劉欣，宋雪螢，張曉萍，韓英倫，朱婷，肖蓉，李慶偉

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；

2. 遼寧師范大學(xué)七鰓鰻研究中心，大連 116081

七鰓鰻鰓黏膜免疫系統(tǒng)類淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答遺傳基礎(chǔ)

劉欣1，2，宋雪螢1，2，張曉萍1，2，韓英倫1，2，朱婷1，2，肖蓉1，2，李慶偉1，2

1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；

2. 遼寧師范大學(xué)七鰓鰻研究中心，大連 116081

近年來，在無頜類脊椎動(dòng)物七鰓鰻體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了以可變淋巴細(xì)胞受體（Variable lymphocyte receptors， VLR）為基礎(chǔ)的抗原識(shí)別機(jī)制。為揭示七鰓鰻鰓黏膜免疫系統(tǒng)中類淋巴細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答的遺傳基礎(chǔ)，探索無頜類與有頜類脊椎動(dòng)物在適應(yīng)性免疫應(yīng)答機(jī)制上的進(jìn)化關(guān)系，本文構(gòu)建了日本七鰓鰻（Lampetra japonica）鰓囊組織免疫前后cDNA文庫(kù)并進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析。通過對(duì)組裝得到的88 525個(gè)獨(dú)立基因（Unigene）進(jìn)行功能注釋，分別有21 704和9769個(gè)unigene在GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋。999個(gè)unigene參與免疫系統(tǒng)的多個(gè)通路，其中184個(gè)與高等脊椎動(dòng)物TCR（T cell receptor）和BCR（B cell receptor）信號(hào)通路的51個(gè)分子具有較高的同源關(guān)系，說明七鰓鰻體內(nèi)存在高等脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫應(yīng)答信號(hào)通路的相關(guān)分子。本文還發(fā)現(xiàn)5個(gè)VLRA、7個(gè)VLRB和4個(gè)VLRC分子，說明七鰓鰻鰓黏膜免疫組織內(nèi)至少分布3種類淋巴細(xì)胞亞群。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Lck、Fyn和Zap70基因在免疫激發(fā)后表達(dá)量顯著上調(diào)，而Syk、Btk和Blnk基因表達(dá)沒有顯著變化，說明七鰓鰻鰓組織受到抗原刺激后，類似T淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活。本研究初步證明，盡管無頜類和有頜類脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在抗原識(shí)別機(jī)制上存在不同，但具有共同的遺傳基礎(chǔ)。研究結(jié)果為探討七鰓鰻VLRA+、VLRB+和VLRC+淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)過程提供了有價(jià)值的線索。

日本七鰓鰻；鰓黏膜免疫組織；轉(zhuǎn)錄組；免疫應(yīng)答

黏膜免疫是免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，為生物體的各種黏膜提供保護(hù)，使其免受潛在病原微生物的入侵并調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)［1］。魚類生活在水環(huán)境中，其皮膚、鰓和腸道與水體直接接觸，是病原侵入魚體的門戶。為免受病害侵襲，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，這些組織和器官形成了黏膜相關(guān)淋巴組織（Mucosal associated lymph tissue， MALT）。盡管負(fù)責(zé)氣體交換的魚鰓由幾對(duì)鰓片組成，但鰓片上排列的梳齒狀鰓絲具有巨大的表面積，使其成為魚類重要的黏膜免疫組織。Lin等［2］在大西洋鮭（Salmo salar）和黃蓋鰈（Limanda limanda）鰓組織中發(fā)現(xiàn)大、小淋巴細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的存在。當(dāng)魚體受抗原刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞可以對(duì)抗原進(jìn)行處理和呈遞，抗體分泌細(xì)胞會(huì)分泌特異性抗體，構(gòu)成了機(jī)體與外界相接觸的第一道免疫防護(hù)體系［3］。從鰓淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原脂多糖（Lipopolysaccharides， LPS）和植物血凝素（Phytohaemagglutinin， PHA）的反應(yīng)來看，PHA比LPS對(duì)鰓淋巴細(xì)胞的激活作用更加顯著，說明分布在魚類鰓中的淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞為主［4］。

