岳珊珊，夏來(lái)新

1. 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 230601；

2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

酵母雙雜交篩選與果蠅C（2）M相互作用的蛋白

岳珊珊1，2，夏來(lái)新1

1. 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 230601；

2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

同源染色體聯(lián)會(huì)時(shí)形成的聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex， SC）是由減數(shù)分裂前期Ⅰ多種蛋白質(zhì)聚集而成的超級(jí)復(fù)合結(jié)構(gòu)。生殖細(xì)胞特異性的核蛋白C（2）M（Crossover suppressor on 2 of Manheim）在染色體上高度聚集可以誘導(dǎo)SC的形成。本文采用酵母雙雜交方法，利用C（2）M的誘餌表達(dá)載體篩選果蠅cDNA文庫(kù)，共發(fā)現(xiàn)40個(gè)可能與C（2）M相互作用的蛋白，包括多種DNA及組蛋白結(jié)合蛋白、ATPase、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。從篩選的結(jié)果中，選取wech和Psf1基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因果蠅，并在生殖細(xì)胞中進(jìn)行了基因沉默，結(jié)果顯示聯(lián)會(huì)復(fù)合體的消失受到延遲。上述結(jié)果表明Wech和Psf1蛋白可能與C（2）M形成復(fù)合物，共同參與聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成或其穩(wěn)定性的維持。

減數(shù)分裂；SC；C（2）M；酵母雙雜交；蛋白相互作用

減數(shù)分裂是指染色體復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，染色體數(shù)目減半的一種特殊分裂方式。它是保證物種染色體數(shù)目穩(wěn)定的機(jī)制，也促進(jìn)著物種不斷進(jìn)化。減數(shù)分裂是由減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ兩個(gè)時(shí)期組成，其中減數(shù)分裂Ⅰ又可細(xì)分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期5個(gè)時(shí)期。從偶線期起，同源染色體緊密相貼進(jìn)行配對(duì)，稱為聯(lián)會(huì)，在同源染色體間形成了聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex， SC）。目前，對(duì)于SC的研究?jī)H限于其本身組分相關(guān)的蛋白，而對(duì)于SC的起始、裝配以及其時(shí)空性的研究還不夠深入。據(jù)報(bào)道，SC的形成可分為3個(gè)時(shí)期［1］：偶線期早期，只能在著絲粒上觀察到聯(lián)會(huì)復(fù)合體；偶線期中期，聯(lián)會(huì)復(fù)合體開始出現(xiàn)在常染色體的某些位點(diǎn)上；偶線期晚期，聯(lián)會(huì)發(fā)生在染色體上的更多位點(diǎn)上。由此可見，SC的形成有著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋C(jī)制。已有的研究證實(shí)，偶線期早、中期SC的形成依賴于凝集蛋白ORD（Orientation disruptor）［2］，晚期SC的形成則依賴C（2）M［3］。C（2）M是SC中的縱向元件（Later elements， LEs）的組成成分［4］，在減數(shù)分裂S期開始累積，在減數(shù)分裂中期Ⅰ消失，說(shuō)明C（2）M在聯(lián)會(huì)復(fù)合體中發(fā)揮作用，而并不參與染色體的分離［5，6］。目前，對(duì)于C（2）M在聯(lián)會(huì)這一事件中發(fā)揮怎樣的功能仍知之甚少，特別是關(guān)于C（2）M如何參與SC的形成、如何引導(dǎo)SC的組裝。

酵母雙雜交系統(tǒng)是1989年由Fields等［7］提出并初步建立的，至今為止一直是研究蛋白間相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。本研究利用酵母雙雜技術(shù)，以C（2）M為誘餌蛋白，篩選果蠅文庫(kù)中與之相互作用的蛋白，旨在研究C（2）M調(diào)控SC組裝的分子機(jī)制，相關(guān)結(jié)果將有助于提高人們對(duì)同源配對(duì)分子基礎(chǔ)及減數(shù)分裂啟動(dòng)的了解。

1　材料和方法

1.1材料

酵母菌株AH109，質(zhì)粒pGBKT7和pACT2，宿主菌E. coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室提供；cDNA文庫(kù)由上海?？粕锛夹g(shù)有限公司構(gòu)建；酵母質(zhì)粒小提試劑盒和鼠、兔免疫熒光二抗購(gòu)自天根生物公司；C（3）G抗體由本實(shí)驗(yàn)室自制，Orb抗體購(gòu)自Developmental Studies Hybridoma Bank（美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

