程知慶 沈和定 姚理想 刁亞 劉宸

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上?！?01306）

瘤背石磺多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性評價

程知慶 沈和定 姚理想 刁亞 劉宸

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海201306）

采用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取瘤背石磺多糖，運用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的提取工藝，并以粗多糖對其體外抗氧化活性作初步研究。通過單因素實驗，探討浸提溫度、浸提時間、料液比對瘤背石磺多糖提取率的影響并選取實驗水平，采用 Box-Behnken設(shè)計實驗方案，利用Design-Expert 8.05軟件分析數(shù)據(jù)。通過清除羥基自由基和 DPPH自由基的能力來檢測多糖抗氧化性能。結(jié)果顯示，最佳水提條件為浸提溫度92℃、浸提時間30 h、料液比1∶29（g/mL），在最優(yōu)工藝條件下瘤背石磺多糖的提取率為9.206%，瘤背石磺多糖對羥基自由基和DPPH自由基都具有一定的清除率。采用該方法優(yōu)化提取多糖，合理可靠，為以后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，且多糖具有明顯的體外抗氧化活性。

瘤背石磺；多糖；提取工藝；響應(yīng)面法；抗氧化

瘤背石磺（Onchidium struma）俗稱土海參、海癩子、土雞、烏紗鱉、涂龜、土鮑等，屬于軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）肺螺亞綱（Pulmonata）柄眼目（Stylommatophora）石磺科（Onchidiidae），全身裸露無殼，是用肺呼吸的一種進化貝類［1］。在我國主要分布于江蘇、上海、浙江、福建、廣東、香港、海南、廣西等地，其生長在陸地和海洋的過渡帶，分布于灘涂潮間帶高潮線附近。民間流傳瘤背石磺具有滋補、壯陽、清涼、祛火、祛濕等功效［2-4］。營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，瘤背石磺具有較高的藥用價值和保健作用［5］。

研究發(fā)現(xiàn)貝類多糖也具有多種生物活性及藥用價值，紫貽貝［6］多糖具有良好的抗氧化活性；范秀萍［7］研究發(fā)現(xiàn)波紋巴非蛤多糖（PUG-1）對高脂模型小鼠具有較好的降低血脂與預(yù)防動脈粥樣硬化作用，貝類多糖還具有如抗腫瘤［8-10］、抗病毒［11］、抗衰老［12］等生物活性，從生物體內(nèi)提取出來的多糖對正常細胞毒副作用小，多糖藥物的研制成為當(dāng)今世界新藥的重要發(fā)展方向之一，從而使多糖生物資源的開發(fā)和利用成為了研究熱點。管菊［13］在研究中發(fā)現(xiàn)瘤背石磺中的總糖含量約為26.06%，目前國內(nèi)外關(guān)于石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類、生物學(xué)特性、受精機制、繁殖、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)以及營養(yǎng)價值等方面，其多糖的提取、工藝條件優(yōu)化及其生物活性的研究報道幾乎沒有?？紤]到實際實驗的可操作性及實驗室儀器的局限性，綜合考量最后采取經(jīng)典的多糖提取法——熱水浸提醇沉法，該法具有經(jīng)濟、簡單、容易操作，儀器設(shè)備易得的優(yōu)點。李雪梅［14］利用熱水浸提法提取出扇貝中的水溶性多糖，并對提取條件進行優(yōu)化。本研究采用熱水浸提法提取瘤背石磺中的多糖，通過響應(yīng)面法［15，16］實驗設(shè)計對多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，并對粗多糖的體外抗氧化能力做初步測定，以期為瘤背石磺生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤背石磺預(yù)處理 瘤背石磺（采自上海崇明島）解剖去其內(nèi)臟，置于-80℃的低溫下備用。

