摘要 2009年，甲型H1N1流感在全球多個地方豬和人群中暴發(fā)，給人民群眾的生命健康帶來了巨大威脅，給經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定產(chǎn)生了嚴重影響。及時快速的診斷是有效控制疫情大規(guī)模暴發(fā)的最有效途徑之一。近幾年隨著現(xiàn)代分子生物學技術發(fā)展，豬流感診斷方法在快速、準確性方面有了很大提高。對H1N1豬流感概況及豬流感的診斷方法進行了綜述。

關鍵詞 甲型流感；H1N1；豬流感；診斷方法

中圖分類號 S85 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）05-127-02

基金項目 廣東省科技計劃社會發(fā)展項目（2010B080701024）；廣東省科技計劃特定任務項目（2011B060700075）；廣州市科技計劃項目（201222426）。

作者簡介 蔡春梅（1962- ），女，廣東揭西人，畜牧師，從事動物疫病防控研究。*通訊作者，獸醫(yī)師，從事動物疫病診斷和檢測。

收稿日期 20141225

2009年3月，發(fā)生在墨西哥的人感染豬流感疫情很快在多個國家發(fā)生。起初WHO將其稱為“人感染豬流感”，然后又將其更名為“甲型H1N1流感”[1]，由此引起人們對豬流感病的高度關注。它是一種新型呼吸道疾病，其病原是人流感病毒基因、禽流感病毒基因和豬流感病毒基因混合的重配株，其造成的疫情來勢兇猛，危害極大，引起世界各國的廣泛關注。

據(jù)報道，豬在“禽—豬—人”的種間傳播鏈中，充當禽、人、豬流感病毒重組和復制的“混合器”，扮演著流感病毒中間宿主及多重宿主的作用，豬流感在人和動物流感的病原學、生態(tài)學及流行病學中占有舉足輕重的地位。此外，流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機制不斷發(fā)生變異[1]。及時快速的診斷是有效控制疫情大規(guī)模暴發(fā)的最有效途徑之一。因此，豬流感（Swine influenza，SI）的診斷具有重要意義，但是在臨床上及時檢測還有一定難度，需要借助實驗室的檢測方法來進行診斷。豬流感的診斷方法研究經(jīng)過多年發(fā)展，已取得新進展。筆者結合一些新文獻報道，對H1Nl亞型豬流感的診斷方法進行了綜述。

1 豬流感概述

SI是由SIV引起的傳染性疾病。甲型流行性感冒病毒自1918年西班牙流感嚴重疫情以來，診斷與防控研究取得很好進展，已經(jīng)證實SI在人和動物流感的病原學、生態(tài)學及流行病學中占據(jù)重要地位。

1.1 豬流感（SI）是世界性分布的危害豬的傳染性呼吸道病

SI是一種由正粘病毒科豬流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）感染可引起的呼吸道傳染病。SIV可引起不同日齡、性別和品種豬發(fā)病，能引起種豬繁殖障礙、育肥豬增重減慢，也是豬產(chǎn)生免疫抑制的主要誘因。臨床以突發(fā)、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱、衰竭、迅速康復或死亡為特征，呈世界性分布和地方性流行。

血凝素（HA）抗原和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原，是劃分流感病毒亞型的依據(jù)。豬群中除了常見的經(jīng)典型H1N1、類禽型H1N1和類人型H3N2流感病毒引起的SI外，由重組病毒H1N2、H1N7、H3N6引起的SI也時有報道。目前，造成世界性流行的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2。其中，25%的全世界豬群曾受H1Nl型感染，比較普遍流行。在美國有30%的豬被H1N1感染過，在美國中北部豬的感染比例達51%。1998年，美國卡羅萊納洲、明尼蘇達洲、愛荷華洲和德克薩斯洲接種了H1N1SI疫苗的4個豬場暴發(fā)了嚴重的SI，令人對防控好豬流感產(chǎn)生懷疑。

豬流感在我國不少省市都有豬流感流行，主要亞型是H1N1和H3N2。2000～2003年，從我國東北、西北、華中、華東、華南及西南地區(qū)20個省、市、自治區(qū)豬群中分離到116株不同亞型SIV，其中45株為H3N2，25株為H1N1，2株為H1N2，8株為H9N2，2株為H5N1，說明在我國豬群中流行多種亞型，以H3N2、H1N1為主的流感發(fā)生流行風險大，其診斷與防控壓力很大。

1.2 豬流感與甲型H1Nl流感密切相關

回顧人類流感史，20世紀人流感的3次大流行都和SI密切相關，而1976年1月美國新澤西洲佛迪狄克斯5名新兵因感染豬源H1N1病毒、1人死于肺炎的事件則是SI人畜共患病史上的里程碑。

人類感染甲型H1Nl流感病毒后的早期癥狀與普通人流感相似，但部分患者病情可迅速發(fā)展，來勢兇猛，突然高熱，體溫超過39 ℃，可繼發(fā)多臟器功能損傷，甚至導致死亡。最新數(shù)據(jù)表明，確診病例的病死率為0.8%[1]。肺部體征常不明顯，部分患者可聞及濕噦音或有肺部實變體征。

因此，鑒于豬流感的世界性分布，而且與甲型H1Nl流感流行密切相關，流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機制不斷發(fā)生變異，采取科學、及時、準確的診斷方法用于臨床對控制疫情大規(guī)模暴發(fā)、流行具有重要意義。