七鰓鰻屬于脊椎動(dòng)物門、圓口綱（Cyclostomata）、七鰓鰻目（Petromyzontiformes）。長(zhǎng)久以來，七鰓鰻作為脊椎動(dòng)物中最低等的魚形動(dòng)物，因其在進(jìn)化上的特殊地位在比較解剖學(xué)［5］、發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)［6］、生理學(xué)［7］和免疫學(xué)［8］等研究領(lǐng)域備受關(guān)注。近年來，Pancer等［9，10］發(fā)現(xiàn)海七鰓鰻（Petromyzon marinus）和太平洋粘盲鰻（Eptatretus stoutii）存在以可變淋巴細(xì)胞受體（Variable lymphocyte receptors， VLR）為基礎(chǔ)的抗原識(shí)別機(jī)制，提出無頜類存在一種平行于有頜脊椎動(dòng)物以T細(xì)胞受體（T cell receptor， TCR）、B細(xì)胞受體（B cell receptor， BCR）識(shí)別抗原的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。之后，共有3種VLR（VLRA、VLRB和VLRC）被發(fā)現(xiàn)，且分別存在于不同的淋巴細(xì)胞亞群上（VLRA+、VLRB+和VLRC+淋巴細(xì)胞）［11］。Guo等［12］發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻的鰓囊中存在小淋巴細(xì)胞，并且VLRA+和VLRB+淋巴細(xì)胞的數(shù)量比值在鰓囊中接近1，遠(yuǎn)高于其他組織，說明VLRA+淋巴細(xì)胞主要分布在鰓囊中。VLRA+淋巴細(xì)胞在PHA刺激后的反應(yīng)方式與高等脊椎動(dòng)物的T細(xì)胞相似。刺激后的VLRA+淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)分子包括轉(zhuǎn)錄因子GATA2/3（GATA binding protein 2/3）、原癌基因c-Rel（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog）、芳香烴受體Ahr（Aryl hydrocarbon receptor）、B-細(xì)胞淋巴瘤因子Bcl11B（B-cell CLL/lymphoma 11B）；趨化因子受體CCR9 （Chemokine （C-C motif） receptor 9）；T細(xì)胞命運(yùn)決定分子Notch1（Neurogenic locus Notch homolog protein 1）；酪氨酸磷酸酶CD45；白細(xì)胞介素IL-8（Interleukin 8）受體和趨化因子受體CXCR2（Chemokine （C-X-C motif） receptor 2）；促炎細(xì)胞因子IL-17和巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF（Macrophage migration inhibitory factor）。但是，由于七鰓鰻體內(nèi)不存在以組織相容性復(fù)合體 （Major histocompatibility complex， MHC）、TCR、BCR和免疫球蛋白（Immunoglobulin， Ig）等分子為主導(dǎo)的適應(yīng)性免疫機(jī)制，其黏膜免疫系統(tǒng)中類淋巴細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答的遺傳基礎(chǔ)及其與高等脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫應(yīng)答的異同目前尚未見報(bào)道。

本研究以日本七鰓鰻（Lampetra japonica）這一東亞孑遺活化石為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其免疫前后的鰓囊組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。通過對(duì)序列進(jìn)行比較分析，搜索和識(shí)別無頜類脊椎動(dòng)物參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的相關(guān)分子，揭示無頜類黏膜免疫系統(tǒng)類淋巴細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答的遺傳基礎(chǔ)，探究與高等脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間在進(jìn)化上的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料

日本七鰓鰻捕自黑龍江省松花江流域同江地區(qū)，活體置于實(shí)驗(yàn)室水族箱馴養(yǎng)（2～5℃）。1周后選取24條健康的個(gè)體（體長(zhǎng)35～55 cm），分為兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組以復(fù)合抗原浸泡免疫1 h方式進(jìn)行免疫刺激［13］。復(fù)合抗原用市售生理鹽水配制，含滅活的大腸桿菌（Escherichia coli DH5α） （TaKaRa，Dalian）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus）（寶生物工程（大連）有限公司）和啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）（市售）各1×109個(gè)/mL，免疫時(shí)用水族箱養(yǎng)殖水稀釋3 000倍后使用。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過2次加強(qiáng)免疫（每2周1次），末次免疫后3 d取其新鮮的鰓組織。對(duì)照組不用復(fù)合抗原，其余的處理方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.2方法

1.2.1RNA樣品提取及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

使用RNAiso Reagent（TaKaRa， Dalian）提取日本七鰓鰻復(fù)合免疫實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組鰓囊總RNA。獲得符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的總RNA 樣本后，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行等量混合后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)并用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行雙向測(cè)序（Paired-end sequencing）及分析。

