劉改改，李爽，韋余達(dá)，張永賢，丁秋蓉

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所，上海 200031

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對人多能干細(xì)胞進(jìn)行高效基因組編輯

劉改改，李爽，韋余達(dá)，張永賢，丁秋蓉

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所，上海 200031

CRISPR/Cas9技術(shù)提供了一個全新的基因組編輯體系。本文利用CRISPR/Cas9平臺，在人胚胎干細(xì)胞株中對選取的一段特定基因組區(qū)域進(jìn)行了多種基因組編輯：通過在基因編碼框中引入移碼突變進(jìn)行基因敲除；通過單鏈DNA提供外源模板經(jīng)由同源重組定點敲入FLAG序列；通過同時靶向多個位點誘導(dǎo)基因組大片段刪除。研究結(jié)果表明CRISPR/Cas9可以對多能干細(xì)胞進(jìn)行高效基因編輯，獲得的突變干細(xì)胞株有助于對基因和基因組區(qū)域的功能進(jìn)行分析和干細(xì)胞疾病模型的建立。

CRISPR/Cas9基因編輯；人多能干細(xì)胞；基因敲除；DNA序列定點插入；基因組大片段刪除

網(wǎng)絡(luò)出版時間： 2015-9-1611：06：06

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150916.1106.004.html的基因突變和疾病發(fā)生具有強(qiáng)烈相關(guān)性［1］。深入解析這些遺傳突變，并建立攜帶特定遺傳突變的疾病模型用于針對性的藥物篩選，將極大提高對疾病致病機(jī)理的認(rèn)識和加速疾病防治方案的開發(fā)。

人類多能干細(xì)胞（Human pluripotent stem cells，hPSCs）和基因組編輯技術(shù)結(jié)合所建立的細(xì)胞模型，為疾病研究提供了一個獨特的實驗平臺。利用這個平臺體系，研究人員可以研究特定基因突變甚至染色體結(jié)構(gòu)變異對人類多種細(xì)胞類型和組織器官功能的影響及其詳細(xì)的分子機(jī)制，并可建立攜帶不同遺傳突變的“個性化”疾病模型用于大規(guī)模藥物篩選。該模型體系的建立得益于基因組編輯技術(shù)，尤其是CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9，CRISPR/ Cas9）技術(shù)的飛速發(fā)展。目前常用的CRISPR/ Cas9平臺是從化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)優(yōu)化而來，由SpCas9核酸酶和gRNA構(gòu)成［2～5］。其中SpCas9核酸酶識別基因組中的PAM （Protospacer adjacent motif）序列，gRNA中長約20 bp的引導(dǎo)序列決定靶向特異性。當(dāng)基因組上位于PAM 5′端的前體間隔序列（Protospacer）與gRNA中的引導(dǎo)序列互補(bǔ)時，Cas9核酸酶啟動對DNA雙鏈進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂缺口（Double-strand breaks，DSBs）。DSBs能激活細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接（Non-homologous end joining， NHEJ）和同源重組（Homology directed repair， HDR）兩種DNA修復(fù)機(jī)制。NHEJ修復(fù)過程可以引入堿基的隨機(jī)插入或者缺失（Insertion or deletion）；而在外源模板存在的情況下，細(xì)胞也可以通過HDR的方式對基因組進(jìn)行精確修復(fù)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，本實驗室建立了在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除或者敲入的基因組編輯體系［6，7］。本研究以位于人2號染色體上的LINC00116基因組區(qū)域為例，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對人多能干細(xì)胞中的該基因組區(qū)域進(jìn)行了基因敲除、FLAG短肽序列定點插入和基因組大片段刪除，獲得的多個突變干細(xì)胞株為下一步對該基因組區(qū)域進(jìn)行功能分析提供了特有的細(xì)胞平臺。

1　材料和方法

1.1CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

通過Online軟件（http：//www.genome-engineering.org）針對特定基因組區(qū)域進(jìn)行CRISPR靶向序列設(shè)計和脫靶位點預(yù)測，或者通過對靶向位點附近序列進(jìn)行觀察，尋找符合要求的序列，進(jìn)一步通過序列比對確認(rèn)特異性后獲得靶向序列。將靶向序列（20 bp）克隆入pgRNA_cloning vector （Addgene，http：//www. addgene.org/）獲得gRNA質(zhì)粒。pCas9-GFP質(zhì)粒來自Addgene。文中用到的靶向序列（下劃線為PAM）分別是：ORF靶向：5′-GTGCTAGTAGCCTTCGCTTCTGG-3′；FLAG定點敲入：5′-GGCGGAAGGCGCAGAGTCTCAGG -3′；大片段刪除：5′-GTAACACATGCCCAGAGGCAGGG -3′和5′-GCTAAGCCTCCAGTACAATGTGG -3′。FLAG-ssODN（Singlestranded oligodeoxynucleotide）序列為（下劃線為FLAG編碼序列）：5′-GCAAGGTGGCCATGAGGGGGACAGAATGGGGCGGAAGGCGCAGAGTCT CACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC GGCCAGG TCCAGCTTCTTCTGCGTCGCCGCCAGCTTGTCC TGCAGCCTC-3′，購自美國IDT（Integrated DNA Technoliges）公司。

