謝勝松，張懿，張利生，李廣磊，趙長(zhǎng)志，倪攀，趙書紅

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；

2. 中國(guó)人民解放軍第161醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430010

CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶效應(yīng)評(píng)估

謝勝松1，張懿2，張利生1，李廣磊1，趙長(zhǎng)志1，倪攀1，趙書紅1

1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；

2. 中國(guó)人民解放軍第161醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430010

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的第三代基因組編輯技術(shù)，已成功應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物等諸多物種的基因組改造。如何提高CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編輯效率和最大限度降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)一直是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而使用高效且特異的sgRNA（Small guide RNA）是基因組改造成功的關(guān)鍵性因素之一。目前，已有多款針對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的sgRNA設(shè)計(jì)和/或脫靶效應(yīng)評(píng)估軟件，但不同的軟件各有優(yōu)缺點(diǎn)。本文重點(diǎn)對(duì)16款sgRNA 設(shè)計(jì)和脫靶效應(yīng)評(píng)估在線和單機(jī)版軟件的特點(diǎn)進(jìn)行了闡述，通過制定38項(xiàng)評(píng)估指標(biāo)對(duì)不同軟件進(jìn)行了比較分析，最后對(duì)11種用于檢測(cè)基因組編輯效率和脫靶的實(shí)驗(yàn)方法，以及如何篩選高效且特異的sgRNA進(jìn)行了歸納總結(jié)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因組編輯；sgRNA；脫靶效應(yīng)

基于CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，是繼鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases， ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease， TALEN）后的第三代基因組編輯技術(shù)，主要是源于對(duì)細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)改造而成［1］。一經(jīng)問世，在食蟹猴（Cynomolgus monkey）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norveaicus）、斑馬魚（Zebrafish）、豬（Sus scrofa）、擬南芥（Arabidopsis thaliala）、煙草（Nicotiana tabacum）、高粱（Sorghum bicolor）和水稻（Oryza sativa）等多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)了基因組編輯［2～10］。2014年，Nishimasu等［11］解析了Cas9、sgRNA（Small guide RNA）和DNA復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。研究顯示，Cas9核酸酶由兩個(gè)裂片（lobe）組成：一個(gè)參與識(shí)別sgRNA，另一個(gè)負(fù)責(zé)切割靶標(biāo)DNA，導(dǎo)致靶基因功能失活。鑒于此，CRISPR/Cas9技術(shù)主要由兩部分組成：一是sgRNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與基因組特異結(jié)合；其次是Cas9核酸酶，可靶定到具有下游前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif， PAM）的特定基因組序列并進(jìn)行切割［12］。

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)依然在不斷改進(jìn)中。如圖1所示，野生型Cas9可切割DNA并激活DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks， DSB）修復(fù)機(jī)制，即同源重組（Homologous recombination， HR）、非同源末端連接（Non-homologous end Joining， NHEJ）機(jī)制和單鏈DNA退火（Single strand annealing， SSA）修復(fù)機(jī)制。如果無同源供體DNA（Donor DNA）模板，細(xì)胞會(huì)通過NHEJ修復(fù)突變位點(diǎn)，導(dǎo)致靶標(biāo)DNA發(fā)生堿基插入或刪除。相反，若存在同源供體DNA或ssDNA（Single-stranded DNA）寡核苷酸，細(xì)胞會(huì)采用HR或SSA修復(fù)機(jī)制，準(zhǔn)確將外源DNA插入到基因組（圖1A）。當(dāng)僅突變Cas9核酸酶一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域時(shí)，可形成Cas9單切口酶（nickase，通常為D10A或H840A），僅能切割單鏈DNA。當(dāng)單切口酶與1對(duì)分別位于染色體正負(fù)鏈上、方向相反且距離適當(dāng)?shù)膬蓚€(gè)sgRNA（即“paired-gRNA”）共同作用時(shí)，可切割靶標(biāo)DNA，進(jìn)而導(dǎo)致靶基因堿基缺失。研究表明，該方法能顯著降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)（圖1B）。而當(dāng)同時(shí)突變Cas9核酸酶兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域后，可使其成為缺陷型核酸酶（Catalytically inactive CRISPR-associated nuclease 9， short for dead Cas9 or dCas9），將僅具備與DNA結(jié)合的能力。當(dāng)dCas9與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白融合，如VP16（alpha TIF）或KRAB（Krueppel-associated box），可激活或抑制靶基因的表達(dá)［13］；dCas9與綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）融合，則可應(yīng)用于示蹤特異靶位點(diǎn)在基因組上的位置（圖1C）。CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于多個(gè)物種，并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但如何改善和提高基因組編輯效率，同時(shí)最大限度降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)成為亟待解決的問題，本文圍繞這一核心問題進(jìn)行了綜述，并重點(diǎn)介紹了sgRNA的設(shè)計(jì)要點(diǎn)。

圖1　基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)

1　CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率與脫靶效應(yīng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率與多種因素有關(guān)。Hruscha等［14］利用該技術(shù)在斑馬魚中進(jìn)行基因打靶，發(fā)現(xiàn)其基因組編輯效率高達(dá)86.0%。如果提供同源供體DNA，通過HR修復(fù)機(jī)制可將外源性的HA標(biāo)簽插入到特定靶點(diǎn)，插入效率為3.5%～15.6%。Doench等［15］系統(tǒng)性研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率，對(duì)1841條sgRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同sgRNA的活性有差別。例如，若sgRNA的3'末端第20位堿基為鳥嘌呤核苷酸，則基因組編輯效率高；如果該位置為胞嘧啶核苷酸，則基因組編輯效率低；如果第18和19位堿基為胸腺嘧啶核苷酸，其基因組編輯效率則相對(duì)較低。另外，如果sgRNA第16位堿基為胞嘧啶核苷酸，其基因組編輯效率則相對(duì)較高；如果該位置為鳥嘌呤核苷酸，其基因組編輯效率則低；如果sgRNA第3位堿基為腺嘌呤核苷酸，其基因組編輯效率比該位置為胞嘧啶核苷酸時(shí)高。這一研究為設(shè)計(jì)高效的sgRNA提供了強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。利用GFP報(bào)告基因載體系統(tǒng)，Zhang等［16］分別通過定性和定量的方法系統(tǒng)地比較了PAM對(duì)基因組編輯效率的影響，發(fā)現(xiàn)編輯效率依次是NGG＞NGA＞NAG，（N= A，T， C或G）。Farboud等［17］發(fā)現(xiàn)并非所有sgRNA有活性；研究還發(fā)現(xiàn)選擇3'末端為GG的sgRNA，可顯著提高基因組編輯效率。除了sgRNA外，選擇特定的小分子化合物也能提高基因組編輯效率。Yu等［18］利用高通量藥物篩選的策略，發(fā)現(xiàn)使用L755507（β3腎上腺素受體激動(dòng)劑）或Brefeldin A（蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑），可將大片段同源重組效率和基因插入效率分別提高3倍和2倍；而使用兩種胸苷類似物（Thymidine analogs），即疊氮胸苷（Azidothymidine， AZT）和曲氟尿苷（Trifluridine， TFT）則能降低同源重組效率。

