陳春琳 劉祥 俱雄

（陜西理工學院生物科學與工程學院，漢中　723001）

重組綠膿桿菌外膜蛋白OprF的表達、純化及多克隆抗體制備與鑒定

陳春琳 劉祥 俱雄

（陜西理工學院生物科學與工程學院，漢中723001）

綠膿桿菌外膜蛋白OprF可有效激活機體的免疫機制對抗細菌的感染，在疫苗上有很好的應用前景。采用分子克隆方法獲得綠膿桿菌外膜蛋白OprF表達菌株；利用SDS-PAGE電泳切膠純化、尿素梯度復性獲得OprF蛋白，免疫小鼠制備OprF蛋白多克隆抗體。ELISA法表明，OprF抗血清滴度達1∶12 800倍，Western blotting證實抗血清具有很好的特異性。通過DNAMAN軟件對OprF序列同源性分析發(fā)現(xiàn)其C端在不同細菌間存在較高同源性；采用MEGA軟件對OprF的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細菌的親緣關(guān)系高于其它屬細菌。

OprF蛋白；多克隆抗體；酶聯(lián)試驗；Western blotting；系統(tǒng)發(fā)生分析

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa），又名銅綠假單胞菌，自然界分布廣泛，常存在于人與動物的皮膚和腸道上，是一種人獸共患病原菌。當動物體重大疾病創(chuàng)傷、免疫缺陷，以及身體燒傷后，易誘發(fā)該病的感染［1，2］。目前，由于抗生素的大量使用，綠膿桿菌耐藥性不斷提高，對該菌感染的治療產(chǎn)生一定的影響［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)免疫原性較強的綠膿桿菌外膜蛋白有OprF（Outer membrane lipoprotein）、OprI和OprH［5］。其中，OprF為細胞外膜孔道蛋白，具有兩種不同大小的孔徑結(jié)構(gòu)，在抗生素耐藥性和維持細胞穩(wěn)定性上起重要作用［6］；可激活機體特異性免疫反應，從而抵抗綠膿桿菌的感染［7，8］，在疫苗上具有很好的應用前景［9］。

本實驗利用分子克隆方法獲得綠膿桿菌OprF原核表達菌株；純化OprF蛋白，制備和鑒定OprF蛋白多克隆抗體；并對OprF進行系統(tǒng)進化分析，旨在為OprF蛋白功能與疫苗開發(fā)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 P. aeruginosa PAO1菌株，E.coli DH5α菌株，E. coli BL21菌株，pET-28a質(zhì)粒均由陜西理工學院生物化學分子實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 昆明鼠購于漢中市動物交易中心。

1.1.3 試劑 蛋白胨、IPTG、酵母粉，以及瓊脂糖購于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Protein Marker，以及DNA Marker均為寶生物公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒為上海生物工程公司；引物合成、基因序列測定均由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司完成；山羊抗小鼠IgG二抗購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI公布的綠膿桿菌基因序列，設計oprF基因引物：Primer 1：5'-ACAGGATCCATGAAACTGAAGAACACC-3'；Primer 2：5'-AGTCTCGAGTTACTTGGCTTCAGCTTC-3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶位點Bam H I和Xho I。50 μL的PCR反應體系：PCR反應緩沖液5 μL，模板DNA 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，補水至50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃充分延伸10 min；最后16℃保溫。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片段大小，膠回收試劑盒回收目的DNA片段。再將PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒載體利用Bam H I和Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，提取重組質(zhì)粒進行Bam H I和Xho I雙酶切鑒定及測序鑒定，檢驗正確后轉(zhuǎn)化E. coli BL21表達菌株，制備OprF原核表達菌株。

1.2.2 重組蛋白的表達檢測 將鑒定正確的OprF表達菌株單克隆過夜培養(yǎng)，以1∶100倍轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600≈0.6時，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)5 h，離心收集1 mL菌體，加入200 μL上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL，SDS-PAGE蛋白電泳檢測OprF蛋白表達情況。

1.2.3 重組蛋白的純化 由于OprF的表達蛋白主要以包涵體形式存在，因此采用SDS-PAGE蛋白電泳切膠純化OprF比較合適，主要步驟為：大量培養(yǎng)獲得OprF表達菌株，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）緩沖液超聲破碎，沉淀用洗滌液（含0.05% Triton X-100的Tris-HCl溶液）洗滌后，將包涵體溶解于8 mol/L尿素溶液中；進行SDS-PAGE蛋白電泳，切下目的條帶，研缽中研磨后加入蛋白浸提液（含0.1% SDS的Tris-HCl溶液），4℃浸提過夜，離心收集上清，加入1∶4（V/V）的丙酮沉淀蛋白，離心除去丙酮后加入50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）的蛋白溶解液，最后取適量溶液電泳檢測蛋白的純度與濃度。