1.2.2轉(zhuǎn)錄本的拼接

測(cè)序得到的原始序列需去除含N（N表示無法確定堿基信息）的比例大于10%的讀數(shù)（Reads）、帶接頭的讀數(shù)及低質(zhì)量的讀數(shù)（質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)讀數(shù)長(zhǎng)度50%以上的讀數(shù)），從而得到純凈讀數(shù)（Clean reads）。采用針對(duì)短序列拼接的Trinity軟件進(jìn)行拼接（版本：v2012-10-05），min_kmer_cov參數(shù)設(shè)置為2，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)［14］。最后，將拼接至兩端不能再延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為獨(dú)立基因（Unigene）。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與注釋分析

利用Blast軟件（NCBI blast 2.2.28+），將Unigene在Nr蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)。未注釋的Unigene在Nt核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源序列。為減少錯(cuò)配比例，將e值（e-value）的閾值設(shè)為小于1E-10。

運(yùn)用HMMER3程序（http：//pfam.sanger.ac.uk/），根據(jù)Pfam（Protein family）數(shù)據(jù)庫(kù)［15］中已構(gòu)建好的蛋白結(jié)構(gòu)域HMM（Hidden Markov Models）統(tǒng)計(jì)模型，對(duì)Unigene進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的注釋。

利用Blast2GO［16］和KAAS［17］（http：//www. genome.jp /tools/kaas/）軟件，基于Nr和Pfam兩部分的蛋白注釋結(jié)果對(duì)Unigene分別進(jìn)行Gene Ontology（GO）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）通路功能注釋及分類統(tǒng)計(jì)。

1.2.4基因差異表達(dá)分析

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

選取與TCR、BCR相鄰的7個(gè)重要的信號(hào)分子（酪氨酸蛋白激酶Lck、Fyn、Tec、ZAP-70，脾酪氨酸激酶Syk，B細(xì)胞連接蛋白Blnk和布魯頓酪氨酸激酶Btk）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析驗(yàn)證。鰓組織總RNA樣品的提取按方法1.2.1進(jìn)行。采用Primescript?RT試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用TaKaRa SYBR?primescript?RT-PCR（寶生物工程（大連）有限公司）試劑盒，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。以七鰓鰻GAPDH的表達(dá)水平作為內(nèi)參，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果用對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行歸一化計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 s；95℃ 5 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；最后再65℃延伸15 s。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包的t檢驗(yàn)?zāi)K對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所驗(yàn)證的7個(gè)蛋白激酶的PCR引物序列見表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

2　結(jié)果與分析

2.1七鰓鰻鰓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列的轉(zhuǎn)錄本拼接及注釋

對(duì)所構(gòu)建的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行雙向測(cè)序分別得到的原始數(shù)據(jù)為25 947 041和28 841 887 對(duì)原始讀數(shù)（Raw reads）。通過對(duì)原始讀數(shù)過濾，分別得到24 382 693和27 004 299 對(duì)純凈讀數(shù)（序列總堿基數(shù)分別為4.88 G和5.4 G個(gè)堿基），Q20和Q30（Phred 數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比）指標(biāo)分別高于96%和90%，說明測(cè)序結(jié)果良好。利用Trinity軟件對(duì)2個(gè)轉(zhuǎn)錄組雙向4組純凈讀數(shù)集合進(jìn)行混合拼接，最終在所組裝的119 004個(gè)序列重疊群（Contig）中篩選出88 525個(gè)Unigene，總長(zhǎng)度69 291 924 bp，平均長(zhǎng)度671 bp，N50值為1 092 bp。在這些Unigene中，序列長(zhǎng)度在300 bp以下的有28 283個(gè)，占31.95%；300 ～ 499 bp的有25 072個(gè)，占28.32%；500 ～ 999 bp的有17 952個(gè)，占20.28%；1000～1 999 bp的有9728個(gè)，占10.99%；

長(zhǎng)度在2 000 bp以上的有7 490個(gè)，占8.46%。按照轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與注釋分析方法對(duì)88 525個(gè)Unigene進(jìn)行了功能注釋，占總數(shù)29.43%的26 049個(gè)Unigene至少在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋。在PFAM和GO數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋的比例較高，分別有20 834個(gè)（24.52%）和21 704個(gè)（23.53%）Unigene；在Nr、KEGG和Nt數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋的相對(duì)較少，分別有16 879（19.07%）、9 769（11.04%）和8 084個(gè)（9.13%）。