多項(xiàng)研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)。Fu等［19］利用GFP報(bào)告載體系統(tǒng)和細(xì)胞流式技術(shù)系統(tǒng)評(píng)估了脫靶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Cas9核酸酶對(duì)脫靶位點(diǎn)1～2個(gè)錯(cuò)配堿基的耐受能力與其配對(duì)位置有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)含5個(gè)錯(cuò)配堿基的脫靶位點(diǎn)能被Cas9核酸酶切割。Hsu等［20］在HEK 293T（Human embryonic kidney 293T cells）和HEK 293FT細(xì)胞系中，對(duì)超過700個(gè)sgRNA和對(duì)應(yīng)的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas9核酸酶對(duì)錯(cuò)配堿基的耐受能力，不僅與錯(cuò)配堿基數(shù)量有關(guān)，還與錯(cuò)配堿基位置有關(guān)，并可將sgRNA劃分為靠近PAM的核心區(qū)和遠(yuǎn)離PAM的非核心區(qū)，這與Fu等［19］的研究報(bào)道一致。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Cas9核酸酶切割靶標(biāo)基因組不受甲基化影響。通過調(diào)節(jié)Cas9核酸酶和sgRNA濃度可降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，但濃度降低后，相應(yīng)基因組編輯能力會(huì)減弱［20］。Pattanayak等［21］利用高通量測(cè)序方法，對(duì)sgRNA的特異性進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)sgRNA的特異性主要與臨近PAM的8～12個(gè)序列有關(guān)，即種子序列（Seed sequence）。與之相矛盾的是，Zhang等［22］發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)與靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)無關(guān)，而與sgRNA和Cas9核酸酶的類型有關(guān)。Ran等［23］利用Cas9單切口酶和“paired-gRNAs”進(jìn)行基因組編輯，結(jié)果表明此方法能顯著降低細(xì)胞系中的脫靶效應(yīng)（約50～1500倍）。Lin等［24］研究發(fā)現(xiàn)，脫靶位點(diǎn)即便存在一個(gè)凸起（bulge）的堿基，依然會(huì)發(fā)生脫靶。Wang等［25］利用整合酶缺陷的慢病毒載體（Integrase-defective lentiviral vectors，IDLVs）對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行全基因組無偏向性分析，同樣發(fā)現(xiàn)Cas9核酸酶可切割含單個(gè)凸起堿基的脫靶位點(diǎn)。而令人意外地是，發(fā)現(xiàn)某些脫靶位點(diǎn)竟含有多達(dá)13個(gè)錯(cuò)配的堿基。由此可見，CRISPR/Cas9技術(shù)存在嚴(yán)重的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。為了提高sgRNA特異性，F(xiàn)u等［26］采用長(zhǎng)度短于20nt的sgRNA進(jìn)行基因打靶研究，發(fā)現(xiàn)使用17～18nt的“truncated sgRNA”不影響其活性，但可顯著降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

2　sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶效應(yīng)評(píng)估軟件

自2013年起，包括本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的sgRNAcas9軟件在內(nèi)，共有20多款在線和/或單機(jī)版sgRNA設(shè)計(jì)和脫靶效應(yīng)評(píng)估軟件陸續(xù)公布。按照操作平臺(tái)、輸入、參數(shù)設(shè)置、結(jié)果輸出和其他共5項(xiàng)內(nèi)容，通過制定38個(gè)評(píng)測(cè)指標(biāo)，本文對(duì)其中16款軟件的操作性能進(jìn)行比較分析（附表1），這些軟件的特點(diǎn)介紹如下。

2.1在線sgRNA設(shè)計(jì)和脫靶效應(yīng)評(píng)估軟件

2.1.1CRISPR Design

該軟件［20］由美國(guó)麻省理工學(xué)院Broad研究所的張鋒實(shí)驗(yàn)室開發(fā)（http：//crispr.mit.edu/），有兩種設(shè)計(jì)模式。單序列（Single sequence）模式僅可針對(duì)大小為23～500nt的序列設(shè)計(jì)sgRNA，且限定sgRNA的長(zhǎng)度為20 bp；批量模式（Batch mode）允許上傳FASTA格式的多序列文件，可同時(shí)針對(duì)多條序列設(shè)計(jì)sgRNA。對(duì)于脫靶效應(yīng)評(píng)估，該軟件僅包含人、小鼠和大鼠等15個(gè)物種基因組供脫靶效應(yīng)評(píng)估，其考察脫靶位點(diǎn)堿基錯(cuò)配數(shù)，允許≤4個(gè)堿基錯(cuò)配；PAM類型除了“NGG”外，還有“NAG”，并進(jìn)一步考察脫靶位點(diǎn)是否位于其他基因外顯子等。軟件將依據(jù)特定公式對(duì)每個(gè)脫靶位點(diǎn)評(píng)分，再采用脫靶位點(diǎn)結(jié)合反向似然法（Inverse likelihood of off target binding），計(jì)算每條sgRNA的總得分。最后，按照分?jǐn)?shù)高低對(duì)sgRNA進(jìn)行排序，并用紅、綠和黃3種顏色標(biāo)示sgRNA特異性高低。其中綠色表示特異性高，總得分大于50的sgRNA；黃色表示特異性為中等水平的sgRNA；而紅色表示該sgRNA可能存在較高脫靶風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)避免使用。