以果蠅cDNA為模板，設(shè)計(jì)有含NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)的引物c(2)M-NcoⅠ-s和c(2)M-XhoⅠ-as（表1），PCR擴(kuò)增C（2）M的CDS（Coding sequence）序列（Gene ID：34964），將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pGBKT7載體。

1.2.2誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母AH109及文庫(kù)篩選

醋酸鋰法制備AH109感受態(tài)，轉(zhuǎn)入誘餌質(zhì)粒，鋪于SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4～6 d；取部分菌體用于檢測(cè)蛋白表達(dá)；制備含誘餌質(zhì)粒的AH109感受態(tài)，轉(zhuǎn)入文庫(kù)質(zhì)粒，鋪于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d；挑取直徑＞2 mm的陽(yáng)性克隆，接于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培養(yǎng)基上保種。

1.2.3酵母陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提取及質(zhì)粒的回復(fù)和自激活驗(yàn)證

因酵母具有質(zhì)粒相容性，可包含多種質(zhì)粒，所以提出酵母質(zhì)粒后，需轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，從中提取質(zhì)粒；將提出的質(zhì)粒同pGBKT7-c（2）M回轉(zhuǎn)AH109，驗(yàn)證陽(yáng)性相互作用；將質(zhì)粒同pGBKT7回轉(zhuǎn)AH109，驗(yàn)證陽(yáng)性質(zhì)粒能否自激活His和LacZ基因。

1.2.4陽(yáng)性克隆的測(cè)序與分析

將重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性而自激活驗(yàn)證為陰性的組別由北京擎科生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI和Flybase網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，利用生物信息學(xué)方法研究篩選結(jié)果。

1.2.5S2（Schneider 2）細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證C（2）M和Wech/Psf1的相互作用

結(jié)合文獻(xiàn)以及基因本身的表達(dá)特點(diǎn)，從篩選結(jié)果中挑選wech和Psf1 2個(gè)目標(biāo)基因，在S2細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證其與C（2）M的相互作用；將這兩個(gè)基因沉默后，免疫熒光觀察減數(shù)分裂進(jìn)程是否受到影響。以果蠅cDNA為模板，設(shè)計(jì)含有NotⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)的引物c(2)M-NotⅠ-s、c(2)M-XbaⅠ-as、wech-NotⅠ-s、wech-XbaⅠ-as、Psf1-NotⅠ-s和Psf1-XbaⅠ-as（引物信息見表1），PCR擴(kuò)增c(2)M、wech（Gene ID：44653）和Psf1（Gene ID：38136）的CDS序列，構(gòu)建載體pAC5.1-Flag-c（2）M和pAC5.1-Myc- wech/Psf1。將其分別共轉(zhuǎn)S2細(xì)胞，29℃培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞，用PBS洗滌3遍，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清；將上清與Flag beads 4℃孵育2 h，PBST洗3次，用1×SDS loading buffer重懸，95℃煮樣10 min，丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，以c-Myc抗體為一抗，室溫孵育2 h，以鼠抗為二抗，室溫孵育30 min，顯影。

表1　本研究所用的引物信息

1.2.6候選基因的基因沉默型果蠅卵巢熒光觀察

本研究采用GAL4/UAS系統(tǒng)快速獲得可調(diào)控的RNA干擾果蠅。在Gene Link網(wǎng)站上設(shè)計(jì)wech和Psf1 mRNA干擾序列；引物稀釋為100 μmol/L，各取1 μL，Taq buffer 1 μL，水7 μL，95℃變性5 min，室溫復(fù)性1 h；將產(chǎn)物連入已有的表達(dá)載體UASP-attB中；經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，通過(guò)顯微注射的方法將載體注入果蠅的卵巢，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至其發(fā)育為成蟲；選擇有干擾序列插入的果蠅，與表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活蛋白GAL4的果蠅品系雜交，收集同時(shí)含有GAL4基因和UAS序列的F1代雌蠅，顯微鏡下剝離卵巢，甲醛固定30 min，PBST打孔30 min，PBTA封閉1 h，C（3）G和Orb一抗4℃孵育過(guò)夜，熒光二抗孵育3 h，制片觀察。

2　結(jié)果與分析

2.1誘餌蛋白表達(dá)載體pGBKT7-c（2）M的構(gòu)建

以成體果蠅的cDNA為模板擴(kuò)增基因c(2)M的 CDS區(qū)，片段長(zhǎng)度為1731 bp，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ酶切后插入pGBKT7中，以T7和下游引物作為鑒定引物，陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序證實(shí)無(wú)移碼突變。