2.2Unigene的GO分類

對(duì)21 704個(gè)獲得GO注釋的Unigene按照生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能進(jìn)行了分類，結(jié)果見圖1。在生物學(xué)過程23個(gè)小類中，歸入U(xiǎn)nigene數(shù)量較多的是細(xì)胞過程（13 197個(gè)，9.46%）、代謝過程（10 410個(gè)，7.46%）和單有機(jī)體過程（8 329個(gè)，5.97%）。分別有3 051個(gè)（2.19%）、338個(gè)（0.24%）和44個(gè)（0.03%）Unigene歸入信號(hào)傳遞、免疫系統(tǒng)過程和細(xì)胞的殺傷等與免疫相關(guān)的類別。在細(xì)胞成分的18個(gè)注釋小類中，細(xì)胞（8 394個(gè)，6.02%）和細(xì)胞組件（8 344個(gè)，5.98%）歸入的Unigene較多；突觸（96個(gè)，0.07%）、突觸組件（85個(gè)，0.06%）和細(xì)胞核（6個(gè)，0.00%）歸入的Unigene較少。細(xì)胞成分注釋只反映被注釋分子在細(xì)胞中的位置，因此不能直觀反映該分子是否參與免疫過程。在分子功能注釋中，結(jié)合（12 050個(gè)，8.64%）歸入的Unigene最多，其次為催化活性（7 646個(gè)，5.48%）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（1 650個(gè)，1.18%），而較少的類別有抗氧化活性（35個(gè)，0.03%）、受體調(diào)節(jié)活性（34個(gè)，0.02%）和金屬伴侶活性（8個(gè)，0.01%）。GO分類結(jié)果在一定程度上反映出七鰓鰻鰓組織中所表達(dá)的基因的位置分布、所參與的生物學(xué)過程及可能行使的功能屬性，為后續(xù)進(jìn)行免疫相關(guān)基因的篩選和功能富集分析奠定了基礎(chǔ)。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增所用引物

2.3Uni gene的KEGG通路注釋

對(duì)Unigene進(jìn)行KO注釋后，根據(jù)它們參與的KEGG通路進(jìn)行分類，結(jié)果見表2。9769個(gè)被注釋的Unigene分別屬于細(xì)胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、代謝和有機(jī)體系統(tǒng)這5個(gè)一級(jí)分類群下的260個(gè)標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)通路（表2）。在二級(jí)分類群中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的Unigene最多，共有2 914個(gè)；其他較多的有內(nèi)分泌系統(tǒng)（1 506個(gè)）、神經(jīng)系統(tǒng)（1324個(gè)）、免疫系統(tǒng)（999個(gè)）、細(xì)胞通訊（775個(gè)）、運(yùn)輸和催化（642個(gè)）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和相互作用（576個(gè)）。

參與免疫系統(tǒng)各通路的999個(gè)Unigene中，146個(gè)參與細(xì)胞因子信號(hào)通路（Chemokine signaling pathway，ID：ko04062）；128個(gè)參與白細(xì)胞跨血管壁遷移（Leukocyte transendothelial migration， ID： ko04670）；124個(gè)參與Fc γR介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬作用（Fc gamma R-mediated phagocytosis，ID：ko04666）；104個(gè)參與TCR信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway， ID：ko04660）；84個(gè)參與抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Natural killer cell mediated cytotoxicity， ID： ko04650）；80個(gè)參與BCR信號(hào)通路（B cell receptor signaling pathway，ID：ko04662）；70個(gè)unigene參與Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway，ko04620）；52個(gè)unigene參與FcεRI信號(hào)通路（Fc epsilon RI signaling pathway，ID：ko04664）。還有少量unigene參與天然免疫的分子通路，如：補(bǔ)體凝集反應(yīng)（Complement and coagulation cascades，ID：ko04610）、RIG-I 樣受體信號(hào)通路（RIG-I-like receptor signalingpathway，ID：ko04622）和NOD 樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway，ID：ko04621）。以上結(jié)果顯示，七鰓鰻也存在高等脊椎動(dòng)物天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答信號(hào)通路的相關(guān)分子，說明在一定程度上這兩種平行的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)具有共同的遺傳基礎(chǔ)。