2.1.2ZiFiT

該軟件［27］由鋅指聯(lián)盟（Zinc Finger Consortium）開發(fā)，最初用于設(shè)計(jì)ZFN（http：//zifit.partners.org/ZiFiT/）。最新版ZiFiT（V4.2）可設(shè)計(jì)并評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)，針對(duì)不同類型的Cas9核酸酶有3種設(shè)計(jì)模式：（1）設(shè)計(jì)針對(duì)野生型Cas9核酸酶的sgRNA（CRISPR/ Cas Nucleases）；（2）設(shè)計(jì)針對(duì)Cas9單切口酶的“paired-gRNA”（CRISPR/Cas nickase）；（3）設(shè)計(jì)針對(duì)CRISPR RFNs（RNA-guided Fok I nucleases）的“paired-gRNA”。對(duì)于第一種模式，可設(shè)置靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度（Length of target site），可選長(zhǎng)度范圍為2～20nt。由于U6和T7是RNA聚合酶Ⅲ型啟動(dòng)子，它們的轉(zhuǎn)錄起始依賴堿基“G”。因此，可限定sgRNA的5'端堿基組成以構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體。對(duì)于設(shè)計(jì)針對(duì)野生型Cas9核酸酶的sgRNA，僅需輸入FASTA格式序列，設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“鑒定靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)（Identify target sites）”按鈕，即會(huì)輸出所有sgRNA，再點(diǎn)擊“鑒定潛在的脫靶位點(diǎn)（Identify potential offtargets）”按鈕，軟件會(huì)對(duì)每條sgRNA進(jìn)行全基因組水平脫靶分析。該軟件目前僅含人、小鼠和大鼠等9個(gè)物種基因組供分析，脫靶位點(diǎn)最大允許3個(gè)堿基錯(cuò)配。而對(duì)于后2種設(shè)計(jì)模式，軟件僅設(shè)計(jì)“paired-gRNA”，并直接輸出用于構(gòu)建特定表達(dá)載體的引物。對(duì)于設(shè)計(jì)針對(duì)“RNA-guided Fok Ⅰ Nucleases”和Cas9 單切口酶的“paired-gRNA”，兩者差異在于是否限定“paired-gRNA”之間的距離。對(duì)“RNA-guided Fok Ⅰ nucleases ”而言，研究表明，當(dāng)“paired-gRNA”間距為16 bp時(shí)，基因組編輯效率最高。因此，該軟件主要設(shè)計(jì)距離接近16 bp的“paired-gRNA”；而針對(duì)Cas9單切口酶，并未限定“paired-gRNA”之間的距離。

2.1.3Cas9 Design

該軟件［28］由北京大學(xué)工學(xué)院研究人員開發(fā)，僅用于對(duì)小鼠、大鼠和斑馬魚等10種模式動(dòng)物設(shè)計(jì)sgRNA（http：//cas9.cbi.pku.edu.cn/）。sgRNA長(zhǎng)度可選范圍為20～30 nt。此外，該軟件還考察全長(zhǎng)sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)錄效率的影響，允許設(shè)置除20nt長(zhǎng)度的靶標(biāo)識(shí)別序列之外，與Cas9核酸酶結(jié)合的“gRNAscaffod”和轉(zhuǎn)錄終止“TTTT”序列。該軟件操作界面簡(jiǎn)潔，輸入FASTA序列和設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“設(shè)計(jì)（Design）”按鈕即可運(yùn)行。對(duì)于每條sgRNA，軟件會(huì)評(píng)估其是否為基因組上唯一存在的序列。其次，檢測(cè)靶標(biāo)位點(diǎn)是否含SNPs；該軟件主要調(diào)用“Vienna RNAFold”程序，對(duì)sgRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并計(jì)算有幾個(gè)堿基位于莖上，以此來評(píng)估sgRNA的轉(zhuǎn)錄效率。

2.1.4E-CRISP

該軟件［29］可設(shè)計(jì)并評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html），分為從頭設(shè)計(jì)（De-novo）和脫靶效應(yīng)評(píng)估（Evaluation）兩種模式，含人、小鼠和豬等多達(dá)33個(gè)物種的基因組。對(duì)于sgRNA從頭設(shè)計(jì)模式，可輸入FASTA格式靶標(biāo)序列（Enter target sequence），也可僅輸入基因名稱（Gene symbol）。該軟件除了設(shè)計(jì)單個(gè)sgRNA，也可設(shè)計(jì)“paired-gRNA”。在起始應(yīng)用（Start application）選項(xiàng)，有3種模式可供選擇：（1）嚴(yán)謹(jǐn)型，限定PAM類型僅為NGG，sgRNA的5'端堿基僅為G，脫靶位點(diǎn)允許多個(gè)堿基錯(cuò)配，并排除位于內(nèi)含子、CpG 島（CpG islands）與UTRs（Untranslated regions）的脫靶位點(diǎn)；（2）中等型，PAM類型為NAG/NGG，不限sgRNA的5'端堿基組成，脫靶位點(diǎn)允許多個(gè)堿基錯(cuò)配，排除位于內(nèi)含子和CpG島的脫靶位點(diǎn)；（3）松散型，PAM類型為NAG/NGG，不限sgRNA的5'端堿基組成，脫靶位點(diǎn)完全匹配，包含內(nèi)含子。在設(shè)置設(shè)計(jì)目的（Design purpose）選項(xiàng)，可依據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，確保sgRNA與目標(biāo)基因特定位點(diǎn)結(jié)合，比如基因敲低或敲除實(shí)驗(yàn)（Knock-down/out）、N端標(biāo)記（N-terminal tagging）、C端標(biāo)記（C-terminal tagging）和“CRISPR double nicking”，這幾種方法可限定sgRNA靶標(biāo)的位置。該軟件的另一特點(diǎn)是，可設(shè)置sgRNA的長(zhǎng)度（7～30 bp），sgRNA的A、T、C和G不同堿基比例、PAM類型和靶標(biāo)位點(diǎn)在基因組上的位置等。另外，對(duì)于設(shè)計(jì)“paired-gRNA”，兩個(gè)sgRNA之間的距離可選范圍為-8～25 bp。設(shè)置脫靶效應(yīng)分析（Off-target analysis）選項(xiàng)，可選擇使用哪種版本的基因組比對(duì)工具（bowtie程序），還可設(shè)置參考數(shù)據(jù)庫，如基因組數(shù)據(jù)庫、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫或不包含內(nèi)含子的基因組序列，以及選擇是否分析脫靶結(jié)合位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)等。對(duì)于結(jié)果輸出，在基因注釋排除（Gene annotation filtering）選項(xiàng)，可依據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)在基因組上的位置，設(shè)置是否排除該sgRNA序列，如不顯示位于非編碼區(qū)、外顯子區(qū)或CpG島的sgRNA等。在輸出（Outputs）選項(xiàng)，還可設(shè)置每個(gè)外顯子最大設(shè)計(jì)幾條sgRNA，是否輸出為GFF（General feature format）格式的文件，是否生成基因組定位信息模式圖等。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“開始搜尋sgRNA（Start sgRNA search）”按鈕，程序即可運(yùn)行，結(jié)果將以網(wǎng)頁的形式輸出。對(duì)于結(jié)果輸出，軟件會(huì)顯示目標(biāo)序列中共有多少條sgRNA、符合參數(shù)條件的有多少條、排除了多少條等信息。所有結(jié)果均以表格形式呈現(xiàn)，并依據(jù)評(píng)分高低對(duì)sgRNA排序。