1.1.2 試劑 無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH自由基）、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 多功能粉碎機（永康市小寶電器有限公司），AL104電子分析天平（精確至 0.0001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），美譜達 UV-6100 型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱（上海精密實驗設(shè)備有限公司），HWS-26雙列六孔恒溫水浴鍋（上?；厶﹥x器制造有限公司），TDL-40B低速臺式大容量離心機（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），MLLI-Q超純水儀（美國 Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 瘤背石磺粗多糖的提取工藝流程 瘤背石磺→絞碎→石油醚浸泡12 h→乙醇浸泡4 h→50℃烘箱烘干→水浴浸提→過濾離心→取上清液→濃縮→脫蛋白（Sevage 試劑脫蛋白）→離心（除蛋白）→透析（4 d）→濃縮→醇沉（加入4倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜）→離心 45℃恒溫干燥→灰白色瘤背石磺粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的描繪 多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法［17］，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為：y=0.0075x+0.0012，R2=0.9927，結(jié)果表明，葡萄糖的微克含量在16-72 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.3 瘤背石磺提取液中多糖含量的測定 準(zhǔn)確稱取瘤背石磺干燥粉1 g，放入50 mL的錐形瓶中，按照設(shè)定的料液比加入蒸餾水，在設(shè)定的時間和溫度下提取，過濾離心分離，取上清液，按照苯酚-硫酸法測定并計算提取液中多糖的含量。計算方程如下：

多糖的提取率（%）=C×N×V/M×10-3×100%式中，C為待測液的濃度；N為稀釋倍數(shù)；V為待測液體積；M為樣品質(zhì)量。

1.2.4 單因素實驗 通過熱水浸提法，分別考察料液比（20、30、40、50和60 mL/g），提取溫度（80、85、90、95和100℃），提取時間（15、20、25、30和35 h）這3個因素進行單因素的優(yōu)化實驗，采用苯酚-硫酸法測石磺多糖濃度，以多糖得率為指標(biāo)，考察各個因素對瘤背石磺多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗 在上述單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計出3因素3水平實驗方案［18］。以瘤背石磺多糖的提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.05 軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝條件。實驗因子和水平，見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平表

1.2.6 瘤背石磺多糖體外抗氧化實驗

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的測定 參照陳玉琴等［19］的實驗方法，略有改動，降低了其中DPPH自由基的濃度為0.5 mmoL/L，進行實驗，重復(fù)實驗3次，求取平均值，以VC作對比。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對照］×100% 1.2.6.2 清除羥基自由基能力的測定 參考李粉玲等［20］的實驗方法，略有改動，10倍稀釋了實驗試劑的濃度，并延長反應(yīng)時間至30 min。重復(fù)實驗3次，求取平均值，以VC作對比。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對照］×100%

2 結(jié)果

2.1 瘤背石磺多糖提取的單因素實驗

2.1.1 溫度對總糖得率的影響 圖1顯示，隨著浸提溫度的提高，瘤背石磺多糖的提取率明顯增高，當(dāng)溫度高于90℃時，多糖的提取率增加相對緩慢。由于加熱時間過長，受實驗條件限制，溫度最高只能穩(wěn)定在95℃，所以浸提溫度選擇85℃-95℃。

圖1 浸提溫度對瘤背石磺多糖提取率的影響

2.1.2 時間對總糖得率的影響 圖2顯示，隨浸提時間的延長瘤背石磺多糖的提取率不斷提高，浸提時間達到30 h，提取率達到最大值。隨著浸提時間的延長，提取率下降。故選擇浸提時間在30 h左右。

2.1.3 料液比對總糖得率的影響 圖 3 顯示，當(dāng)料液比低于30 mL/g時，多糖的提取率一直呈現(xiàn)上升趨勢，在料液比為30 mL/g時提取率達到最高，隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率降低。故選擇30 mL/g為響應(yīng)面的最優(yōu)值。

圖2 浸提時間對瘤背石磺多糖提取率的影響

圖3 料液比對瘤背石磺多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇浸提溫度、浸提時間、料液比3個因素為響應(yīng)面實驗的自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，進行3因素3水平的優(yōu)化實驗。利用Design expert 8.05軟件進行數(shù)據(jù)處理和回歸分析，結(jié)果如表2所示。

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.05軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行處理，得到多糖提取率對浸提溫度、浸提時間、料液比3個因素的二次多項回歸方程為：

對該模型進行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項P=0.576 5＞0.05，沒有顯著性，說明所選的模型對該實驗擬合程度較好，誤差較小。其中模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.990 0，校正后的R2=0.977 2，說明該模型可以解釋97.72%的響應(yīng)值Y的變化，預(yù)測R2值0.932 5與校正的值0.977 2相差不大，表明實驗的實際值與預(yù)測值擬合的較好。