2 流感診斷方法

2.1 傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)方法是指病毒分離方法和抗體檢測方法等。采集人畜的呼吸道樣品進行甲型H1Nl流感的分離，也可動態(tài)檢測雙份血清病毒特異性抗體水平呈4倍或以上升高[2]。病毒分離方法能分離到病毒，但分離病毒的時間較長，如雞胚接種需要2周左右時間，此外，病毒分離后還要用其他方法輔助進行鑒定，不適合大量樣本的快速檢測。血清抗體檢測方法亦不能在感染初期抗體未產(chǎn)生或者抗體滴度過低時進行檢測，而且可能要進行2次采血，費時費力，同樣也不適用于大規(guī)模樣品的快速檢測[2]。

2.2 分子生物學方法

2.2.1 RTPCR方法。

該方法是我國疾控中心于2009年公布的快速檢測方法，涉及4對引物：甲流M基因通用引物FluA、甲流H1N1亞型通用引物H1HA引物、人季節(jié)性流感病毒H1N1亞型通用引物HuH1HA引物、2009年甲流H1N1亞型流感病毒引物SWH1HA1引物。首先提取樣品的病毒RNA，應用RTPCR的方法將樣品中與引物互補的基因片段擴增后，用瓊脂糖凝膠將擴增產(chǎn)物分離。該方法可對疑似病例的呼吸道樣品進行檢測，篩選甲型H1N1病毒并排除季節(jié)H1N1流感病毒[3]。

2.2.2 多重RTPCR方法。

莫秋華等[4]建立了同時檢測A型流感病毒、B型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒的一步法多種RTPCR方法，該方法針對A型流感病毒的M基因、B型流感病毒的NS基因設計通用引物，針對新型甲型H1N1流感病毒的HA基因設計特異性引物。將3對引物加入同一個反應管中，采用一步法RTPCR的方法擴增目的片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。該方法操作簡單，成本低廉，特異性強，可對流感疑似病例在4～5 h內(nèi)獲得確診。齊海濤等[5]也建立了同時檢測H1N1和H3N2病毒的RTPCR方法。

2.2.3 實時熒光定量PCR方法。

實時熒光定量PCR方法是在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，與常規(guī)PCR相比具有靈敏度高、特異性強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優(yōu)勢。

TaqMan熒光探針PCR方法的工作原理為：PCR擴增時在加入1對引物的同時，加入1個特異性的探針，該探針為1個寡核苷酸，兩端分別標記1個報告熒光基團和1個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq DNA聚合酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增1條DNA鏈就有1個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。

通過下載暴發(fā)于墨西哥的高致病性豬流感病毒H1N1型基因組序列進行同源性分析，借助計算機輔助軟件結合手動設計特異性引物探針；篩選出特異性引物探針，進行靈敏度、穩(wěn)定性等試驗研究；優(yōu)化樣本RNA提取方法、優(yōu)化熒光PCR反應體系，建立試劑盒的質(zhì)控品；按照《體外生物診斷試劑注冊管理辦法》的要求進行中試，并進行應用驗證，具有操作簡便、易行且可快速、準確的得到檢測結果的優(yōu)點，可以大規(guī)模地應用各類標本的檢測和篩查，有利于豬流感病毒的早期診斷和排查。它具有成本低廉、操作簡便的優(yōu)點，在靈敏度和特異性上將優(yōu)于其他方法。

目前，國內(nèi)外已有多家實驗室建立了該種方法?？傮w而言，特異性及敏感性較好，可用于甲型H1N1病毒的檢測[6-10]。

2.2.4 多重實時熒光定量PCR方法。

在單一的實時熒光定量PCR方法基礎上，設計多對不同病毒的引物及探針，來實現(xiàn)多種病毒的集成檢測。Choi等設計了同時檢測甲型H1N1病毒、季節(jié)流行性病毒和H5亞型病毒的多重實時熒光定量PCR方法，檢測結果可行[11]。

2.2.5 RTSmartAmp法。

為更好地達到H1N1流感的快速檢測，近年來日本科研人員發(fā)明了RTSmartAmp方法，此方法包括反轉(zhuǎn)錄和等溫擴增2個步驟，且同時在一個管中進行，無需病毒RNA的提取及PCR反應。該方法的原理是使用激子控制的敏感雜交熒光標記引物來檢測甲型流感H1N1病毒的HA基因，可在40 min內(nèi)出現(xiàn)檢測結果，與季節(jié)性A（H1N1）、A型（H3N2）、B型（維多利亞）病毒無交叉反應[12]。

2.3 生物傳感器法

近年來，加拿大科研人員也嘗試開發(fā)一種便攜式的低成本儀器—生物傳感器法來檢測H1N1流感病毒，研究表明生物芯片傳感器能讓非醫(yī)務人員在1 h內(nèi)檢測出流感病毒，并且每次檢測僅需10加元。使用目前的技術這樣的檢測需要花費好幾百加元。通過一定的校準，研發(fā)的便攜式設備還能夠檢測出某些病原體抗體，從而用于診斷一些傳染性疾?。ㄈ鏢ARS、HIV及乙肝等）[13]。

3 小結與討論

豬流感的診斷方法研究經(jīng)過多年發(fā)展已取得新進展，從傳統(tǒng)的實驗室診斷方法發(fā)展為基因診斷方法，具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點，為流感的有效防控發(fā)揮重要作用。流感病毒依靠抗原漂移與抗原重組機制不斷發(fā)生變異，常常給人類帶來防控壓力，給養(yǎng)殖業(yè)造成重創(chuàng)。2009年發(fā)生的甲型H1N1流感以及2013年發(fā)生的新型H7N9禽流感就是很好的案例。2009年以來，各國研究人員開展各種有效的甲型H1N1流感病毒的檢測方法，也為2013年的新型H7N9禽流感的檢測及防控奠定了一定的科學基礎及技術支持。隨著

生物技術的高速發(fā)展，基因芯片技術、生物傳感器方法有望

進一步發(fā)展和成熟應用，必將更有利于豬流感的診斷與防控工作開展。

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責任編輯 陳玉敏 責任校對 李巖