2.1.5Cas-OFFinder

該軟件［30］僅可評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)（http：// www.rgenome.net/cas-offinder/），由韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)（Seoul National University）Jin-Soo Kim教授實(shí)驗(yàn)室開發(fā)。除了在線軟件外，還提供單機(jī)版。該在線軟件含人、小鼠和大鼠等25個(gè)物種基因組，適用范圍較廣?？舍槍?duì)不同物種來源的Cas9核酸酶，評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)。例如，來自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的“SpCas9”核酸酶，其PAM類型為“5'-NGG-3'”或“5'-NRG-3' （R = A或G）”；來自嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的“StCas9”核酸酶，其PAM類型為“5'-NNAGAAW-3' （W = A或T）”；來自腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）的“Nm-Cas9”核酸酶，其PAM類型為“5'-NNNNGMTT-3' （M = A或 C）”；來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的“SaCas9”，其PAM類型為“5'-NNGRRT-3' （R=A或G）”。對(duì)不同的Cas9核酸酶，除了PAM類型不同外，對(duì)應(yīng)的sgRNA長(zhǎng)度也不同，如針對(duì)“SpCas9”核酸酶，要求sgRNA長(zhǎng)度為20 bp，針對(duì)“StCas9”核酸酶，要求sgRNA長(zhǎng)度為18 bp，而針對(duì)“NmCas9”核酸酶，要求sgRNA長(zhǎng)度為24 bp。另外，還允許使用簡(jiǎn)并堿基設(shè)置PAM類型，如R代表A或G，Y代表C或T，且脫靶位點(diǎn)允許堿基錯(cuò)配范圍是0～10 bp。該軟件運(yùn)行速度較快，結(jié)果直接在頁面輸出，除了顯示脫靶位點(diǎn)外，還標(biāo)示染色體位置和堿基錯(cuò)配數(shù)等。

2.1.6CRISPR-P

該軟件［31］由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳玲玲課題組開發(fā)（http：//cbi.hzau.edu.cn/ crispr/），包含擬南芥、水稻和玉米等33個(gè)植物基因組。有3種sgRNA設(shè)計(jì)方式，如直接輸入位點(diǎn)標(biāo)簽（Locus tag）、基因組位置（Position）或基因序列（Sequence）。軟件允許輸入的序列范圍為23～5000 bp。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“提交（Submit）”按鈕，將輸出堿基為“G（N）20GG” 或 “A（N）20GG”的靶標(biāo)位點(diǎn)。針對(duì)構(gòu)建由 U6或U3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，可限定sgRNA的5'堿基為G或A。對(duì)于脫靶效應(yīng)評(píng)估，該軟件調(diào)用“BLASTn”程序進(jìn)行全基因組比對(duì)分析，且脫靶位點(diǎn)最大允許4個(gè)堿基錯(cuò)配。結(jié)果輸出中還會(huì)標(biāo)示sgRNA在染色體上的位置，并依據(jù)特定公式對(duì)sgRNA進(jìn)行評(píng)分并排序。其脫靶評(píng)分公式與上述“CRISPR Design”軟件相同，但僅針對(duì)植物進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。最大特色是搜尋sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)中是否含限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，以方便采用酶切法檢測(cè)基因組切割效率。

2.1.7CHOPCHOP

該軟件［32］可同時(shí)用于CRISPR/Cas9或TALEN系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)（https：//chopchop. rc.fas.harvard.edu/index.php）。對(duì)于靶標(biāo)基因選擇，可輸入基因名稱、基因組位置或堿基序列，其包含有果蠅、人和小鼠等23個(gè)物種基因組。如果切換到高級(jí)設(shè)置選項(xiàng)（Toggle advanced options），可限定sgRNA與基因組特定區(qū)域結(jié)合（Target specific regionof gene），如基因編碼區(qū)、外顯子、選擇性剪切位點(diǎn)、5' UTR和3' UTR等。在限制靶標(biāo)（Restrict targeting）選項(xiàng)，可設(shè)置僅搜尋外顯子及相鄰的側(cè)翼序列，或選擇設(shè)計(jì)針對(duì)外顯子的sgRNA；在限定靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶（Restriction enzymes）類型選項(xiàng)，可設(shè)置限制性內(nèi)切酶的來源與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目，如限定僅針對(duì)來自NEB或Sigma等公司的限制性內(nèi)切酶等。對(duì)于脫靶效應(yīng)評(píng)估，可切換到確定脫靶位點(diǎn)在基因組的方法（Method for determining off-targets in the genome）選項(xiàng)，其有3種脫靶效應(yīng)評(píng)估規(guī)則供選擇：（1）與脫靶位點(diǎn)結(jié)合的20 bp序列中含大于2個(gè)錯(cuò)配堿基；（2）僅與脫靶位點(diǎn)結(jié)合的15 bp種子序列完全匹配；（3）與脫靶結(jié)合位點(diǎn)序列完全匹配。對(duì)于限定sgRNA 的5'堿基組成（5'requirements for gRNA）選項(xiàng)，也有3種類型的堿基組合：（1）GN或NG；（2）GG；（3）不限。而對(duì)于PAM類型（PAM motif）選項(xiàng)，同樣有3種不同的堿基組合：（1）NGG；（2）NNAGAA；（3）NNNNGANN。選擇“CRISPR/Cas9”模式，設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“尋找靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)（ Find Target Sites?。卑粹o，軟件即可運(yùn)行。結(jié)果輸出會(huì)將sgRNA標(biāo)示到目標(biāo)基因組的染色體上，并以不同顏色標(biāo)示其位置，如外顯子和內(nèi)含子等。該軟件除了考察靶標(biāo)位點(diǎn)是否含特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列外，還有一個(gè)特色是每條sgRNA均會(huì)設(shè)計(jì)數(shù)條用于檢測(cè)基因組編輯效率的PCR擴(kuò)增引物。而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、引物長(zhǎng)度、溶解溫度（Tm）和距離靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的最小距離等均可自定義。

2.1.8GT-Scan

該軟件［33］可用于設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，其包含人、小鼠和斑馬魚等 28個(gè)物種基因組供脫靶評(píng)估（http：//gt-scan.braembl.org.au/gt-scan/submit）。在基本參數(shù)設(shè)置選項(xiàng)中，可輸入或上傳FASTA格式的文件，最大支持4 kb的序列，并且有5種sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則供選擇（Enter the target rule）：（1）sgRNA和PAM一起長(zhǎng)度為23nt，其中種子序列含8個(gè)堿基，脫靶位點(diǎn)的PAM類型為“NGG”或“NAG”；（2）sgRNA和PAM一起長(zhǎng)度為23nt，其中種子序列含9個(gè)堿基，脫靶位點(diǎn)的PAM類型為“NGG”或“NAG”；（3）sgRNA和PAM一起長(zhǎng)度為23nt，其中種子序列含10個(gè)堿基，脫靶位點(diǎn)的PAM類型為“NGG”或“NAG”（默認(rèn)參數(shù)）；（4）sgRNA和PAM一起長(zhǎng)度為23 nt，如果構(gòu)建T7或U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sgRNA表達(dá)載體，其5'堿基為G，且種子序列含10個(gè)堿基，脫靶位點(diǎn)的PAM類型為“NGG”或“NAG”；（5）sgRNA和PAM一起長(zhǎng)度為20nt，其中種子序列僅含5個(gè)堿基，脫靶位點(diǎn)的PAM類型僅為“NGG”。在高級(jí)參數(shù)（Advanced parameters）選項(xiàng)，可通過脫靶位點(diǎn)過濾規(guī)則（Enter the off-target filter）選項(xiàng)設(shè)置PAM的類型，并可用簡(jiǎn)并堿基，設(shè)置不同類型的PAM，因此適用于針對(duì)多種類型的Cas9核酸酶設(shè)計(jì)sgRNA。在限定特異性錯(cuò)配（Select the high-specificity mismatch limit）選項(xiàng)，可設(shè)置脫靶位點(diǎn)含0～3 bp的堿基錯(cuò)配。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“掃描（Scan）”按鈕，即可快速設(shè)計(jì)sgRNA并進(jìn)行脫靶預(yù)測(cè)。