表2 瘤背石磺多糖提取率的響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

表3 擬合二次多項式模型的方差分析

A、B、C三個因素的一次項均小于0.01，說明這3個因素對多糖提取率都極顯著。交互項AB、AC都小于0.01，均達到了極顯著的水平，BC小于0.05達到顯著水平，3個因素的二次項均達到極顯著水平（P＜0.01），說明3個因素之間都存在一定的交互作用，且因素之間的交互作用對多糖提取率都顯著影響。表3的方差分析顯示，3個因素對瘤背石磺多糖提取率的影響程度依次為A（浸提溫度）＞C（料液比）＞B（浸提時間）。

2.2.2 瘤背石磺多糖的響應(yīng)面分析 利用 Design Expert 8.05軟件，繪制各影響因素對瘤背石磺多糖的響應(yīng)曲面圖，根據(jù)響應(yīng)曲面的坡度和等高線的形狀可以比較判斷各因素及其交互作用對提取率影響的強弱。該擬合方程的二次項系數(shù)都是負(fù)數(shù)，所以圖4-圖6中每個響應(yīng)曲面都是開口向下的凸形曲面，等高線沿某一因素軸方向曲線的疏密程度反映在響應(yīng)曲面上表現(xiàn)為曲面的陡峭程度，等高圖上曲線越密，響應(yīng)曲面則越陡，說明響應(yīng)值對該因素的變化較敏感，圖4-圖6中的響應(yīng)面3D圖顯示，當(dāng)各因素在一定范圍內(nèi)增大時，響應(yīng)值也隨之增大，當(dāng)各因素超出響應(yīng)面極值繼續(xù)增加時，響應(yīng)值則減小，等高圖中的中心點投影在3D圖中為最高點，則該點的提取率最高，而根據(jù)等高線圖4-圖6中等高線沿各自軸方向的疏密程度可以比較出各因素的影響力大小分別是：A＞B、A＞C、C＞B。等高線的形狀可反映出交互影響的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，圖4-圖6中的等高曲線都是橢圓形，說明浸提溫度和浸提時間、浸提溫度和料液比、浸提時間和料液比之間交互作用較為顯著且各因素之間的交互作用對多糖的提取率影響顯著。最后得出3種因素對多糖提取率的影響是：A（浸提溫度）＞C（料液比）＞B（浸提時間），該結(jié)果與回歸模型顯著性檢驗相吻合。

2.2.3 優(yōu)化與驗證實驗 根據(jù)上述響應(yīng)面的模型與結(jié)果分析，得到最佳條件下的瘤背多糖的提取率為9.206%，其中浸提溫度為91.65℃，浸提時間29.93 h，料液比29.05 mL/g。為了檢測響應(yīng)面法所得數(shù)據(jù)的可靠性，同時也為了實驗操作方便，選取浸提溫度92℃，浸提時間30 h，料液比29 mL/g。在此條件下，平行重復(fù)實驗3次的平均值為（9.062±0.091）%。實際測得的平均值與理論預(yù)測值相差很小，說明該模型可靠性高，工藝的重復(fù)性好。

圖4 提取率f=（A，B）響應(yīng)曲面及等高線圖（C=30.00）

圖5 提取率f=（A，C）響應(yīng)曲面及等高線圖（B=30.00）

圖6 提取率f=（B，C）響應(yīng)曲面及等高線圖（A=90.00）

2.3 瘤背石磺多糖體外抗氧化實驗

2.3.1 DPPH自由基清除能力 圖7顯示，在測定的濃度范圍內(nèi)，VC和瘤背石磺多糖對DPPH自由基都有較強的清除能力，但與多糖相比，VC的清除能力明顯更強且一直維持在較高水平。多糖對DPPH自由基的清除力隨著瘤背石磺多糖濃度的增加呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)濃度大于2 mg/mL時，多糖對DPPH自由基的清除率明顯增強。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時，清除率最高達到76.98%。對DPPH的清除率IC50為4.36 mg/mL。

2.3.2 羥基自由基清除能力 圖8顯示，在測定的多糖濃度范圍內(nèi)，瘤背石磺多糖和VC均對羥基自由基有較強的清除力。與多糖相比，VC的清除能力更強且一直維持在較高的水平。瘤背石磺多糖對羥基自由基的清除力隨多糖濃度的增加而增強，最高清除率達到80%。說明瘤背石磺多糖對羥基自由基的清除能力達到較高的水平。對羥基自由基的清除率IC50為3.12 mg/mL。