2.2陽(yáng)性克隆的篩選、自激活及回復(fù)驗(yàn)證

取50 μg cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入含目的基因c(2)M的AH109中，采用SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培養(yǎng)基高壓篩選，經(jīng)過(guò)1周左右的時(shí)間，在SD/-Trp/-Leu/-His/ -Ade缺陷培養(yǎng)基上共長(zhǎng)出直徑＞2 mm的克隆200個(gè)，PCR篩選陽(yáng)性克隆，文庫(kù)基因大小在500～3000 bp之間（圖1A）。對(duì)這200個(gè)克隆分別進(jìn)行自激活和回復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（圖1B），其中自激活的組別占總組別的35%。除去自激活現(xiàn)象（70個(gè)）和回復(fù)驗(yàn)證失?。?9個(gè)）的組別，本研究最后獲得91個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

2.3陽(yáng)性克隆的測(cè)序及生物信息學(xué)分析

由于酵母質(zhì)粒濃度較低，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)后重新提取質(zhì)粒，以T7為引物進(jìn)行測(cè)序，最后將這91個(gè)測(cè)序結(jié)果在Flybase上進(jìn)行比對(duì)，得到40個(gè)不同的基因（表2），編碼眾多結(jié)合蛋白、熱休克蛋白、ATP酶、具有解旋酶活性的Psf1、整合蛋白Wech以及染色體凝集蛋白Cap-G。

2.4S 2細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證C（2）M和Wech/Psf1的相互作用

pAC5.1-Flag-c（2）M和pAC5.1-Myc-wech/Psf1共轉(zhuǎn)S2細(xì)胞48 h后，提取蛋白，沉淀C（2）M及與其相互作用的蛋白，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在單獨(dú)轉(zhuǎn)染pAC5.1-Myc-wech或pAC5.1-Myc-Psf1時(shí)，利用Flag beads免疫沉淀后，沒有檢測(cè)到Wech或Psf1的表達(dá)；而共轉(zhuǎn)pAC5.1-Flag-c（2）M和pAC5.1-Myc-wech/Psf1后，在經(jīng)Flag beads沉淀后的C（2）M相互作用的蛋白中，分別檢測(cè)到Wech和Psf1的表達(dá)，說(shuō)明C（2）M和Wech/Psf1均存在相互作用。

圖1　酵母質(zhì)粒PCR檢測(cè)結(jié)果（A）及陽(yáng)性克隆的回復(fù)驗(yàn)證（B）

2.5wech和Psf1基因沉默型果蠅卵巢的免疫熒光觀察

本文成功制備了含有wech和Psf1 mRNA干擾序列的轉(zhuǎn)基因果蠅，用能夠標(biāo)記聯(lián)會(huì)復(fù)合體的C（3）G抗體，染色wech和Psf1基因沉默后的卵巢，發(fā)現(xiàn)與野生型果蠅不同的是，在wech和Psf1基因沉默型果蠅的卵巢中，其染色體聯(lián)會(huì)受到了干擾，即在卵母細(xì)胞形成的最后階段，會(huì)有兩個(gè)細(xì)胞發(fā)育成為卵母細(xì)胞，而在野生型果蠅中，最終只形成一個(gè)卵母細(xì)胞（圖3）。

3　討　論

表2　酵母篩選陽(yáng)性克隆比對(duì)結(jié)果

酵母雙雜交技術(shù)自建立起一直是研究和鑒定兩個(gè)蛋白相互作用的有效方法。其原理是依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在空間上充分靠近，從而激活下游基因表達(dá)［8，9］。C（2）M是細(xì)胞核內(nèi)減數(shù)分裂相關(guān)蛋白，為了進(jìn)一步分析其功能和作用機(jī)制，本文采用了酵母雙雜交的方法篩選與其相互作用的蛋白。

續(xù)表2

圖2　免疫共沉淀驗(yàn)證C（2）M和Wech/Psf1蛋白之間具有相互作用

圖3　wech和Psf1基因沉默型果蠅原卵區(qū)的熒光染色結(jié)果

果蠅卵細(xì)胞始于卵巢頂部的2～3個(gè)原始生殖細(xì)胞，原始生殖細(xì)胞不對(duì)稱分裂，一個(gè)繼續(xù)位于卵巢頂部，維持干性。另一個(gè)則離開頂部開始分化形成囊胚細(xì)胞，經(jīng)過(guò)4次有絲分裂形成一個(gè)由16個(gè)細(xì)胞組成的包囊。16個(gè)細(xì)胞里只有1個(gè)細(xì)胞形成卵母細(xì)胞，并進(jìn)行減數(shù)分裂，其余細(xì)胞則為滋養(yǎng)細(xì)胞。C（2）M是SC形成的必要因子，在本研究結(jié)果中可以看出，wech和Psf1 基因沉默后，SC的消失發(fā)生了延遲，說(shuō)明wech和Psf1可能參與SC解體的過(guò)程。