2.1.9flyCRISPR Optimal Target Finder

該軟件［34］適用于為不同品系果蠅、蜜蜂和線蟲等22個(gè)物種設(shè)計(jì)特異性的sgRNA（http：//tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/）。有2種設(shè)計(jì)模式，其一是可針對(duì)序列設(shè)計(jì)sgRNA并評(píng)估脫靶效應(yīng)，其次是預(yù)測(cè)已知sgRNA的脫靶效應(yīng)。允許輸入的sgRNA范圍為16～20 nt，此外，可限定sgRNA的5'堿基組成，如僅設(shè)計(jì)5'堿基為G或GG的sgRNA等。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“尋找CRISPR靶標(biāo)（Find CRISPR Targets）”即可運(yùn)行。如果僅評(píng)估已知sgRNA的脫靶效應(yīng)，可點(diǎn)擊“跳到下一步（Skip to next step）”按鈕，將進(jìn)入新的設(shè)計(jì)頁面，在CRISPR靶標(biāo)（CRISPR targets）選項(xiàng)框中輸入sgRNA，在設(shè)置脫靶效應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性（Stringency）選項(xiàng)，有2種模式供選擇：（1）高嚴(yán)謹(jǐn)性，限定種子序列完全匹配，或種子序列含1個(gè)堿基錯(cuò)配，非種子序列含少于2個(gè)堿基錯(cuò)配；（2）中等嚴(yán)謹(jǐn)性，限定種子序列完全匹配，或種子序列含1個(gè)堿基錯(cuò)配，非種子序列含少于5個(gè)堿基錯(cuò)配?；蚍N子序列含2個(gè)堿基錯(cuò)配，非種子序列含少于2個(gè)堿基錯(cuò)配。而PAM可設(shè)置為“NGG”，或“NAG”和“NGG”。對(duì)于脫靶預(yù)測(cè)，該軟件調(diào)用“TagScan Genome-wide Tag Scanner”程序，特點(diǎn)是分析12 bp種子序列的特異性。

2.1.10CRISPRdirect

該軟件［35］可設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，其提供有人、小鼠、大鼠和豬等18個(gè)物種的基因組（http：//crispr. dbcls.jp/）。對(duì)于靶基因選擇較為靈活，不僅支持直接輸入基因登錄號(hào)或基因組位點(diǎn)，還可輸入FASTA格式序列或上傳文件。PAM類型默認(rèn)為NGG，但可通過簡(jiǎn)并堿基設(shè)置其它類型。對(duì)于評(píng)估脫靶效應(yīng)，綜合考慮了全長(zhǎng)和種子序列的特異性，主要有3種規(guī)則：（1）20 bp全長(zhǎng)序列和PAM（20mer+PAM）；（2）12 bp種子序列和PAM（12mer+PAM）；（3）8 bp種子序列和PAM（8mer+PAM）。軟件最大允許脫靶位點(diǎn)含2個(gè)堿基錯(cuò)配，還考察脫靶位點(diǎn)是否有 “gap”。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“設(shè)計(jì)（Design）”按鈕即可運(yùn)行。結(jié)果輸出中除了計(jì)算sgRNA的GC含量外，還會(huì)將含有轉(zhuǎn)錄終止序列（“TTTT”）的sgRNA標(biāo)出。

2.1.11COSMID

此軟件［36］僅能評(píng)估sgRNA的特異性，提供有人、小鼠和大鼠等7個(gè)物種的基因組供分析（https：//crispr. bme.gatech.edu/crispr/）。該軟件設(shè)計(jì)的sgRNA范圍為10～55nt。PAM類型可定義為“NGG”、“NAG”或“NRG”。最大特點(diǎn)是評(píng)估脫靶位點(diǎn)中是否有堿基插入和缺失?？蓪?duì)脫靶位點(diǎn)接受的“indels”和錯(cuò)配堿基數(shù)（Allowed indels and mismatch）進(jìn)行設(shè)置，分別為：（1）不考察堿基插入與缺失（No indels），脫靶位點(diǎn)堿基數(shù)可自定義，且最大允許3個(gè)堿基錯(cuò)配；（2）單堿基缺失（1-base Del），脫靶位點(diǎn)堿基數(shù)可選，且最大允許2個(gè)堿基錯(cuò)配；（3）單堿基插入（1-base Ins），脫靶位點(diǎn)堿基數(shù)可選，且最大允許2個(gè)堿基錯(cuò)配。軟件還可針對(duì)不同測(cè)序平臺(tái)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，如“Illumina_250”，“Illumina_250_paired”和“SMRT”等測(cè)序技術(shù)，用于高通量測(cè)序驗(yàn)證脫靶。

2.1.12Off-Spotter

此軟件［37］能設(shè)計(jì)和評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)，除了在線軟件外，還提供單機(jī)版（https：//cm.jefferson. edu/Off-Spotter/）。在線軟件僅提供人，小鼠和酵母3個(gè)物種的基因組供分析。允許輸入的序列長(zhǎng)度不大于500nt；而對(duì)于脫靶分析，可同時(shí)對(duì)20條sgRNA進(jìn)行脫靶評(píng)估。有4種類型的PAM，如NGG、NAG、NNNNACA 和NNGRRT （R代表A或G）。在設(shè)置脫靶位點(diǎn)的最大堿基錯(cuò)配數(shù)（Maximum number of mismatches）選項(xiàng)，可選范圍為0～5 bp。而在選擇種子序列位置（Select the positions that you want fixed （"seed"））選項(xiàng)，有3種類型供選擇：（1）全部選擇；（2）不選擇；（3）選擇默認(rèn)，即僅包含sgRNA的3'端的5個(gè)堿基，此外還可自定義種子序列的長(zhǎng)度，這也是此軟件的特色之一。其次，軟件會(huì)判斷脫靶位點(diǎn)是否位于基因組特定位置，如未剪切的mRNA前體（pre-mRNA）、5'UTR、CDS或3'UTR、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lincRNA）等。參數(shù)設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“提交（submit）”按鈕即可運(yùn)行軟件，輸出的結(jié)果可讀性強(qiáng)。