1.2gRNA靶向活性鑒定

為鑒定gRNA的靶向活性，Cas9質(zhì)粒分別和不同的gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。48 h后對細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA抽提，并對靶向位點附近的基因組序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增（產(chǎn)物長度為300～500 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后利用Surveyor Mutation Delection試劑盒（Transgenomic，USA）進(jìn)行活性分析。

1.3hPSCs培養(yǎng)和電穿孔

人胚胎干細(xì)胞株HUES9［8］在mTeSR1培養(yǎng)基（STEMCELL Technologies，Canada）中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿預(yù)先用Geltrex（Life Technologies，USA）處理，每24 h更換新鮮mTeSR1培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)80%時用Accutase（STEMCELL Technologies，Canada）消化傳代。

細(xì)胞在電穿孔前用10 μmol/L ROCK 抑制劑（Santa Cruz Biotechnologies，USA）預(yù)處理3～4 h，隨后用Accutase消化為單細(xì)胞懸液。對細(xì)胞計數(shù)后將1×107個細(xì)胞重懸至800 μL預(yù)冷的PBS中，加入25 μg pCas9-GFP質(zhì)粒和25 μg gRNA表達(dá)質(zhì)?；蛘?5 μg pCas9-GFP質(zhì)粒、15 μg gRNA表達(dá)質(zhì)粒和30 μg FLAG-ssODN后混合。將約800 μL細(xì)胞與DNA混合液轉(zhuǎn)移至0.4 cm電穿孔杯（Bio-Rad， USA）中，冰上孵育5 min，在電穿孔儀（Bio-Rad， USA）中用250 V和500 μF的條件進(jìn)行電穿孔。電穿孔后加入適量培液進(jìn)行細(xì)胞重懸，再度離心去除死細(xì)胞后種下。

1.4細(xì)胞分選和單克隆分離

電穿孔48 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）以確定CRISPR/Cas9質(zhì)粒成功表達(dá)。細(xì)胞用Accutase消化為單細(xì)胞懸液后離心重懸于PBS中，通過流式分選出綠色熒光表達(dá)細(xì)胞，以每塊10 cm培養(yǎng)皿15～30 K個細(xì)胞的密度種下。細(xì)胞恢復(fù)生長3～4 d后鏡下可見單克隆，10 d左右單克隆被挑選分離至96孔板中。當(dāng)96孔板中細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，進(jìn)行細(xì)胞消化傳代，獲得兩塊同樣的96孔板細(xì)胞，一塊用于繼續(xù)培養(yǎng)，另一塊貼壁恢復(fù)生長一段時間后用于基因組DNA抽提和基因型鑒定。

1.5基因型鑒定

用于基因型鑒定的96孔板在細(xì)胞密度長至80%～ 90%時，PBS洗去培養(yǎng)基后每孔加入50 μL細(xì)胞裂解液（10 mmol/L Tris pH 7.5，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，0.5% Sarcosyl，40 μg/mL蛋白酶K）在56～60℃孵育過夜裂解細(xì)胞。隨后每孔加入100 μL預(yù)冷的95%乙醇和75 mmol/L NaCl在室溫或-20℃孵育1 h進(jìn)行離心沉淀DNA。75%乙醇漂洗2遍后室溫晾干，每孔用30 μL的ddH2O或者TE緩沖液加0.1 mg/mL RNase A進(jìn)行DNA溶解。

溶解獲得的基因組DNA用于下一步PCR鑒定基因型。設(shè)計PCR引物對靶向位點附近的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為150～200 bp。PCR產(chǎn)物首先通過2.5%的瓊脂糖膠電泳鑒定，攜帶NHEJ引入的堿基插入或缺失或者通過HDR定點插入FLAG序列的PCR產(chǎn)物在膠上會表現(xiàn)出位移。潛在陽性單克隆的PCR產(chǎn)物通過Sanger測序進(jìn)一步確認(rèn)序列或者克隆到T載體中測序確認(rèn)序列。

