王軍花 段廣勛

摘要：目的：建立益氣復(fù)脈膠囊中五味子醇甲含量的反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定方法。方法：采用Shimadzu VP-ODS （150 mm×4.6 mm， 5 μm）為色譜柱，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為甲醇-水（65∶35），檢測(cè)波長(zhǎng)為 250 nm，流速為 1.0 mL/min，柱溫為 30 ℃，測(cè)定其含量。結(jié)果：五味子醇甲濃度在 10.60～31.80 μg/mL 范圍內(nèi)，其直線回歸方程為 A=91 289 C+10 392（r=0.999 9），呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率為 100.06%。 結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便，分離效果與重現(xiàn)性較好，適用于益氣復(fù)脈膠囊中五味子醇甲的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：HPLC；益氣復(fù)脈膠囊；五味子醇甲；質(zhì)量控制

為控制益氣復(fù)脈膠囊的質(zhì)量指標(biāo)，筆者建立了益氣復(fù)脈膠囊中北五味子主要成分五味子醇甲的反相高效液相色譜法（RP-HPLC）含量測(cè)定方法，以有效控制該制劑的質(zhì)量，為新藥開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.儀器和試劑

1.1儀器

SPD-10Avp檢測(cè)器（日本島津）、LC-10ATvp高壓泵（日本島津）、工作站：N2010色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究院）、UV-1700型紫外分光光度計(jì)（日本島津）。

1.2試劑與用藥

乙醚、甲醇（色譜純）、超純水、五味子對(duì)照品（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110857-200405供含量測(cè)定用）。

益氣復(fù)脈膠囊：?？谄媪χ扑幱邢薰旧a(chǎn)。規(guī)格：每粒重0.37g，批號(hào)：120201。

2.方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取五味子醇甲對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成一定濃度的溶液。取上述溶液，以流動(dòng)相為空白，在200nm～400nm范圍內(nèi)掃描，試驗(yàn)結(jié)果表明五味子醇甲在250nm處附近有最大吸收。同時(shí)，參考中國(guó)藥典2005年版一部五味子藥材標(biāo)準(zhǔn)中五味子醇甲含量測(cè)定的檢測(cè)方法，擬選用250nm作為本品檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相1：甲醇-水=73：27；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。色譜柱為Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本島津），進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果五味子醇甲色譜峰的保留時(shí)間為4.399min，與相鄰雜峰的分離度為1.177〈1.5，拖尾因子為1.050，理論塔板數(shù)為3709.8>2500；試驗(yàn)結(jié)果表明色譜條件不能滿足含量測(cè)定的要求，因此暫不選用該流動(dòng)相體系。

流動(dòng)相2：甲醇-水=65：35；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。色譜柱為Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本島津），進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果五味子醇甲色譜峰的保留時(shí)間為6.886min，分離度為5.278，拖尾因子為0.994，理論塔板數(shù)為3001.4>2500；試驗(yàn)結(jié)果表明該色譜條件可滿足含量測(cè)定的要求，因此，決定選用該流動(dòng)相體系。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本島津）為色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水=65：35；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)應(yīng)不低于2500，五味子醇甲峰與各其他成分峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.3溶劑空白試驗(yàn)

取甲醇20ul注入液相色譜儀。試驗(yàn)結(jié)果表明溶劑對(duì)本品含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.4陰性樣品試驗(yàn)

按處方工藝自制成不含五味子藥材的陰性樣品，同含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備成陰性樣品溶液。取20ul注入液相色譜儀。試驗(yàn)結(jié)果表明陰性樣品溶液對(duì)本品含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.5線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取于60℃真空干燥至恒重的五味子醇甲對(duì)照品5.3mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成母液。分別精密量取上述母液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。取上述溶液各20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表1.1，如下圖：

表1.1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)線性回歸分析，在10.60～31.80μg/ml范圍內(nèi)，直線方程Y=91289x+10392，r=0.9999，線性關(guān)系良好。

2.6進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的一份供試液，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.2：

表1.2 進(jìn)樣精密度測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，其RSD%為0.23%<2.0%，進(jìn)樣精密度能滿足本品的含量測(cè)定要求。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明：其RSD%為1.61為<2.0%，本法測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好，符合含量測(cè)定的要求。

2.8溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的一份供試液，分別于0、2、4、6、8、12h取樣20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，其RSD%為0.17%< 2.0%，說(shuō)明樣品室溫條件下放置12h，溶液穩(wěn)定。