1.2.4 重組蛋白的復性 SDS-PAGE電泳切膠純化獲得的OprF蛋白無生物學活性，可采用尿素濃度梯度的方法復性蛋白，主要步驟為：將純化的OprF蛋白溶解于8 mol/L尿素溶液，置透析袋中，再將其放入含6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置4 h；接著依次為4、2、1和0.5 mol/L尿素，最后置于50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置4 h；然后離心取上清溶液，取2 μL溶液進行SDSPAGE蛋白電泳檢測。

1.2.5 重組蛋白小鼠多克隆抗體的制備 選用約5周齡的雄性昆明鼠6只，每只免疫純化的OprF蛋白50 μg/每次。首次免疫采用弗氏完全佐劑，之后均采用弗氏不完全佐劑。將佐劑與OprF蛋白充分乳化，直至冰水中不擴散為止。首次免疫10 d后進行第2次免疫，7 d后進行第3次加強免疫。第3次免疫7 d后，小鼠眼球取血的方法獲得血清，置于4℃冰箱中過夜析出，離心取上清，最后將血清保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.6 ELISA法檢測抗體效價 利用ELISA酶聯(lián)法檢測抗血清效價，主要步驟為：將復性的OprF蛋白溶解至0.05 μg/μL，于對應的96孔板中加入100μL，37℃作用1 h，排空液體，加入200 μL封閉液，37℃孵育2 h，然后每孔加100 μL不同稀釋度的小鼠一抗血清（對照加入PBS溶液），并且同一稀釋度血清采用3個重復；37℃孵育30 min；洗滌后加入100 μL二抗，37℃孵育30 min；加入50 μL底物A（雙氧水）與50 μL底物B（TMB）的混合液，37℃避光顯色10 min，最后加入終止液，450 nm讀數(shù)［10］。

1.2.7 Western blotting法檢測抗體特異性 Western blotting顯色方法檢測小鼠OprF抗血清特異性［11］。為消除pET-28a質(zhì)粒上自帶的His標簽蛋白所產(chǎn)生抗體的影響，采用綠膿桿菌OprF蛋白進行特異性檢測。主要步驟為：收集培養(yǎng)的綠膿桿菌，加入上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL進行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)NC膜，與不同稀釋度的小鼠抗血清（對照加入陰性抗血清）相作用，洗滌后，加入二抗孵育，最后DAB顯色，確定OprF抗血清的特異性。

1.2.8 OprF蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的細菌OprF蛋白氨基酸序列，利用DNA MAN軟件進行同源性分析；通過MEGA5.02軟件，并結(jié)合Neighbour-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹［10］。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以綠膿桿菌基因組為模板，進行PCR擴增oprF基因。獲得約1 053 bp的基因片段，與目的基因大小一致（圖1）。將pET-28a質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物進行雙酶切后，連接酶連接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α菌株，提取重組質(zhì)粒，雙酶切檢測獲得約1 053 bp片段（圖2），與目的基因大小一致。此外，重組基因的測序結(jié)果顯示與NCBI公布的基因序列一致。

圖1 綠膿桿菌oprF基因PCR擴增

圖2 OprF重組質(zhì)粒的雙酶切檢測

2.2 重組蛋白的表達檢測與蛋白純化

將檢測確認的含有OprF重組質(zhì)粒的菌株經(jīng)過IPTG誘導，SDS-PAGE電泳獲得約38 kD的蛋白條帶，重組蛋白表達大小情況與預期一致；并利用SDSPAGE蛋白電泳切膠的方法獲得OprF蛋白，經(jīng)尿素梯度復性獲得純化的OprF蛋白（圖3）。

圖3 OprF蛋白的表達與純化

2.3 OprF蛋白的小鼠抗血清效價檢測

將純化的OprF蛋白免疫小鼠，獲得的抗血清經(jīng)ELISA法檢測。結(jié)果（圖4）表明，其抗體效價達到1∶12 800倍。

2.4 OprF蛋白小鼠抗血清的特異性檢測

利用Western blotting顯色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌株與不同稀釋度的OprF抗血清作用后有蛋白條帶顯現(xiàn)，而對照組未出現(xiàn)（圖5），表明OprF小鼠多克隆抗體特異性較好。