圖1　Unigene的GO分類圖

2.4七鰓鰻鰓黏膜適應(yīng)性免疫應(yīng)答分子的甄別

對(duì)注釋為參與TCR和BCR信號(hào)通路的184個(gè)Unigene進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們與51個(gè)高等脊椎動(dòng)物參與TCR和BCR信號(hào)通路的分子有較高的同源關(guān)系。對(duì)這184個(gè)Unigene進(jìn)行歸類比較，其中有51個(gè)Unigene序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)、同源匹配e值較高（表3）。其中，編號(hào)1～23號(hào)分子在TCR和BCR信號(hào)通路中都行使功能，24～43號(hào)分子屬于TCR信號(hào)通路，而剩下的8個(gè)分子屬于BCR信號(hào)通路。并且，有14個(gè)Unigene在復(fù)合抗原刺激后在轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯上調(diào)。另外，本文也從注釋的Unigene中甄選到5個(gè)VLRA、7個(gè)VLRB和4個(gè)VLRC分子（表4）；還有100多個(gè)Unigene在Nt數(shù)據(jù)庫(kù)被注釋為VLR分子，但由于序列較短不能被準(zhǔn)確確定類別，所以本文未給出結(jié)果。3種VLR分子的發(fā)現(xiàn)，說明七鰓鰻鰓黏膜免疫組織內(nèi)分布著所有的類淋巴細(xì)胞亞群，而這些分子的發(fā)現(xiàn)為將來探討VLRA+、VLRB+和VLRC+淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)過程提供了有價(jià)值的線索。

2.5T、B細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白激酶的驗(yàn)證

在篩選的參與TCR和BCR信號(hào)通路的7個(gè)蛋白激酶中，酪氨酸蛋白激酶Lck、Fyn、Tec和ZAP-70

參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而B細(xì)胞連接蛋白（Blnk）、布魯頓酪氨酸激酶Btk和脾酪氨酸激酶Syk參與B細(xì)胞信號(hào)通路。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這些蛋白激酶的mRNA在免疫前后的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Lck、Fyn和Zap70在免疫后表達(dá)量顯著上調(diào)，而Syk、Btk和Blnk沒有顯著變化（圖2）。結(jié)果說明，七鰓鰻鰓組織在受到抗原刺激后，類似T淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活。

表2　KEGG通路注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

表3　與T、B細(xì)胞受體信號(hào)通路相關(guān)分子同源的信號(hào)分子

續(xù)表3

表4　鰓中表達(dá)的可變淋巴細(xì)胞受體（VLR）的類型

圖2　7種蛋白激酶mRNA表達(dá)情況的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

3　討　論

長(zhǎng)期以來，人們普遍認(rèn)為高等脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是由無脊椎動(dòng)物的先天性免疫系統(tǒng)直接進(jìn)化而來［24］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)以七鰓鰻和盲鰻為代表的古老的無頜類脊椎動(dòng)物存在類似脊椎動(dòng)物所具有的適應(yīng)性免疫現(xiàn)象，同時(shí)還存在許多與脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫分子同源的分子［25］。而VLR及其重組機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，挑戰(zhàn)了先天性免疫進(jìn)化學(xué)說；這種在無頜類脊椎動(dòng)物中富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat）插入的重組機(jī)制，極有可能是現(xiàn)代適應(yīng)性免疫的起源。因此，作為研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的模式動(dòng)物，七鰓鰻也逐漸成為探討適應(yīng)性免疫起源與進(jìn)化的關(guān)鍵物種。本研究成功構(gòu)建了日本七鰓鰻黏膜免疫重要組織鰓的cDNA文庫(kù)，通過轉(zhuǎn)錄本的注釋，探索和發(fā)現(xiàn)日本七鰓鰻鰓組織適應(yīng)性免疫相關(guān)分子的組成及表達(dá)。本文為進(jìn)一步研究七鰓鰻鰓黏膜組織各淋巴細(xì)胞亞群適應(yīng)性免疫應(yīng)答的機(jī)制，以及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的起源與進(jìn)化提供了有價(jià)值的線索。

