陳言峰 馮偉強 張輝華 陳建酬 張綺瓊 鄒記興 付立霞

摘要 [目的] 分離并鑒定患病的高體革鯻（Scortum barco）的致病菌，并研究其藥敏特性。[方法] 從瀕死的高體革鯻體內(nèi)分離到2株致病菌（FS1491、FS1492），通過其生理生化特征與16S rDNA序列分析對其進行鑒定;通過人工感染試驗測定2株致病菌對高體革鯻的半致死劑量（LD₅₀）;最后，通過藥敏試驗確定其對抗生素的敏感性。[結果] 通過鑒定確定2株致病菌均為溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），此2株致病菌對高體革鯻的半致死劑量依次為2.1×10⁵和8.5×10⁴ cfu/g。該菌對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氟沙星等抗生素高度敏感。[結論] 該研究可為防治溫和氣單胞菌引起的高體革鯻疾病提供參考。

關鍵詞 高體革鯻;溫和氣單胞菌;鑒定;藥敏試驗

中圖分類號 S941.42 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-133-03

Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Aeromonas sobria in Cultured Scortum barco and Their Antibiotic Susceptibility Test

CHEN Yanfeng¹， FENG Weiqiang¹， ZHANG Huihua¹， FU Lixia³* et al

（1. College of Life Science， Foshan University， Foshan， Guangdong 528231; 3. College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009）

Abstract ?[Objective] Pathogenic bacteria from diseased Scortum barco were isolated and identified， and their antibiotic susceptibility was studied. [Method] Two pathogenic bacterial strains （FS1491， FS1492） were isolated from moribund Scortum barco， and they were identified through physiological and biochemical characteristics test and 16S rDNA sequence analysis. The half lethal dose （LD₅₀） values for the isolates to Scortum barco were determined by the artificial infection experiment. Besides， the antibiotic susceptibility of the isolates was studied. [Result] These two bacteria were identified to be A. sobria. The LD₅₀ values for the isolates to healthy Scortum barco were 2.1×10⁵ and 8.5×10⁴ cfu/g， respectively. The result of antibiotic susceptibility test showed the isolates were highly susceptible to cefotaxime， ciprofloxacin， norfloxacin， levofloxacin and so on. [Conclusion] This study could provide references to prevent and control the disease of Scortum barco resulted from A. sobria.

Key words ?Scortum barco; Aeromonas sobria; Identification; Antibiotic susceptibility test

基金項目 江蘇省高校自然科學研究基金（11KJB240002）;廣東省教育部產(chǎn)學研項目（2010b090400255）;廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201411847059）;廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才項目;佛山科學技術學院校級科研項目。

作者簡介 陳言峰（1981- ），男，山東濰坊人，講師，博士，從事淡水養(yǎng)殖魚類病害研究。*通訊作者，博士，從事水產(chǎn)動物抗逆性研究。

收稿日期 20141208

高體革鯻（Scortum barco），隸屬鱸形目（Percifbrmes），鯻科（Theraponidae），革鯻屬（Scortum），俗稱寶石鱸、寶石魚、翡翠魚等，是我國從澳大利亞引進的一種優(yōu)良的淡水經(jīng)濟魚類。該魚具有生長速度快、食性雜和適應性強等優(yōu)良養(yǎng)殖性狀，且肉味鮮美，骨刺少，蛋白質(zhì)含量高，具有較高的經(jīng)濟價值和廣闊的養(yǎng)殖前景^[1]。然而，隨著集約化高密度養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，高體革鯻的細菌性疾病日益嚴重，目前已有遲緩愛德華氏菌^[2]、無乳鏈球菌^[3]及海豚鏈球菌^[4]引發(fā)的高體革鯻病害的報道。筆者于2014年9月對來自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場的部分患病的高體革鯻進行了致病菌的分離鑒定、人工感染試驗、抗生素敏感性試驗，旨在為高體革鯻疾病的防控提供參考。

表2 人工感染試驗結果

菌株菌液濃度

cfu/ml試驗魚數(shù)

尾死亡數(shù)

