sgRNA的靶向敲除效率

圖5 單克隆細胞在目的sgRNA位點的缺失突變

圖6 穩(wěn)定細胞株中AIP1蛋白的表達

將目的基因連接到載體并轉染至目的細胞是獲得長期穩(wěn)定表達細胞株的關鍵步驟。目前，轉染目的細胞常用的基因導入載體主要是質粒載體和病毒載體。質粒載體適用于短時間的活細胞示蹤，轉染率相對較低，且對目的基因干預作用弱。與質粒載體相比，病毒載體具有轉染率高、目的基因長期穩(wěn)定表達及適用范圍廣等優(yōu)勢。因此，越來越多的研究人員更傾向于使用病毒載體轉染，包括腺病毒、慢病毒和逆轉錄病毒3種表達系統(tǒng)，其中慢病毒載體系統(tǒng)適用細胞類型廣泛，可穩(wěn)定轉染目的基因，能整合外源基因進入目的細胞達到穩(wěn)定表達，是目前基礎和臨床應用研究中使用最廣泛的一類載體。本實驗利用慢病毒載體系統(tǒng)轉染293T細胞具有較高的轉染率，成功的獲得長期、穩(wěn)定敲除AIP1基因的細胞株。

最近研究發(fā)現，AIP1作為一個新發(fā)現的抑癌基因，不僅在腫瘤細胞的增殖存活和凋亡過程中扮演著重要角色，還參與調控動脈硬化、腹主動脈瘤及早發(fā)性心肌梗死等多種非腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展［14，15］。本研究構建目的細胞AIP1基因敲除的細胞系，是深入研究AIP1基因功能的前提基礎。

4 結論

本研究結合慢病毒系統(tǒng)的穩(wěn)定轉染功能和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的敲除功能，建立了CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)，充分發(fā)揮了慢病毒包裝系統(tǒng)與Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢，永久性敲除目的細胞AIP1基因，獲得敲除AIP1基因的穩(wěn)定細胞株。證實了CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)的可行性，為進一步構建其他AIP1基因敲除的人源性細胞系提供了一種簡單、高效的方法。

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（責任編輯 馬鑫）

Establishment of a CRISPR/Cas9 Lentiviral System for Knockout Gene AIP1 of Human

Su Jialin1Que Biao1Zhang Jiqin2Li Jinhui1Wang Min2Ji Weidong2
（1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Key Laboratory of Urology，Guangzhou510230；2. The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou510080）

This work aims to establish the CRISPR/Cas9 system of knocking out gene AIP1 for producing nephocyte cell（293T）of human embryo in which gene AIP1 efficiently， stably and permanently is knocked out. Three 20 bp sgRNAs（sp1， sp2 and sp3）targeting AIP1 exons were designed and inserted in PX458 vector to construct PX458-sgRNA expression vector for knockout. CRISPR/Cas9 efficiency of knockout was assessed using T7E1 assay. sgRNA of the maximum knockout efficiency was inserted into lentiCRISPRv2 vector to construct lentiCRISPRv2-sgRNA expression vector. The correct recombinant plasmid was transfected into 293T cells. The supernatant was collected and filtered， and then infected the 293T cells. The stable 293T cell lines were generated by limiting diluting the cells in which genes AIP1 were knocked out successfully. The expression level of AIP1 in the stable 293T cells were detected by Western blot. Three sgRNAs of AIP1 were correctly inserted into PX458 vector respectively， T7E1 verified that the knockout rate of AIP1sgRNAsp2 was the maximum. LentiCRISPRv2-sgRNAsp2 expression vector of AIP1-knockout was successfully constructed， and infected 293T cells. The stable 293T cell lines with AIP1-expression-deficient were obtained by Western blot. In conclusion， the stable 293T cell lines of AIP1-knockout were successfully generated by CRISPR/Cas9 system， which provides the foundation for further studying the functions of AIP1 gene.

CRISPR/Cas9；lentiviral；AIP1；stable cell lines

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.032

2015-04-14

國家自然科學基金項目（81272350，81472999）

蘇甲林，男，學士，研究方向：泌尿系腫瘤與表觀遺傳學；E-mail：sujialin125@126.com

紀衛(wèi)東，男，博士，研究方向：泌尿系腫瘤與表觀遺傳學；E-mail：wdji2008@163.com