圖4 OprF多克隆抗體效價的檢測

圖5 W estern blotting檢測OprF多克隆抗體特異性

2.5 OprF蛋白的氨基酸序列分析

利用DNAMAN軟件，對NCBI公布的10種細菌的OprF蛋白氨基酸序列進行同源性分析，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)不同的細菌OprF存在較高的同源性，尤其C端不同種細菌同源性更高；假單胞菌屬細菌的同源性明顯高于其它屬細菌（食烷菌）。采用MEGA軟件構(gòu)建的OprF系統(tǒng)進化樹結(jié)果（圖7）顯示，假單胞菌屬的親緣關(guān)系相對于食烷菌更近。

圖6 OprF蛋白氨基酸序列的多重比對

3 討論

綠膿桿菌是醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一［12，13］，其耐藥性的不斷增加，給防治帶來一定的困難［14］。OprF為綠膿桿菌主要外膜蛋白之一，具有很強的免疫原性［5，15］，動物免疫實驗表明其激活機體產(chǎn)生的特異性免疫能有效抵抗綠膿桿菌的感染［7，8］；且自身無耐藥性等特點［16，17］，在疫苗上具有研究價值。然而，獲得抗體是OprF蛋白免疫學功能研究的基礎。有實驗成功制備了OprF的單克隆抗體，但制備程序復雜［18］，某些實驗也無需使用單抗。多克隆抗體以其成本低、周期短及效果好等優(yōu)點得到廣泛運用［19］。目前，使用原核表達蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體仍是最常見的手段之一［20］。本實驗利用分子方法獲得OprF原核表達載體，純化OprF蛋白，并成功制備與鑒定多克隆抗體；但獲得的抗體滴度較低，因而采用多只小鼠免疫的方式，以抵消滴度低的影響。為進一步研究OprF蛋白免疫學功能奠定基礎。

圖7 MEGA軟件構(gòu)建的OprF氨基酸序列系統(tǒng)進化

OprF蛋白具有重要的生物學功能，在遺傳進化上具有相對保守性。本研究通過OprF系統(tǒng)進化研究證實不同菌株的氨基酸序列具有很高的同源性，并且C端同源性更高，這可能與其執(zhí)行特定的功能有關(guān)；研究還證實假單胞菌屬細菌的同源性高于其他屬的細菌。這些發(fā)現(xiàn)為OprF蛋白的交叉免疫保護作用研究提供依據(jù)。因而，可結(jié)合后續(xù)的免疫攻毒保護實驗，為開發(fā)廣譜抑菌的OprF蛋白疫苗制劑研究奠定基礎。

4 結(jié)論

利用分子克隆方法獲得綠膿桿菌外膜蛋白OprF表達菌株；通過SDS-PAGE電泳切膠純化、尿素梯度復性獲得OprF蛋白，免疫小鼠制備OprF蛋白多克隆抗體。ELISA法結(jié)果顯示，OprF抗血清滴度達1∶12 800倍，Western blotting證實抗血清具有很好的特異性。采用DNAMAN軟件對OprF序列同源性分析發(fā)現(xiàn)其C端在不同細菌間存在較高同源性；MEGA軟件對OprF的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細菌的親緣關(guān)系高于其它屬細菌。

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（責任編輯 馬鑫）

Expression and Purification of Outer M embrane Lipoprotein OprF in Recombinant Pseudomonas aeruginosa，and Preparation and Identification of Polyclonal Antibody

Chen Chunlin Liu Xiang Ju Xiong
（College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong723001）

The outer membrane lipoprotein of Pseudomonas aeruginosa（OprF）could antagonize bacterial infection by efficiently activating body immunologic mechanism， and therefore has an important perspective in vaccine development. The expression strain for OprF protein of P. aeruginosa was obtained by molecular clone；OprF protein was purified by the way of SDS-PAGE gel extraction and urea gradient renaturation， and the purified protein was used to immunize mice to prepare the polyclonal antibody. The titer of OprF antibody was 1∶12 800 according to ELISA， and Western blotting proved that the antiserum had good specificity. Homology analysis of OprF by DNAMAN showed that the C-terminal regions shared high homology in different bacteria. Phylogenetic analysis by MEGA revealed that genetic relationship with Pseudomonas genus bacteria was higher than that with others.

OprF protein；polyclonal antibody；ELASA；Western blotting；phylogenetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.031

2015-03-20

陜西省教育廳科學研究計劃（2013JK0723），陜西理工學院人才啟動項目（SLGQD13-15）

陳春琳，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：chen2362505579@163.com

劉祥，男，博士，碩士生導師，研究方向：蛋白質(zhì)組學與免疫學；E-mail：liuxiang888525@163.com