尾死亡率

%半致死劑

量∥cfu/g

FS14911.69×10⁴102202.1×10⁵

1.69×10⁵106602.1×10⁵

1.69×10⁶107702.1×10⁵

1.69×10⁷109902.1×10⁵

1.69×10⁸10101002.1×10⁵

1.69×10⁹10101002.1×10⁵

FS14921.69×10⁴104408.5×10⁴

1.69×10⁵107708.5×10⁴

1.69×10⁶108808.5×10⁴

1.69×10⁷109908.5×10⁴

1.69×10⁸10101008.5×10⁴

1.69×10⁹10101008.5×10⁴

2.4 16S rDNA序列分析

將FS1491和FS1492所擴增的16Sr DNA的序列 （Accession No.KP168436和KP168437）分別與GenBank中的序列進行比對，結果與溫和氣單胞菌同源性均為100%，進一步鑒定此2株菌為溫和氣單胞菌。從圖1可以看出，F(xiàn)S1491和FS1492的16S rDNA序列與溫和氣單胞菌的16S rDNA序列自然聚類。

圖1 根據(jù)FS1491和FS1492的16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗 由表3可知，根據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準（CLSI-M100-S18）^[9]，分離菌對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氟沙星等抗生素高度敏感，對復方新諾明、頭孢唑林、新霉素中度敏感，對利福平與林可霉素耐藥。

3 討論

溫和氣單胞菌廣泛分布于養(yǎng)殖水體中，是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病病原之一。對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物而言，溫和氣單胞菌屬于條件病原菌，其主要致病因子為溶血素、腸毒素和細胞毒素等，在適宜條件下該菌即可大量繁殖而導致疾病暴發(fā)。溫和氣單胞菌感染的宿主較為廣泛，目前已引起多種魚類（如淡紅墨頭魚（Garra rufa）^[10]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）^[11]、河鱸（Perca fluviatilis Linnaeus）^[12]、黑鯽（Carassius carassius）^[13]、革胡子鯰（Clarias gariepinus）^[14]、斑點叉尾鮰（Ictalurus Punctatus） ^[15]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco） ^[16]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus） ^[17]等）的病害。該研究中從患病高體革鯻分離到溫和氣單胞菌，在國內(nèi)外尚屬首次。

表3 分離菌對17種抗生素的藥敏試驗結果

抗生素含量

μg/片抑菌圈直徑∥mmFS1491FS14912

敏感性

阿米卡星3020.020.0S

卡那霉素3021.021.0S

鏈霉素 ? 1017.017.0S

復方新諾明23.75/1.2513.012.5I

慶大霉素 ? 1020.020.0S

頭孢唑啉 ?3018.018.0I

四環(huán)素 ? ?3026.026.0S

頭孢拉定 3023.524.0S

利福平 ? ?510.010.0R

強力霉素 ?3025.025.0S

林可霉素 ? 29.59.0R

頭孢噻肟 ?3036.036.0S

左氟沙星 ?527.027.0S

諾氟沙星 ?1026.026.5S

多粘菌素B 30012.012.0S

新霉素 ? ?3018.018.0I

環(huán)丙沙星 ?528.028.0S

注：“S”為高度敏感，“I”為中度敏感，“R”為耐藥。

根據(jù)分離菌的形態(tài)學特征、生理生化特性的檢測結果，參考《伯杰細菌鑒定手冊》，鑒定2株致病菌均為溫和氣單胞菌。通過對擴增到的分離菌的16S rDNA序列進行分析，此2株菌與溫和氣單胞菌的同源性最高（100%）。用分離菌人工感染健康高體革鯻后，從死亡的魚體內(nèi)分離到了原感染細菌，證實此次分離到的2株溫和氣單胞菌即為該病的致病菌。FS1491和FS1492對高體革鯻半致死劑量分別為2.1×10⁵和8.5×10⁴ cfu/g，說明此2株菌對高體革鯻均具有較強的致病力^[18]。

盡管抗生素的使用會引發(fā)水產(chǎn)動物生理障礙及藥物殘留、環(huán)境污染、水體中有益菌群失調(diào)以及病原菌的耐藥性等問題，但合理有效使用抗生素仍是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細菌性疾病防治的主要方法。此次藥敏試驗結果表明，分離到的2株溫和氣單胞菌對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和左氟沙星的敏感性高，可為該病暴發(fā)時治療藥物的選擇提供參考。另外，此結果與童桂香等^[19]報道的黃沙鱉（Truogx sinensis）源溫和氣單胞菌菌株在對四環(huán)素和慶大霉素的敏感性、韓英等^[20]報道的黃河鯉（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）源溫和氣單胞菌菌株對卡那霉素的敏感性以及李槿年等^[21]報道的鰻源溫和氣單胞菌菌株對環(huán)丙沙星的敏感性均有差異，這可能與菌株來源于不同動物或養(yǎng)殖過程中長期使用某些藥物導致致病菌產(chǎn)生耐藥性有關。在防治溫和氣單胞菌引起的魚類疾病過程中，藥物的選用應以不同菌株的藥敏試驗結果為主要依據(jù)，避免因濫用藥物導致該菌產(chǎn)生耐藥性從而降低防治效果。

