顏炳柱 王曉韌 許磊 朱安超 楊寶山 劉冰熔

·論 著·

一氧化碳釋放分子-2對小鼠急性肝功能衰竭保護作用的實驗研究

顏炳柱 王曉韌 許磊 朱安超 楊寶山 劉冰熔

目的 探討一氧化碳釋放分子-2對小鼠急性肝功能衰竭（ALF）的保護作用及機制。方法 雄性C57BL/6小鼠30只隨機分為對照組、模型組和保護組，每組10只。通過一次性腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖（LPS/D-GalN）構建小鼠ALF的動物模型，CORM-2于造模前30min行尾靜脈注射，造模后6h分別留取血清、肝組織標本。生化分析儀檢測血清中ALT、AST水平，HE觀察肝臟病理改變，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中TNF-α和IL-6的水平，反轉錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測肝組織中TNF-α和IL-6mRNA的表達。結果 保護組小鼠血清ALT［（1274.60±157.24）U/L比（3499.00±136.19）U/L］和AST［（1151.50±244.58）U/L比（4079.50±481.11）U/L］水平均明顯低于模型組（均t1=33.81，t2=17.16，P＜0.05）；與模型組比較，保護組肝組織炎性細胞浸潤明顯減少，肝細胞壞死程度明顯減輕［（0.14±0.05）比（0.37±0.05），t=10.29，P＜0.05］；保護組小鼠血清和肝組織中TNF-α［（139.60±28.39）pg/mL比（447.34±128.17）pg/mL、（0.31±0.03）比（0.69±0.05）］和IL-6［（215.21±85.16）pg/mL比（1461.58±244.90）pg/mL、（0.33±0.03）比（0.72±0.05）］表達水平明顯低于模型組（均t1=7.41，t2=20.61，t3=15.20，t4=21.15，P＜0.05）。結論

急性肝衰竭；一氧化碳釋放分子-2；炎癥；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種因素引起的嚴重肝臟損害，具有較高的病死率，其發(fā)病機制尚未完全闡明，也缺乏有效的藥物治療［1-2］。因此，探討對ALF的新的治療措施具有重要的研究價值和臨床意義。研究證實，CO 作為機體內一種重要的細胞信使分子，具有極其重要的生物學功能，如抗炎、抗凋亡和細胞保護作用［3］。一氧化碳釋放分子-2（tricarbonyldichlororuthenium II dimmer，CORM-2）是近年來新合成的一種CO復合物，經適當溶劑溶解后能夠提供外源性CO分子，較CO氣體而言，其濃度相對容易控制并且又能夠使碳氧血紅蛋白保持在較低水平［4］。本研究采用脂多糖（LPS）和D-氨基半乳糖（D-GalN）構建急性肝衰竭動物模型，并給予CORM-2進行預保護，旨在探討其可能的作用機制。

資料和方法

一、實驗動物與材料

（一）動物 健康雄性C57BL/6小鼠，8～10周齡，體質量20～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供（動物許可證號：SCXK京2012-0001），清潔級飼養(yǎng)，實驗前12 h開始禁食。

（二）試劑和儀器CORM-2、LPS和 D-Gal N購于美國Sigma公司；二甲基亞楓（DMSO）購于Sigma公司；二氨基聯苯胺染色試劑盒（DAB）購于武漢博士德公司；TNF-α和IL-6ELISA檢測試劑盒為BG公司；Taq酶、RT-PCR試劑盒為美國Promega公司產品。PCR擴增儀（Gene Amp PCR System 9700，美國），全自動生化分析儀（Dimension○REXLTMwith LM，SIEMENS）。

二、實驗方法

（一）動物模型與分組將30只小鼠按照隨機原則分為對照組、模型組和保護組，每組10只。模型組和保護組一次性腹腔注射LPS（100μg/kg）和D-GalN（800mg/kg），保護組于造模前30min予以CORM-2（8mg/kg）尾靜脈注射，而模型組、對照組分別注射同等體積0.9％氯化鈉溶液作為對照，各組分別于給藥后6h采集血清和肝組織標本。

（二）肝功能檢測小鼠去眼球后靜脈采血，靜止30min，3500r/min離心（r=8cm）15min后取上清液；應用全自動生化分析儀分析ALT和AST水平，判斷肝臟功能改變情況。