高等脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)是指抗原特異性T、B細(xì)胞受抗原刺激后，從自身活化開始到增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的全過程。參與此過程的信號(hào)通路主要有TCR和BCR信號(hào)通路。TCR是一種T細(xì)胞膜蛋白復(fù)合物，與CD3分子一起形成T細(xì)胞受體復(fù)合體來參與抗原呈遞時(shí)T細(xì)胞的激活。由于TCR具有兩種類型（TCRαβ和TCRγδ），T細(xì)胞也相應(yīng)存在兩種亞群（αβ和γδ T 細(xì)胞）［26］。與有頜類脊椎動(dòng)物相比，無頜類脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)尚沒有進(jìn)化出完善的MHC抗原呈遞機(jī)制，也沒有發(fā)現(xiàn)TCR及BCR存在。但是，Guo等［12］發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻中存在VLRA+和VLRB+兩種淋巴細(xì)胞亞群，其免疫反應(yīng)類似于T和B細(xì)胞；Hirano等［27］發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻鰓囊中除了存在少量VLRB+類淋巴細(xì)胞外，還存在VLRA+和VLRC+兩種類淋巴細(xì)胞，它們除了分別特異性表達(dá)VLRA和VLRC外，也分別表達(dá)高等脊椎動(dòng)物αβ和γδ T 細(xì)胞分化相關(guān)的一些直系同源基因。因此，該研究提出VLRA+和VLRC+兩種類淋巴細(xì)胞在起源上與αβ和γδ T 細(xì)胞有共同的祖先。本研究也發(fā)現(xiàn)在七鰓鰻的鰓囊中有VLRA、VLRB和VLRC3種受體分子的表達(dá)（表4），說明七鰓鰻鰓黏膜免疫組織內(nèi)有3種類淋巴細(xì)胞亞群分布。由于鰓囊中毛細(xì)血管豐富，本文檢測(cè)到相對(duì)較多數(shù)量的VLRB受體的原因可能是由于外周血中VLRB+類淋巴細(xì)胞比例較高所造成的。盡管此前的研究在七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)VLRA+、VLRC+及VLRB+3種類淋巴細(xì)胞在起源上類似于有頜類脊椎動(dòng)物的αβ、γδ T及B細(xì)胞，但參與這3種VLR受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子基礎(chǔ)有哪些尚未涉及。本研究發(fā)現(xiàn)七鰓鰻鰓組織存在與高等脊椎動(dòng)物T、B細(xì)胞信號(hào)通路51個(gè)信號(hào)分子同源的Unigene（表3）。其中，有23個(gè)分子為T、B信號(hào)通路所共有，另外分別有20和8個(gè)分子為T和B細(xì)胞信號(hào)通路所特有。這些結(jié)果反映出無頜類和有頜類脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫應(yīng)答盡管在機(jī)制上不同，但在一定程度上具有共同的遺傳基礎(chǔ)。

T細(xì)胞被MHC遞呈的抗原肽激活后，CD3ζ鏈的免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif， ITAM）的酪氨酸殘基被胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶Lck磷酸化，然后募集其他含有SH2（Scr homology 2）結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（Fyn和Zap-70等），并誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［26］。BCR依靠B細(xì)胞外膜的免疫球蛋白受體分子識(shí)別抗原，然后將細(xì)胞外信號(hào)通過跨膜的CD79α/CD79β異二聚體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ITAM基序傳導(dǎo)進(jìn)胞內(nèi)。后者通過募集激酶Lyn、Syk及PI3K和接頭分子GAB1和BLNK等啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程［28］。本文發(fā)現(xiàn)在28個(gè)注釋參與T和B細(xì)胞信號(hào)

通路的分子中存在與TCR（酪氨酸蛋白激酶Lck、Fyn、Zap-70和Tec）以及BCR（B細(xì)胞連接蛋白Blnk、脾酪氨酸激酶Syk和布魯頓酪氨酸激酶Btk）鄰近的上游信號(hào)分子，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證了它們?cè)谌毡酒喏w鰻鰓囊組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況（圖3）。這些上游信號(hào)分子的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證，說明七鰓鰻各淋巴細(xì)胞亞群與高等脊椎動(dòng)物相比除了跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同以外，它們胞內(nèi)部分的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制可能是保守的。另外，本文還發(fā)現(xiàn)Lck、Fyn和Zap70等幾個(gè)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵激酶同源分子在免疫激發(fā)后顯著上調(diào)，說明七鰓鰻鰓黏膜免疫系統(tǒng)在受到抗原刺激后主要啟動(dòng)的是類似T細(xì)胞的免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