Cap-G屬于condensin蛋白家族中非染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白［10，11］。據(jù)報(bào)道在缺乏Cap-G的突變體中，染色體的凝集和壓縮受到阻礙，從而導(dǎo)致姊妹染色單體不能正常分離，并且會(huì)引起著絲粒粘附力的減弱［12，13］。說(shuō)明Cap-G在染色體軸形成過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。本課題組通過(guò)酵母雙雜交篩選出染色體凝集相關(guān)蛋白Cap-G，說(shuō)明Cap-G有可能也參與減數(shù)分裂染色體軸的形成。然而就其如何與C（2）M共同發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步研究。

Wech屬于RBCC/TRIM超家族［14］，該蛋白家族含有一個(gè)鋅指元件、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和5～6個(gè)NHL（NCL-1，HT2A，LIN-41）重復(fù)結(jié)構(gòu)，在果蠅中，只有4個(gè)蛋白屬于該家族，分別是Wech［15，16］、減數(shù)分裂相關(guān)蛋白Mei-P26［17］、腫瘤抑制蛋白Brat［18］和鋅指串聯(lián)蛋白ABBA。缺少Brat會(huì)引起腦瘤，缺少M(fèi)ei-P26會(huì)導(dǎo)致卵巢腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)Brat的腫瘤抑制功能域是NHL結(jié)構(gòu)域［19］。而本研究測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)與C（2）M相互作用的區(qū)域正好是Wech的C端NHL結(jié)構(gòu)，猜測(cè)其與C（2）M的相互作用正是它們共同行使減數(shù)分裂相關(guān)功能的基礎(chǔ)。Psf1作為GINS復(fù)合體中的一員［20］，參與DNA復(fù)制的起始和延伸，而其在果蠅卵子發(fā)生過(guò)程中，是否通過(guò)調(diào)控DNA的復(fù)制來(lái)起始有絲分裂向減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)換，還需要深入研究。由于基因沉默受多方面因素影響，所以本文的表型并不是很強(qiáng)，對(duì)于Wech及Psf1是否同C（2）M共同參與減數(shù)分裂相關(guān)過(guò)程以及其具體的分子機(jī)制，還需要后期通過(guò)制備抗體和突變體等大量實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。C（2）M作為減數(shù)分裂的上游因子，研究與其相互作用的蛋白有助于人們了解C（2）M調(diào)控減數(shù)分裂的具體機(jī)制以及加深對(duì)減數(shù)分裂的認(rèn)識(shí)。同時(shí)還可能為相關(guān)的卵巢性生殖疾病的預(yù)防和治療，提供新的線索。

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（責(zé)任編委： 史慶華）

Identification of C（2）M interacting proteins by yeast two-hybrid screening

Shanshan Yue1，2， Laixin Xia1

1. School of Life Sciences， Anhui University， Anhui 230601， China;
2. State Key Laboratory of Reproductive Biology， Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China

The synaptonemal complex （SC） is a huge structure which assembles between the homologous chromosomes during meiotic prophase I. Drosophila germ cell-specific nucleoprotein C（2）M clustering at chromosomes can induce SC formation. To further study the molecular function and mechanism of C（2）M in meiosis，we constructed a bait vector for C（2）M and used the yeast two-hybrid system to identify C（2）M interacting proteins. Forty interacting proteins were obtained， including many DNA and histone binding proteins， ATP synthases and transcription factors. Gene silencing assays in Drosophila showed that two genes， wech and Psf1， may delay the disappearance of SC. These results indicate that Wech and Psf1 may form a complex with C（2）M to participate in the formation or stabilization of the SC complex.

meiosis； SC； C（2）M； yeast two-hybrid system； protein interaction

2015-03-22；

2015-08-25

SKLRB青年杰俊科研創(chuàng)新主任基金項(xiàng)目資助

岳珊珊，碩士研究生，專業(yè)方向：RNA代謝和干細(xì)胞。E-mail： yueshanshanyss@163.com

夏來(lái)新，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：RNA代謝和干細(xì)胞。E-mail： xialx@ioz.ac.cn

10.16288/j.yczz.15-118

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間： 2015-9-119：54：25

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150911.0954.002.html