（三）肝組織學檢測采血取樣后迅速斷頸處死小鼠，無菌取肝臟組織，4％多聚甲醛液固定，石臘包埋、切片，5μm厚，按試劑盒說明書操作，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變。肝臟組織病理學評分按照以往文獻進行［5］。

（四）血清TNF-α和IL-6測定收集各組小鼠血清，應用肝素抗凝后，室溫靜置30min，離心，取上清液，-20℃保存，具體按ELISA試劑盒說明書操作。

（五）肝組織中TNF-α和IL-6mRNA檢測取肝臟組織100mg，應用Trizol試劑盒參照說明提取總RNA，用紫外分光光度法測定所提取總RNA含量，各標本總RNA經定量后，取1μg反轉錄成cDNA，反應體系20μL，42℃15min，95℃5min，4℃5min。取cDNA1.5μL進行擴增PCR，反應體系25μL，反應條件均為：94℃2min；96℃15s，62℃20s，70℃1min，35個循環(huán)；70℃5min。采用Primer5.0設計軟件設計引物，由上海生工生物工程公司合成引物，具體見表1。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外線分析儀下觀察、攝片用Quantity-One4.31軟件進行條帶掃描半定量分析，計算基因相對表達量，目的基因相對表達量=目的基因條帶密度/GAPDH基因條帶密度。

表1 引物序列

三、統計學處理

使用SPSS13.0統計軟件進行統計處理，計量資料采用均數±標準差（x-±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，顯著性檢驗水準a=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、CORM-2對血清轉氨酶的影響

與正常組比較，模型組血清ALT和AST水平明顯升高；給予CORM-2干預后，ALT和AST水平明顯降低，差異有統計學意義（t1=33.81，t2=17.16，P＜0.05），見表2。

二、病理學改變

正常組：肝組織染色均勻，肝小葉結構清晰，細胞排列規(guī)則，細胞核形態(tài)正常，未見炎性細胞浸潤及凋亡和壞死現象。模型組：可見肝組織呈灶狀或片狀壞死，肝細胞明顯水腫和疏松化，肝竇內充血、擴張明顯，匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤。保護組：肝臟組織病變較輕，肝細胞壞死面積較少、呈散在碎片狀，壞死區(qū)可見少量炎性細胞浸潤。肝臟組織病理學評分比較，模型組與保護組差異有顯著統計學意義（t=10.29，P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 各組轉氨酶、病理學評分比較（-x±s）

三、TNF-α和IL-6血清水平變化

與正常組比較，模型組血清TNF-α和IL-6水平明顯升高；給予CORM-2干預后，TNF-α和IL-6水平明顯降低，差異有統計學意義（t1=7.41，t2=20.61，P＜0.05），見表3。

四、肝組織TNF-α和IL-6mRNA表達

正常小鼠肝組織表達極少量的TNF-α和IL-6mRNA；模型組表達量明顯增高；保護組給予CORM-2干預后，TNF-α和IL-6mRNA的表達量明顯下調，差異有統計學意義（t3=15.20，t4=21.15，P＜0.05）。見圖2，表3。

圖1 各組小鼠肝組織病理改變（HE染色，×200）

表3 各組血清和肝組織中TNF-α和IL-6表達水平的比較（-x±s）

圖2 各組小鼠肝組織TNF-α和IL-6表達

討論

ALF的發(fā)病機制極其復雜，目前治療措施尚未能完全阻止肝衰竭的進展，因此探索肝衰竭的發(fā)病機制及防治措施，具有重要的意義及廣闊的應用前景。研究證實TNF-α，IL-6等炎性細胞因子的級聯式釋放是ALF發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，不僅與肝細胞損傷密切相關，而且可直接反應肝臟炎性損傷程度［6-7］。因此，抑制TNF-α、IL-6促炎細胞因子的釋放可能成為臨床救治ALF的策略［8-9］。

CO作為機體內重要的氣體信號分子，以往研究重點多集中在其毒理方面，但越來越多的研究者發(fā)現CO還具有抗炎、抗凋亡、擴張血管等多種生物學功能［10-12］。而外源性CO干預小鼠急性肝功能衰竭的研究目前較少，主要是因為外源性CO的動物實驗其操作難度大，濃度不宜控制，且容易發(fā)生中毒，實際應用中受到了限制。CORM作為一種新合成的新型金屬羰基化合物，經適當溶劑溶解后可在機體內緩慢、持續(xù)、可控地釋放CO，并能夠模擬內源性CO在體內產生的病理生理過程［13］。其中CORM-2是目前被用于動物實驗最多的一類CO釋放分子，溶于DMSO時能夠釋放CO，而且不升高動物體內碳氧血紅蛋白濃度，不致使動物發(fā)生CO中毒，受到越來越多研究者的關注。在多種動物模型中，研究證實CORM-2能夠釋放CO并且具有保護肝臟、肺臟、腎臟、神經系統等重要器官的作用［14-17］。