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? ?陳言峰等 高體革鯻溫和氣單胞菌的分離·鑒定及藥敏試驗

參考文獻

[1]

馬國紅，劉羽清，師吉華，等.高體革鯻幼魚肌肉營養(yǎng)成分分析[J].廣東海洋大學學報， 2009，29（1）：90-93.

[2] 葉旭紅，林先貴，王一明.養(yǎng)殖澳洲寶石魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及致病基因的檢測[J].淡水漁業(yè)，2010，40（1）：50-54.

[3] 黃木珍，黃維.寶石鱸無乳鏈球菌病的分離鑒定及防治方法[J].海洋與漁業(yè)，2013（12）：58-59.

[4] 邱軍強，楊先樂，李怡，等.高體革鯻鏈球菌出血性敗血癥病原與組織病理的初步研究[J].上海水產(chǎn)大學學報，2004，13（2）：115-120.

[5] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：76-77.

[6] 楊茂成.獸醫(yī)統(tǒng)計學[M].北京：中國展望出版社，1990.

[7] XIAO J F，WANG Q Y，LIU Q，et al.Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda from mariculture in China[J].Aquac Res，2009，40（1）：13-17.

[8] HOLT J G，KRIEGNR，SNEATH PHA，et al.Bergeys manual of determnative bacteriology （9th） [M].Baltimore ：Williams & Wilkins，1994：203-204.

[9] Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：Eighteenth Informational Supplement[S].Pennsylvania USA，2007：36-42.

[10] MAJTAN J，CERNY J，OFUKANA A，et al.Mortality of therapeutic fish Garra rufa caused by Aeromonas sobria[J].Asian Pac J Trop Biomed，2012，2（2）：85-87.

[11] LI Y，CAI S H.Identification and pathogenicity of Aeromonas sobria on tail-rot disease in juvenile tilapia Oreochromis niloticus[J].Curr Microbiol，2011，62（2）：623-627.

[12] WAHLI T，BURR S E，PUGOVKIN D，et al.Aeromonas sobria， a causative agent of disease in farmed perch，Perca fluviatilis L[J].J Fish Dis，2005，28（3）：141-150.

[13] FICHI G，CARDETIG，COCUMELLI C，et al.Detection of Cyprinid herpesvirus 2 in association with an Aeromonas sobria infection of Carassius carassius （L.），in Italy[J].J Fish Dis，2013，36（10）：823-830.

[14] 黃鈞，施金谷，黃艷華，等.革胡子鯰暴發(fā)性流行病病原茵的分離鑒定及藥敏試驗[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2012，28（6）：323-326.

[15] 蘇應兵，鄒桂偉，袁科平，等.斑點叉尾鲴暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè)，2006，36（5）：37-41.

[16] 黃鈞，溫華成，施金谷，等.黃顙魚體表潰瘍病病原菌分離鑒定及藥敏試驗[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（1）：107-112.

[17] 張曉君，邴旭文，姚東瑞，等.泥鰍潰瘍病及病原溫和氣單胞菌生物學及分子特征研究[J].水產(chǎn)科學，2010，29（12）：696-702.

[18] SANTOS Y，TORANZA A E，BARJA J L，et al.Virulence properties and enterotoxin production of Aeromonas strains isolated from fish[J].Infect Immun，1988，56：3285-3293.

[19] 童桂香，韋信賢，黎小正，等.黃沙鱉溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2010（12）：124-126.

[20] 韓英，劉敏，姜艷平.鯉魚出血病病原的研究和藥敏試驗[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，36（5）：593-597.

[21] 李槿年，魏梅芳.鰻爛尾病病原的分離與鑒定[J].水利漁業(yè)，2000，20（4）：39-40.