2　結(jié)果與分析

2.1干細(xì)胞基因編輯體系建立

本課題組前期利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了一個對人多能干細(xì)胞株進(jìn)行基因組編輯的平臺體系（圖1）［6，7，9］。該體系包含兩個質(zhì)粒，一個是由CAG（CMV early enhancer/chicken beta actin promoter）啟動的SpCas9表達(dá)質(zhì)粒，并以2A肽段連接的方式同時表達(dá)GFP熒光蛋白，作為下游篩選標(biāo)記；另一個質(zhì)粒包含U6啟動的gRNA元件，可以通過簡單的酶切連接方式獲得具有特定靶向序列的gRNA質(zhì)粒。實驗流程主要包括電穿孔、流式分選、單克隆形成、單克隆基因型鑒定和擴(kuò)增等步驟。同批實驗的多個突變克隆和野生型克隆可用于后期研究。

圖1　利用CRISPR/Cas9靶向人多能干細(xì)胞流程示意圖

2.2基因敲除

近期一項針對小鼠中長鏈非編碼RNA（Long intergenic noncoding RNA， lincRNA）的大規(guī)模篩選表明，若干非編碼RNA和脂肪分化緊密相關(guān)，其中一條名稱為lnc-RAP-5［10］。LINC0016為lnc-RAP-5人種屬中相應(yīng)的同源基因，它位于人2號染色體上，總長約15 kb。通過對這段基因組區(qū)域的基因編碼框和物種保守性分析，發(fā)現(xiàn)在LINC00116基因第7個外顯子中存在一個物種保守性很高的基因編碼框（Open reading frame， ORF），提示在前期研究中被預(yù)測為非編碼的LINC00116基因組區(qū)域有可能編碼蛋白。為探究這種可能性，確認(rèn)該ORF是否編碼蛋白，以及其在脂肪分化中可能的作用，本文首先利用CRISPR/Cas9靶向該編碼區(qū)，通過引入移碼突變獲得基因敲除干細(xì)胞株（圖2A）。靶向后共獲得162個單克隆。進(jìn)一步對獲得的單克隆進(jìn)行靶向基因組區(qū)域的PCR擴(kuò)增和測序，成功鑒定出93個突變克隆（突變率約57%），其中雙等位基因具有相同序列突變的純合子克隆有14個（純合率約8.6%），雙等位基因帶有不同突變的復(fù)合型雜合子克隆有9個（復(fù)合雜合子率約5.6%），剩余單等位基因突變雜合子克隆有70個（單突變雜合子率約43%）。對突變克隆的序列分析顯示突變一般發(fā)生在位于PAM 5′端的3個堿基附近，堿基插入或缺失的數(shù)目均小于20 bp，絕大部分在10 bp以內(nèi)，最常見的為1 bp堿基插入和5 bp堿基缺失（圖2B）。

圖2　利用CRISPR/Cas9敲除基因

圖3　利用CRISPR/Cas9定點敲入FLAG序列

2.3FL AG短肽序列的定點敲入

由于缺乏合適的內(nèi)源蛋白抗體，為確定該基因編碼框是否編碼蛋白，本文在終止密碼子前定點敲入編碼FLAG小肽的DNA序列，用FLAG小肽標(biāo)記內(nèi)源蛋白，因而后期可以通過FLAG抗體對內(nèi)源蛋白的表達(dá)和功能進(jìn)行檢測。gRNA序列靶向終止密碼子，在HEK293T細(xì)胞中的活性檢測中顯示較高的靶向活性（附圖1）。單鏈核苷酸FLAG- ssODN攜帶FLAG編碼序列以及靶向序列兩邊長為50 bp的同源臂序列作為外源模板。Cas9-GFP、gRNA和FLAG-ssODN同時導(dǎo)入多能干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯（圖3A）。靶向后共獲得450個單克隆。通過PCR對靶向位點附近的基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)成功插入FLAG序列（24 bp）的克隆在瓊脂糖電泳中相比野生型克隆顯示明顯的位移（圖3B），也同時存在若干經(jīng)由NHEJ修復(fù)過程引入堿基插入或缺失突變而產(chǎn)生的突變克隆（圖3B）。隨后通過對潛在陽性克隆進(jìn)行測序進(jìn)一步確認(rèn)FLAG序列的正確插入（圖3C）。最終鑒定結(jié)果顯示1共獲得5個陽性克隆，其中一個克隆的兩條等位基因中均有正確FLAG序列插入，定點插入效率約1.1%。