圖7 瘤背石磺多糖對DPPH自由基的清除率

3 討論

本實驗對瘤背石磺多糖提取工藝條件進行優(yōu)化，對其抗氧化活性進行評價。選取3個影響因素（浸提溫度、浸提時間、料液比）進行單因素的優(yōu)化實驗，在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）中心組合實驗設(shè)計原理，以多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計出3因素3水平實驗方案，利用Design Expert 8.05軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝條件。通過多糖清除DPPH自由基和羥基自由基的能力來評價多糖的抗氧化活性。

在單因素的實驗中，浸提溫度、浸提時間和料液比對多糖提取率的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)浸提溫度低于95℃時，隨著溫度的逐漸升高，分子的運動加劇，加快了多糖溶解擴散的速度，從而使多糖的提取率上升，所以在適度范圍內(nèi)浸提溫度的升高有利于多糖的提取，但溫度過高會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，部分多糖水解為單糖或低聚糖，從而導(dǎo)致多糖提取率下降［21］；在一定的浸提時間內(nèi)，多糖隨著浸提時間的延長，在水中的溶解度不斷增加，當(dāng)多糖擴散達到平衡時，多糖的提取率下降，浸提時間過長會影響甚至破壞多糖結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致多糖的提取率下降；濃度梯度是提取的動力，在一定范圍內(nèi)提高料液比有利于多糖的提取，但當(dāng)料液比超過某一極限時，再提高料液比則效果不明顯，同時考慮到節(jié)約能源，所以選擇最優(yōu)料液比為30 mL/g。

在多糖抗氧化實驗中，以VC作為陽性對照，考察多糖對兩種自由基的清除能力。首先DPPH自由基由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有十分活潑的單電子，其醇溶液呈紫色，并且在517 nm處有一強吸收峰，瘤背石磺多糖的加入可以捕獲并清除其單電子，導(dǎo)致溶液褪色和吸收強度的減弱［22］；其次根據(jù)Fenton反應(yīng)，H2O2與Fe2+發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成OH·自由基，其存活時間較短但具有極高的反應(yīng)活性，與水楊酸結(jié)合生成一種在510 nm處有強吸收的有色物質(zhì)，抗氧化劑多糖的加入清除并降低了OH·自由基的濃度，則有色物質(zhì)生成量減少，溶液顏色變淡且吸光度減?。?3］。

4 結(jié)論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化瘤背石磺多糖提取的工藝條件，確定多糖的最佳提取工藝為浸提溫度92℃，浸提時間30 h，料液比29 mL/g，提取率為9.062%。對瘤背石磺多糖體外抗氧化實驗表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力都較強。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Process Optim ization of Extracting Polysaccharides from Onchidium struma，and Evaluation of Its Antioxidant Activity in Vitro

Cheng Zhiqing Shen Heding Yao Lixiang Diao Ya Liu Chen
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai201306）

Taking Onchidium struma as the raw material， its polysaccharides was extracted by the traditional method of hot water. Process of extracting polysaccharides from O. struma was optimized by response surface methodology. Through the single factor experiment，the effects of extraction temperature， extraction time， and liquor-to-material ratio to the extraction rate of polysaccharide were investigated. Furthermore， the experiments were done by Box-Behnken， and the data was analyzed by Design-Expert 8.05 software. Antioxidant activity of O. struma polysaccharides was determined by the capacity of scavenging free hydroxyl radical and DPPH radical. On the basis of the analysis of regression equation， determination of factors affecting the extraction of polysaccharide was conducted by the extraction rate of polysaccharide served as response value. Extraction temperature at 92℃， extraction time of 30 h， and liquor-to-material ratio of 1∶29 g/mL， leaching rate of O. struma polysaccharide reached 9.206%. O. struma polysaccharide had ability to clear off free hydroxyl radical and DPPH radical. Conclusively，the extraction technology is reasonable and reliable for the extraction of polysaccharides O. struma， which provides the theoretical support for the future industrial production， and its polysaccharides have significant antioxidation in vitro.

Onchidium struma；polysaccharide；extraction；response surface method；antioxidation effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.027

2015-01-14

國家自然科學(xué)基金項目（41276157），上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目

程知慶，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源研究與開發(fā)；E-mail：986256709@qq.com

沈和定，男，博士，教授，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：hdshen@shou.edu.cn