2.1.13CCTop

此軟件［38］可用于設(shè)計(jì)和評(píng)估sgRNA的特異性，僅包含擬南芥、人和斑馬魚等8個(gè)物種的基因組供分析（http：//crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html），且最大可為500 bp的序列設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為20nt的sgRNA。對(duì)于設(shè)計(jì)sgRNA，可選擇不同PAM類型（PAM type（targeting）），如NGG或NRG，其中R代表 A 或G，還可限制sgRNA的5'和3'端堿基，在限定靶標(biāo)5'堿基（Target site 5'limitation）選項(xiàng)，可選的類型有NN、NG和GG。而在限定靶標(biāo)3'堿基（Target site 3'limitation）選項(xiàng)，可選的類型有：NN和GG。對(duì)于評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)，也可設(shè)置不同PAM類型（PAM type（evaluation）），如NGG或NRG。此外，可設(shè)置sgRNA的核心結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度（core length），即種子序列可選范圍是2～20 nt。對(duì)于核心結(jié)合位點(diǎn)最大錯(cuò)配堿基數(shù)（max. core mismatches），可選范圍是0～2 bp，而對(duì)于全長(zhǎng)結(jié)合位點(diǎn)的脫靶位點(diǎn)，允許的堿基錯(cuò)配數(shù)（max. total mismatches）最大為5 bp。設(shè)置完參數(shù)后，點(diǎn)擊“提交（submit）”按鈕即可運(yùn)行軟件。輸出的結(jié)果中會(huì)標(biāo)示sgRNA在染色體上的相對(duì)位置。

2.2單機(jī)版軟件

2.2.1CasOT

該軟件［39］可用于設(shè)計(jì)和評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)，由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授和高歌教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合開發(fā)（http：//eendb.zfgenetics.org/casot/index. php）。此軟件用Perl語言編寫，使用前，需首先在電腦上安裝Perl（http：//www.perl.org/get.html）程序，通過命令行調(diào)用。該軟件可用于評(píng)估已知單個(gè)sgRNA或“paired-gRNA”的脫靶效應(yīng)，sgRNA的長(zhǎng)度范圍為18～30nt?；蛴糜谠O(shè)計(jì)sgRNA，允許輸入的序列長(zhǎng)度不大于1 kb。有4種PAM類型供選擇：（1）NGG （默認(rèn)）；（2）NGG 和 NAG；（3）NGG、NAG 和NNGG；（4）不限。還可限定sgRNA的5'堿基組成是否為G。對(duì)于預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)，其將sgRNA劃分為種子區(qū)和非種子區(qū)。對(duì)于脫靶位點(diǎn)的種子區(qū)，即臨近PAM的12個(gè)核心序列，最大允許含6個(gè)堿基錯(cuò)配。而對(duì)于脫靶位點(diǎn)的非種子區(qū)，錯(cuò)配堿基可任意設(shè)置。對(duì)于不同物種FASTA格式的基因組和基因注釋文件，可從ensembl在線網(wǎng)站的ftp數(shù)據(jù)庫下載（http：//www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html）。

2.2.2sgRNAcas9

該軟件［40］由本實(shí)驗(yàn)室與上?？萍即髮W(xué)的黃行許教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合開發(fā)，能用于設(shè)計(jì)和評(píng)估sgRNA的脫靶效應(yīng)（http：//www.biootools.com/）。此軟件包有8個(gè)功能不同的小程序，最新版本為V3.0.5，均由Perl語言編寫，可方便在不同操作平臺(tái)如Windows和linux等操作系統(tǒng)中使用，運(yùn)行環(huán)境僅需提前安裝Perl。使用前，需從ensembl的ftp數(shù)據(jù)庫下載目標(biāo)物種的基因組和基因注釋文件。大致操作流程如下：（1）通過命令行調(diào)用“combine_genome.pl”程序，將下載的不同染色體序列合并為FASTA格式的單一基因組文件；（2）用“format_genome.pl”程序處理基因組文件；（3）調(diào)用核心程序“sgRNAcas9.pl”設(shè)計(jì)sgRNA并進(jìn)行脫靶效應(yīng)評(píng)估。可設(shè)置的參數(shù)有：①sgRNA的長(zhǎng)度，限定范圍為17～20nt；②sgRNA 的GC%含量，可限定最大值和最小值，默認(rèn)為20%～80%；③對(duì)于靶標(biāo)在DNA鏈上的位置，可限定sgRNA僅定位于正義鏈、反義鏈或雙鏈；④既可設(shè)計(jì)單個(gè)sgRNA，還可設(shè)計(jì)“paired-gRNA”。如果設(shè)計(jì)“paired-gRNA”，可限定兩個(gè)sgRNA之間距離最大值和最小值，默認(rèn)值為-2～32 bp。靶標(biāo)位點(diǎn)PAM類型為NGG，而對(duì)于脫靶評(píng)估，PAM類型為NGG和NAG。sgRNA與脫靶位點(diǎn)的堿基錯(cuò)配數(shù)可設(shè)置的范圍為0～5 bp，還自動(dòng)排除含“TTTT”終止序列的sgRNA。該軟件對(duì)于脫靶效應(yīng)評(píng)估，除了統(tǒng)計(jì)sgRNA全長(zhǎng)序列堿基錯(cuò)配位點(diǎn)情況，還考察臨近PAM的12 bp種子序列的特異性；（4） 利用從ensembl的ftp數(shù)據(jù)庫下載的基因注釋文件，可用“ot2gtf_v2.pl”和“pot2gtf_v2.pl”程序，進(jìn)一步確定脫靶位點(diǎn)是否位于其它基因內(nèi)；（5）利用“sgRPrimer.pl”程序，可批量設(shè)計(jì)用于構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體的引物；（6）利用“extract_targetSeq.pl”程序，可批量提取靶標(biāo)位點(diǎn)或預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)兩側(cè)一定長(zhǎng)度的基因組序列，以用于設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。

2.2.3SSFinder

該軟件［41］可設(shè)計(jì)sgRNA并進(jìn)行脫靶分析（https： //code.google.com/p/ssfinder/）。此軟件用Python語言編寫，運(yùn)行環(huán)境需安裝有Python（V2.2及以上版本）。PAM類型僅考慮“NGG”，脫靶位點(diǎn)分析考慮了12個(gè)堿基的種子序列特異性。設(shè)計(jì)的sgRNA有4種類型：（1） G/CN7S11G/C；（2） G/CN7S11A/T；（3） A/TN7S11A/T和（4） A/TN7S11G/C（N代表4種任意堿基，S代表種子序列），即限定5'堿基類型。