2.4基因組大片段刪除

為同時研究LINC00116的生物學(xué)功能，以及LINC00116和ORF編碼蛋白之間的生物學(xué)聯(lián)系，本文將全部LINC00116基因組區(qū)域（約15 kb）進(jìn)行大片段刪除后觀察對細(xì)胞功能的影響。兩條gRNAs序列分別靶向LINC00116基因組區(qū)域兩邊，在HEK293T細(xì)胞的活性檢測中均顯示出較高的靶向活性（附圖1）。將兩條gRNA同時導(dǎo)入細(xì)胞后，基因組區(qū)域兩邊產(chǎn)生DSBs，有部分細(xì)胞因而發(fā)生大片段缺失（圖4A），靶向后一共獲得190個克隆。通過PCR進(jìn)行陽性克隆篩選，首先在靶向位點的兩邊設(shè)計PCR引物（第1對引物），發(fā)生大片段缺失的陽性克隆能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，野生型克隆由于中間序列很長而不會有PCR產(chǎn)物生成（圖4B，上方電泳圖）；隨后通過針對大片段中間序列設(shè)計引物（第1對引物）對獲得的陽性克隆中大片段缺失是發(fā)生在1條等位基因還是同時發(fā)生在兩條等位基因中進(jìn)行分析（圖4B，下方電泳圖）。結(jié)果顯示在11個單克隆中發(fā)生了大片段缺失（陽性率約5.6%），其中一個單克隆的兩條等位基因中均發(fā)生了片段缺失（圖4B）。PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了大片段缺失（圖4C）。

3　討　論

本研究以位于人2號染色體上的LINC00116基因組區(qū)域為例，通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功在人胚胎干細(xì)胞株HUES9中進(jìn)行了多種基因編輯：通過在基因編碼框中引入移碼突變敲除基因；通過單鏈核苷酸提供外源同源模板經(jīng)由同源重組定點敲入FLAG序列；通過同時導(dǎo)入兩條gRNAs誘導(dǎo)基因組大片段缺失。各種突變效率比較顯示通過NHEJ過程引入堿基插入或缺失產(chǎn)生移碼突變的效率最高，在本研究中效率為57%，其中在兩個等位基因中同時發(fā)生堿基插入或缺失的突變效率為14%。利用CRISPR對多能干細(xì)胞中多個基因組區(qū)域進(jìn)行靶向的研究結(jié)果顯示，經(jīng)由NHEJ引入堿基插入或缺失突變的效率均大于50%［6］，提示利用CRISPR技術(shù)可以進(jìn)行高效的基因敲除，甚至多個基因的同時敲除。

圖4　利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因組大片段刪除。

在由同源重組敲入特定點突變或者外源序列方面，本研究通過單鏈核苷酸模板定點敲入FLAG小肽序列的效率偏低，僅為1.1%。后期或可嘗試從以下幾個方面提高重組效率：（1）增加單鏈核苷酸模板中同源臂的長度。本文中單鏈核苷酸模板兩邊同源臂長度為50 bp，但受單鏈核苷酸體外合成長度的限制（目前≤200 bp），同源臂長度一般小于100 bp；（2）構(gòu)建質(zhì)粒載體作為外源模板。利用質(zhì)粒載體可以大幅度增加同源臂長度，并且可以引入抗性基因表達(dá)框經(jīng)由藥物篩選富集成功重組的細(xì)胞。本實驗室前期通過兩邊攜帶500 bp長度同源臂和嘌呤霉素（Puromycin）篩選基因的質(zhì)粒載體成功在多個基因組位點定點插入GFP報告基因，陽性克隆效率＞60%（未發(fā)表數(shù)據(jù)）；（3）提高gRNA的靶點活性。篩選更高活性的gRNA靶向序列可能有助于提高重組效率；（4）抑制NHEJ過程。由于細(xì)胞在DNA修復(fù)過程中NHEJ和HDR是兩個相互拮抗的過程，抑制NHEJ過程可以相應(yīng)提高HDR效率。多個研究組已經(jīng)成功通過體外篩選找到抑制NHEJ修復(fù)過程的小分子化合物［11～13］。在基因靶向同時通過此類小分子化合物處理細(xì)胞，可以達(dá)到增強(qiáng)HDR過程而提高DNA序列敲入效率的目的。

本文利用同時導(dǎo)入兩條gRNA對基因組區(qū)域進(jìn)行了大片段靶向刪除，效率約為5%。靶向刪除基因組大片段的效率不僅和每條gRNA的基因編輯活性相關(guān)，同時也和片段長度相關(guān)。靶向刪除片段長度的增加可能帶來效率的降低［14］。此外，導(dǎo)入兩條或者多條gRNAs，不僅可以引入基因組區(qū)域缺失，同時還可以引發(fā)其他多種染色體結(jié)構(gòu)變異［15，16］，包括染色體區(qū)域插入（Insertion）、重復(fù)（Duplication）、易位（Translocation）和倒位（Inversion）等，為模擬染色體結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致的人類疾病提供了一個合適的平臺。