VLR分子C末端具有富含脯氨酸和蘇氨酸的莖（Stalk）區(qū)和一段疏水尾（Hydrophobic tail）。VLRA 和VLRC 可以通過糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl- phosphatidyl-inositol， GPI） 修飾， 切掉疏水尾后錨定到類淋巴細(xì)胞膜表面［29］。因此，分布于類淋巴細(xì)胞外膜表面的VLR分子一定需要跨膜蛋白分子的配合才能向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。由于在無頜類脊椎動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)TCR和CD3分子構(gòu)成的T細(xì)胞受體復(fù)合體及BCR和CD79構(gòu)成的B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物，因此無頜類脊椎動(dòng)物VLR信號(hào)跨膜傳導(dǎo)的協(xié)同作用分子尚不清楚。Suzuki等［30］在盲鰻（E. burgeri）類淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了無頜類成對(duì)抗原受體樣分子—APARs（Agnathan paired receptors resembling Ag receptors）。APARs中的一種（APAR-B）胞內(nèi)區(qū)存在免疫受體酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif， ITIM）；還有一類含有ITAM基序，被命名為NICIR（novel ITAM-containing immunogloblinsuperfamily receptors）［31］。但是APARs與各種VLR分子跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的聯(lián)系目前還沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)，未來尚需要進(jìn)行更深入的研究和探索。

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（責(zé)任編委： 胡松年）

Genetic basis of immune response of lymphocyte-like cells in the mucosal immune system of Lampetra japonica

Xin Liu1，2， Xueying Song1，2， Xiaoping Zhang1，2， Yinglun Han1，2， Ting Zhu1，2， Rong Xiao1，2，Qingwei Li1，2

1. School of Life Science， Liaoning Normal University， Dalian 116081， China；
2. Lamprey Research Center， Liaoning Normal University， Dalian 116081， China

In recent years， the antigen recognition mechanism based on variable lymphocyte receptors （VLRs） was found in agnathan lamprey. To illuminate the genetic basis of immune response of lymphocyte-like cells in the mucosal immune system of lamprey and explore the evolutionary relationship of adaptive immune responses between thejawless and jawed vertebrates， we constructed cDNA libraries of lamprey （Lampetra japonica） gills before and after stimulation， and then performed high-throughput transcriptome sequencing and analysis. Through functional annotation of 88 525 assembled unigenes， 21 704 and 9769 unigenes were annotated in Gene Ontology （GO） and Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） databases， respectively. Among 999 unigenes involved in multiple pathways of immune system， 184 unigenes were highly homologous to 51 TCR （T cell receptor） and BCR （B cell receptor）signalling molecules in higher vertebrates， indicating that molecules involved in adaptive immune signalling pathways in higher vertebrates also exist in lampreys. In addition， identification of five VLRA， seven VLRB and four VLRC molecules suggest that at least three types of lymphocyte subsets are distributed in lamprey gill mucosal immune tissues. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression levels of Lck， Fyn and Zap70 were up-regulated after immune stimulation while those of Syk， Btk and Blnk were not changed significantly， indicating the activation of TCR-like signal transduction pathway after antigen stimulation in lamprey gill tissues. Our studies preliminaryly proved that two parallel adaptive immune systems in jawless and jawed vertebrates have common genetic basis， and also provided valuable clues to the exploration of signalling processes of VLRA+，VLRB+， and VLRC+lymphocyte-like cells in response to antigens.

Lampetra japonica； mucosal immune tissues； transcriptome；adaptive immune response

?到的Unigene序列作為參考序列（

equence），利用軟件Bowtie［18］將每個(gè)樣品的純凈讀數(shù)比對(duì)（Mapping）到參考序列上，運(yùn)行參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。利用RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization）軟件［19］對(duì)Bowtie的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步得到了每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)Unigene上的讀數(shù)數(shù)量（Read count），并對(duì)其進(jìn)行FPKM轉(zhuǎn)換，估算基因的表達(dá)水平［20］?；虿町惐磉_(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的讀數(shù)數(shù)量數(shù)據(jù)。采用TMM（Trimmed mean of M values）［21］對(duì)讀數(shù)數(shù)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用DEGseq［22］進(jìn)行差異分析，篩選閾值為q＜0.005且|log2（Sample1/Sample2）|＞1［23］。

2015-03-16；

2015-05-19

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）課題（編號(hào)：013CB835304）和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31271323）資助

劉欣，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail：liuxin@lnnu.edu.cn

李慶偉，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail：liqw@263.net

10.16288/j.yczz.15-108

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間： 2015-8-289：25：48

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150828.0925.002.html