3　基因組編輯效率與脫靶檢測(cè)方法及軟件

3.1生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

目前，用于檢測(cè)CRISPR/Cas9技術(shù)基因組編輯效率和脫靶的實(shí)驗(yàn)方法較多。下面闡述幾種主要方法的特點(diǎn)：

（1）限制性核酸內(nèi)切酶法。該方法的特點(diǎn)是選擇靶標(biāo)位點(diǎn)含限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的sgRNA。當(dāng)靶標(biāo)位點(diǎn)被切割后，相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列會(huì)被破壞，由此可用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，檢測(cè)DNA靶標(biāo)是否被切割［42］?；蛘咴谔峁┑耐垂wDNA中，插入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別堿基序列，使其通過同源重組插入到靶標(biāo)位點(diǎn)。再通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，以此方法來判斷靶標(biāo)位點(diǎn)是否發(fā)生同源重組［42］。

（2）Surveyor酶切法（Surveyor endonuclease I cleavage assays）。Surveyor酶是一種S1核酸內(nèi)切酶，能特異性識(shí)別并切割異源雙鏈中錯(cuò)配的堿基，電泳分離酶切產(chǎn)物，可根據(jù)條帶大小判斷是否有基因組切割。該方法最初用于檢測(cè)ZFN和TALEN技術(shù)介導(dǎo)的基因組編輯，可檢測(cè)靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)是否有堿基替換或“Indels”，目前有用于CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因組編輯的報(bào)道［23］。

（3）T7E1酶切法（T7 endonuclease I cleavage assays）。T7E1內(nèi)切酶能識(shí)別并切割不完美匹配的DNA、十字形DNA結(jié)構(gòu)、Holliday結(jié)構(gòu)或DNA分叉點(diǎn)及異源二聚體DNA。T7E1酶切法是目前檢測(cè)CRISPR/ Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因組編輯效率的常用方法之一［2～4］。與Surveyor酶切法類似，該酶識(shí)別錯(cuò)配的雜合雙鏈，能根據(jù)電泳條帶亮度強(qiáng)弱計(jì)算“Indels”頻率。

（4）高分辨率熔解曲線法（High-resolution melting，HRM）。該方法的基本原理是依據(jù)DNA雙鏈分子不同的溶解曲線來區(qū)分不同基因型的樣品，且分辨率能達(dá)到單堿基水平。Bassett等［43］利用該方法，檢測(cè)了利用CRISPR/Cas9技術(shù)基因敲除的果蠅。研究表明，該方法能較好區(qū)分嵌合體和雜合突變體果蠅，也適用于檢測(cè)基因組編輯效率高低［43，44］。

（5）單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序法（Single molecule real time （SMRT?） DNA sequencing）。此為第三代高通量測(cè)序技術(shù)，由Pacific Biosciences公司開發(fā)。Hendel等［45］利用該方法，分別檢測(cè)了ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率，發(fā)現(xiàn)該方法可同時(shí)評(píng)估NHEJ和HR介導(dǎo)的基因突變或修復(fù)效率。

（6）中性聚丙烯酰胺凝膠電泳法。該技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理是，在中性聚丙烯酰胺凝膠中，不同構(gòu)象等長(zhǎng)的DNA單鏈電泳遷移率會(huì)發(fā)生變化，由此來判斷基因是否發(fā)生突變。Zhu等［46］采用該方法，分析了利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備的果蠅模型的基因型。研究發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)能準(zhǔn)確判定不同突變類型果蠅的基因型。

（7）SSA （Single-strand annealing）報(bào)告載體活性檢測(cè)法。該方法的核心是使用SSA報(bào)告基因載體，該載體中Luciferase報(bào)告基因被終止密碼子提前終止，這種截短的Luciferase蛋白沒有活性。如將sgRNA的靶標(biāo)位點(diǎn)置于終止密碼子之后。若靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生基因組編輯，可通過同源重組形成有活性的Luciferase，再通過檢測(cè)Luciferase活性高低，即可評(píng)估CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編輯效率［47］。

（8）Sanger測(cè)序法。該方法為檢測(cè)CRISPR/Cas9技術(shù)基因組編輯效率常用方法之一［5］?？芍苯訉CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或連接到TA克隆載體中，再挑選單克隆菌落測(cè)序，該方法不僅能確定堿基缺失或插入類型，還可計(jì)算切割效率大小，但缺點(diǎn)是靈敏度較低。

對(duì)于基因組編輯效率和特異性評(píng)估，除了上述檢測(cè)方法外，最近新開發(fā)有幾種高通量和無偏評(píng)估方法：①整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLVs）技術(shù)，其原理是細(xì)胞通過NHEJ機(jī)制對(duì)DNA修復(fù)的過程中，線性雙鏈IDLV基因組能夠優(yōu)先整合到斷裂的DNA雙鏈處。該方法最初用于評(píng)估ZFN技術(shù)的基因組編輯效率［48］。2015年，Wang等［25］將此方法用于評(píng)估CRISPR/Cas9和TALENs技術(shù)的基因組編輯效率。研究表明，在靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)60 bp范圍內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)成簇的IDLV整合位點(diǎn)。該技術(shù)僅能檢測(cè)到頻率低至1%的脫靶突變，靈敏度較低，但卻是從全基因組水平無偏檢測(cè)脫靶效應(yīng)。②GUIDE-seq（Genome-wide unbiased identifications of DSBs evaluated by sequencing）技術(shù)，該方法的原理是讓細(xì)胞吸收特定的雙鏈寡核苷酸（Double stranded oligodeoxynucleotides， dsODN）并整合進(jìn)基因組斷裂位點(diǎn)。然后抽提基因組DNA，隨機(jī)打斷后修復(fù)末端，連接用于高通量測(cè)序的接頭。然后對(duì)dsODN的特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集包含dsODN的片段并進(jìn)行高通量測(cè)序，最后利用軟件分析Cas9核酸酶的切割位點(diǎn)，由此評(píng)估脫靶效應(yīng)［49］。研究顯示，該方法的靈敏度較高，能檢測(cè)到頻率低至0.1%的脫靶突變［39］。③Digenomeseq（Cas9 nuclease-digested whole genome sequencing）技術(shù)，其原理是利用全基因組測(cè)序法，尋找CRISPR/ Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因組打靶和脫靶位點(diǎn)。大致流程是用Cas9核酸酶在試管中消化細(xì)胞的基因組DNA，然后通過高通量方法進(jìn)行全基因組測(cè)序。這種體外消化可使得打靶和脫靶位點(diǎn)產(chǎn)生獨(dú)特的序列模式，通過軟件即可計(jì)算基因組編輯效率。研究表明，此方法靈敏度同樣較高，可檢測(cè)插入或缺失頻率為0.1%的脫靶突變［50］。