基因靶向潛在的問題是脫靶效應(yīng)。本研究組和其他研究組前期通過對靶向得到的干細(xì)胞單克隆株進(jìn)行全基因組測序分析脫靶情況［17～19］。結(jié)果顯示TALEN和CRISPR靶向后得到的干細(xì)胞克隆中脫靶率均很低，提示在保證靶向序列的高度特異性、控制基因編輯蛋白表達(dá)強(qiáng)度和時間的情況下，脫靶現(xiàn)象是可以避免的。值得注意的是，在全基因組測序中，研究人員發(fā)現(xiàn)很多單克隆（包括突變株和同批的野生型細(xì)胞株），相比編輯前的干細(xì)胞母株，產(chǎn)生若干新的點突變［9，17～19］。由于這些點突變附近基因組序列和靶向序列沒有任何相似性，因此推測是在細(xì)胞培養(yǎng)和傳代中隨機(jī)發(fā)生，其中少數(shù)位于基因編碼區(qū)而造成氨基酸突變。這種隨機(jī)突變的獲得提示基因靶向后獲得的每個單克隆都可能存在靶向引入突變外的基因組序列上的差別。因而，在建立干細(xì)胞疾病模型對特定基因突變進(jìn)行功能分析時，為避免這種隨機(jī)突變對細(xì)胞表型的影響，實驗設(shè)計需要對多個野生型和突變型克隆同時進(jìn)行表型比對，在多個干細(xì)胞母株中進(jìn)行疾病模型建立，并利用多種對照組設(shè)計（如在基因敲除克隆中通過引入外源質(zhì)粒恢復(fù)基因表達(dá)）等進(jìn)行綜合分析。

CRISPR基因組編輯技術(shù)平臺由于載體構(gòu)建簡單、靶向位點選擇靈活、靶向效率穩(wěn)定，目前已經(jīng)被廣泛用于各類細(xì)胞和模式動物的基因組編輯［20］，它在干細(xì)胞平臺中的應(yīng)用潛力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了本文涉及的這幾個方面?？梢灶A(yù)見，基因組編輯技術(shù)和干細(xì)胞平臺的結(jié)合將極大提高人們對生命科學(xué)的認(rèn)識，推動精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展，加速細(xì)胞治療和基因治療等新一代醫(yī)藥方案的開發(fā)。

附錄：附圖1見電子版 www.chinagene.cn。

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［20］ Hsu PD， Lander ES， Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell， 2014，157（6）： 1262-1278.

（責(zé)任編委： 張博）

Efficient genome editing in human pluripotent stem cells through CRISPR/Cas9

Gaigai Liu， Shuang Li， Yuda Wei， Yongxian Zhang， Qiurong Ding
Institute for Nutritional Sciences， Shanghai Institutes for Biological Sciences， Shanghai 200031， China

The RNA-guided CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-associated Cas9 nuclease has offered a new platform for genome editing with high efficiency. Here， we report the use of CRISPR/Cas9 technology to target a specific genomic region in human pluripotent stem cells. We show that CRISPR/Cas9 can be used to disrupt a gene by introducing frameshift mutations to gene coding region； to knock in specific sequences （e.g. FLAG tag DNA sequence） to targeted genomic locus via homology directed repair； to induce large genomic deletion through dual-guide multiplex. Our results demonstrate the versatile application of CRISPR/Cas9 in stem cell genome editing， which can be widely utilized for functional studies of genes or genome loci in human pluripotent stem cells. Keywords： CRISPR/Cas9 genome editing； human pluripotent stem cells； gene disruption； targeted DNA insertion； largegenomic deletion

附圖1　gRNA靶向活性鑒定。

2015-05-29；

2015-06-24

上海市浦江人才計劃（編號：15PJ1409200）資助

劉改改，碩士，助理研究員，研究方向：干細(xì)胞治療。E-mail： liugaigai@sibs.ac.cn

丁秋蓉，博士，研究員，研究方向：干細(xì)胞與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。E-mail： qrding@sibs.ac.cn

10.16288/j.yczz.15-240

基因組測序技術(shù)的發(fā)展極大推動了人類對各類疾病遺傳致病因素的認(rèn)識。針對多種疾病進(jìn)行的外顯子測序（Exome sequencing）和全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide association study， GWAS）提示很多新