本研究表明，給予LPS/D-GalN后小鼠ALT、AST水平明顯升高，而CORM-2干預后能夠極大地降低轉氨酶水平。此外，對肝組織學的觀察發(fā)現CORM-2顯著抑制了LPS/D-GalN誘導ALF肝組織內的炎性細胞浸潤、出血和壞死，這說明CORM-2有助于減輕肝細胞的損傷程度。CORM-2不僅抑制血清中TNF-α和IL-6水平，而且也抑制肝組織中TNF-α和IL-6的表達，提示CORM-2能夠抑制促炎細胞因子的釋放，從而減輕肝細胞的損傷。

綜上所述，CORM-2對LPS/D-GalN誘導小鼠ALF進行干預，能夠改善ALF時肝損傷程度，對小鼠ALF具有一定的保護作用，其機制可能與CORM-2減輕肝臟炎性反應有關。

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An experimental study in protective effect of CORM-2 on acute liver failure in mice

YAN Bing-zhu，WANG Xiaoren，XV Lei，ZHU An-chao，YANG Bao-shan，LIU Bing-rong.Department of Infectious Diseases，the Second Clinical Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

Objective To investigate the protective effect and mechanisms of carbon monoxide releasing molecule （CORM-2）on acute liver failure（ALF）in mice.Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups：control，model and protected group.The ALF animal models were induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide/D-galactosamine（LPS/D-GalN）.CORM-2 was administered via tail vein 30 minutes before LPS/D-GalN treatment.All serum samples and liver specimens were collected for detection in 6 hours after the administration of LPS/DGal N.The serumLevels of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）were measured by automatic biochemical analyzer.The liver pathologic changes were observed by light microscopy using hematoxylin and eosin （HE）staining.The serumLevels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）were measured by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of TNF-αand IL-6 mRNA in the liver tissues were measured by reverse transcript polymerase chain reaction（RT-PCR）in each group.Results The serumLevels of ALT ［（1274.60± 157.24）U/L vs（3499.00±136.19）U/L］and AST［（1151.50±244.58）U/L vs（4079.50±481.11）U/L］in protected group were significantly lower than those in model group（t1=33.81，t2=17.16 both P＜0.05）.Massive inflammatory cells infiltration and hepatocyte necrosis were widely spread in model group，while liver injuries were obviously relieved in protected group［（0.14±0.05）vs（0.37±0.05），t=10.29，P＜0.05］.The serumLevels of TNF-α［（139.60±28.39）pg/mL vs（447.34±128.17）pg/mL］and IL-6［（215.21±85.16）pg/mL vs（1461.58±244.90）pg/mL］in protected group were significantly reduced compared with model group（t1=7.41，t2=20.61 both P＜0.05）.TNF-αm RNA［（0.31±0.03）vs（0.69±0.05）］and IL-6 mRNA ［（0.33±0.03）vs（0.72±0.05）］measured by RT-PCR in live tissues of protected group were also significantly lower than that in model group（both P＜0.05）.Conclusion CORM-2 could remarkably inhibit the inflammatory activity and attenuate liver injury，mechanism of which might be related to inhibiting the release of proinflammatory cytokines TNF-αand IL-6.

Acute liver failure；CORM-2；Inflammation；Tumor necrosis factor-α；Interleukin-6

2015-02-06）

（本文編輯：賴榮陶）

黑龍江省教育廳科學技術研究資助項目（12531294）

150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科（顏炳柱，王曉韌，楊寶山），醫(yī)務部（許磊），消化內科（劉冰熔）；哈爾濱市第一醫(yī)院病理科（朱安超）

劉冰熔，Email：liubingrong@ medmail.com.cn

CORM-2能夠抑制小鼠ALF時的炎性反應，減輕肝臟病理損傷，其機制可能與抑制促炎細胞因子TNF-α和IL-6的釋放有關。