3.2基因組編輯效率評(píng)估軟件

針對(duì)上述檢測(cè)方法，開發(fā)相關(guān)軟件用于基因組切割效率定量分析，如CRISPR-GA（CRISPR Genome Analyzer， http：//54.80.152.219/）［51］。該軟件針對(duì)Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)，分析通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)，以此評(píng)估堿基敲除和插入效率。其分析流程是：Miseq reads質(zhì)量控制、定位、檢測(cè)堿基插入/缺失（Indel calling）、計(jì)算HR 和NHEJ和結(jié)果輸出。該軟件操作簡(jiǎn)單，僅需輸入上下游測(cè)序數(shù)據(jù)和靶標(biāo)位點(diǎn)序列即可。其次是TIDE在線軟件［52］，由R語言編寫（http：//tide.nki.nl/）。該軟件可針對(duì)Sanger測(cè)序法，分析色譜圖（Chromatogram）來計(jì)算堿基插入和缺失頻率，可用于計(jì)算基因組編輯效率和脫靶。

4　問題與展望

利用CRISPR/Cas9技術(shù)關(guān)鍵的兩個(gè)問題是：如何提高CRISPR/Cas9技術(shù)基因組編輯效率？如何最大限度降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)？綜上所述，影響基因組編輯效率和特異性的因素很多。目前業(yè)界對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯效率和脫靶效應(yīng)研究尚不夠深入，觀點(diǎn)還不統(tǒng)一。這反映在不同sgRNA設(shè)計(jì)與脫靶預(yù)測(cè)軟件中，對(duì)sgRNA的活性和特異性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)不一致。比如“CRISPR Design”軟件對(duì)脫靶位點(diǎn)最大僅考慮4個(gè)堿基錯(cuò)配，未考慮種子序列的特異性。而sgRNAcas9軟件允許脫靶位點(diǎn)最大含 5個(gè)堿基錯(cuò)配，還考察了長(zhǎng)度為12 bp的種子序列。CRISPRdirect和COSMID軟件將脫靶位點(diǎn)是否存在堿基插入與缺失納入評(píng)估范圍，Off-Spotter軟件允許自定義種子序列位置和長(zhǎng)度。E-CRISP軟件還評(píng)估sgRNA與脫靶位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及基因組位置等。目前很多軟件并未對(duì)預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，因而無法比較不同軟件評(píng)估脫靶效應(yīng)算法靈敏度高低。

sgRNA和PAM類型影響基因組編輯效率和特異性，而不同sgRNA活性和特異性有差異。因此，選擇sgRNA需慎重。選擇高效且特異的sgRNA需要注意的因素有：（1）sgRNA的長(zhǎng)度為17～20nt；（2）可選3'末端含GG的sgRNA，避免使用含“TTTT”轉(zhuǎn)錄終止序列的sgRNA，GC%含量為40%～60%；（3）如果構(gòu)建U6或T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sgRNA表達(dá)載體，為提高轉(zhuǎn)錄效率，可限定sgRNA的5'末端為G或GG；（4）如需造成基因移碼突變，盡量選擇在功能域或編碼區(qū)內(nèi)部設(shè)計(jì)sgRNA；（5）檢查sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)基因組序列是否存在SNPs；（6）針對(duì)Cas9單切口酶設(shè)計(jì)“paired-gRNA”，需限定兩個(gè)sgRNA之間的距離，建議為-2～32nt；（7）分析脫靶位點(diǎn)可限定最大允許5個(gè)堿基錯(cuò)配，并同時(shí)評(píng)估種子序列的特異性。另外還可評(píng)估是否存在堿基插入或缺失。總之，應(yīng)選擇合適的軟件設(shè)計(jì)sgRNA并進(jìn)行脫靶分析。一個(gè)基因建議選擇2～3個(gè)sgRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，再選擇活性高的sgRNA開展下一步的功能實(shí)驗(yàn)。

在對(duì)上述資料分類整理的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室建立了一個(gè)CRISPR-Cas9技術(shù)資源信息網(wǎng)（http：//www.biootools.com/cn/），以方便廣大科研工作者使用。與其他基因組編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單且功能強(qiáng)大。因此，該技術(shù)不僅在模式動(dòng)物基因功能研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，也在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（如豬）的遺傳育種領(lǐng)域得到開發(fā)，并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。Hai等［6］率先利用CRISPR/ Cas9技術(shù)，結(jié)合受精卵顯微注射法獲得了vWF基因遺傳修飾豬。Sato等［7］利用該技術(shù)成功敲除豬胚胎成纖維細(xì)胞的α-1， 3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因。Whitworth等［8］利用該技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)或受精卵顯微注射方法，獲得了CD163 和CD1D基因敲除豬。Zhou等［9］利用此技術(shù)，同樣結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功構(gòu)建了酪氨酸酶基因和PARK2與PINK1雙基因敲除小型豬，并且分別建立了人類白化病和帕金森綜合征豬模型。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)目前存在編輯效率低且具有一定的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，但隨著研究的深入，這些問題勢(shì)必會(huì)得到解決，即可推進(jìn)功能基因組學(xué)和分子育種領(lǐng)域的發(fā)展。

附錄：附表見文章電子版：www.chinagene.cn。

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（責(zé)任編委： 張博）

sgRNA design for the CRISPR/Cas9 system and evaluation of its off-target effects

Shengsong Xie1， Yi Zhang2， Lisheng Zhang1， Guanglei Li1， Changzhi Zhao1，Pan Ni1， Shuhong Zhao1

1. Key Lab of Agricultural Animal Genetics， Breeding， and Reproduction of Ministry of Education， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;
2. Department of Obstetrics and Gynecology， No.161 Hospital of PLA， Wuhan 430010， China

The third generation of CRISPR/Cas9-mediated genome editing technology has been successfully applied to genome modification of various species including animals， plants and microorganisms. How to improve the efficiency of CRISPR/Cas9 genome editing and reduce its off-target effects has been extensively explored in this field. Using sgRNA （Small guide RNA） with high efficiency and specificity is one of the critical factors for successful genome editing. Several software have been developed for sgRNA design and/or off-target evaluation， which have advantages and disadvantages respectively. In this review， we summarize characters of 16 kinds online and standalone software for sgRNA design and/or off-target evaluation and conduct a comparative analysis of these different kinds of software through developing 38 evaluation indexes. We also summarize 11 experimental approaches for testing genome editing efficiency and off-target effects as well as how to screen highly efficient and specific sgRNA.

CRISPR/Cas9 system； genome editing； sgRNA； off-target effects

2015-03-02；

2015-06-18

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（編號(hào)：2662015BQ005），廣東省分子與細(xì)胞工程育種團(tuán)隊(duì)（編號(hào)：2011A020102003）和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31301226）資助

謝勝松，副研究員，研究方向：動(dòng)物功能基因組與疾病診治。E-mail： ssxie@mail.hzau.edu.cn

趙書紅，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物分子生物學(xué)與育種。E-mail： shzhao@mail.hzau.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-093

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間： 2015-8-49：37：06

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