2.9準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取已知含量為0.638 mg/g的本品6份，每份約0.4g，分別置25ml容量瓶中，分別加入五味子醇甲對(duì)照品溶液 （0.053mg/ml） 5ml，按擬定含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液處理方法處理，所得溶液作為供試品溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定回收率。本品回收率為100.06%，其RSD%為1.16%<2.0%試驗(yàn)結(jié)果表明本法準(zhǔn)確度較好，符合含量測(cè)定的要求。

2.10含量測(cè)定方法的確定

2.10.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水=65：35為流動(dòng)相；Shimadzu VP-ODS （150×4.6mm）（日本島津）為色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)應(yīng)不低于2500[7]。

2.10.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取五味子醇甲對(duì)照品5.0mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述溶液5ml至25ml量瓶中，用甲醇定容，即可。（每1ml溶液中含五味子醇甲20.00μg）。

2.10.3供試品溶液的制備

取重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，精密稱定約0.8g，置25ml量瓶中，加水約20ml，超聲處理使完全溶散，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液10ml，置分液漏斗中，用乙醚提取5次，每次15ml，合并醚液，用水洗滌2次，每次10ml，水洗滌液再用乙醚10ml回提一次，合并醚液，60℃～80℃減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，并分次轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.10.4測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.10.5含量測(cè)定結(jié)果

精密稱取樣品，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)下表1.6。

表1.6 五味子醇甲含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3討論和結(jié)論

益氣復(fù)脈膠囊是由紅參、麥冬、北五味子3味常用中藥組成的，是臨床治療冠心病的一種治療或輔助治療的有效藥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥理作用研究表明[2]：本處方中人參能改善心肌的代謝，增加心肌能量?jī)?chǔ)備，促進(jìn)DNA和RNA的合成，提高機(jī)體耐缺氧能力，從而增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張外周血管。特別對(duì)衰竭或中毒的心臟作用更為明顯。并且紅參能夠提高血漿cAMP值，抑制血小板聚集，降低血漿中纖維蛋白原，清除微血栓，起到改善微循環(huán)的作用。人參還可抑制Na+-K+-ATP酶的活性，影響Na+-K+和Na+-Ca2+的交換，使Ca2+內(nèi)流增加，從而增加心肌收縮力，降低血管阻力，還可清除自由基，增加心肌抗缺氧能力，并兼有抗心律失常作用，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)免疫功能的反應(yīng)。麥冬可穩(wěn)定細(xì)胞膜，能夠提高機(jī)體的耐缺氧能力；擴(kuò)張周圍血管，減輕心臟負(fù)荷，具有正性肌力的作用。五味子能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種刺激的非特異性抵抗能力，三藥協(xié)同應(yīng)用具有擴(kuò)血管，增強(qiáng)冠脈血流量和心肌營(yíng)養(yǎng)血流量，強(qiáng)心，改善心肌組織代謝，促進(jìn)損傷心肌功能恢復(fù)的作用，可以從根本上改善心肌功能。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)[3]，益氣復(fù)脈膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性休克有保護(hù)、強(qiáng)心、升壓作用；并能改善微循環(huán)，提高心肌耐缺氧功能。

3.1討論

3.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，是根據(jù)紫外測(cè)定。在250nm處，五味子醇甲具有最大吸收峰，選擇此處波長(zhǎng)，所得結(jié)果最明顯，結(jié)果容易判斷。

3.1.2流動(dòng)相的選擇

本文在選擇流動(dòng)相方面對(duì)兩種流動(dòng)相進(jìn)行了嘗試。其中流動(dòng)相1：甲醇-水（73：27），檢測(cè)的結(jié)果中保留時(shí)間、分離度、拖尾因子和理論塔板數(shù)等不滿足含量測(cè)定的要求，故不能使用流動(dòng)相1；而流動(dòng)相2所檢測(cè)的結(jié)果可滿足含量測(cè)定要求，因此，決定選用該流動(dòng)相體系。

3.2結(jié)論

經(jīng)過(guò)線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度等試驗(yàn)，證明HPLC法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，是測(cè)定益氣復(fù)脈膠囊中北五味子的五味子醇甲的含量的理想方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊曉敏. 冠心病心絞痛中醫(yī)藥治療進(jìn)展. 臨床合理用藥，2013；6（8）：1

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[3] 劉小娟，蘇丹，路秀云，等. 生脈膠囊的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，1010；19（19）：2468